Name: detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

Forfatterne har ingen takk.

Menneskelige matriser ble kjøpt fra kommersielle kilder med godkjenning fra deres institusjonelle Review Board (IRB), men behandles som potensielt. Kontroller at laboratoriemiljø brukes opprettholder en kultur for sikkerhet12.
1. før du starter analysen
<ol><li>Forberede ERT-konjugerte streptavidin magnetiske perler i henhold til produsentens instruksjoner13.</li>
	<li>
Forberede kvalitetskontroll prøver (QCs): spike et positivt kontroll antistoff (PC) (f.eksen NAb) i artsspesifikke matrix (f.eks, gruppert CSF eller serum). Merk: FDA og EMA anbefaler forbereder en høy og en lav QC analysen validering og rutine testing1,14.<ol>
<li>For eksempel for å få en QC på 10 µg/mL, legge 10 µL av 1 mg/mL lager positiv kontroll i 990 µL av relevante matrix (f.eksCSF) for et totalt volum på 1000 µL.</li>
		<li>Aliquot QC prøvene i et volum som er egnet for en enkelt bruker (f.eks50 µL) og fryse dele på-60 til-80 ° C1.</li>
		<li>Aliquot et kutt-punkt-kontroll (CC), artsspesifikke matrise ikke behandles med test artikkelen (f.eks, gruppert CSF eller serum) for en enkelt bruker (f.eks50 µL) og fryse dele på-60 til-80 ° C1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utføre en bøyning reaksjon mellom fluorophore og ERTER med en protein-merking kit i henhold til produsentens protokollen15. Aliquot prøven i et volum som er egnet for en enkelt bruker (f.eks50 µL) og fryse dele på-60 til-80 ° C.</li>
</ol>2. dag 1: Cellen Plating og prøve forberedelse
<ol><li>
Cellen plate forberedelse
	<ol>
<li>Bruk vev kultur hette og opprettholde en steril miljø for følgende. Spray hvert objekt som plasseres i panseret med 70% etanol og opprettholde et rent miljø16,17,18.</li>
		<li>Varm celle vekst medium (f.eksRPMI-1640 med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin-streptomycin) i et vann eller perle bad 37 ° C19.</li>
		<li>Telle den menneskelige T-lymfocytter Jurkat celler og plate 100 µL per brønn på 7.5 x 105 celler/mL i en 96-brønns runde-bunn celle kultur plate passer for bruk på en flyt cytometer utstyrt med en plate loader.<ol>
<li>For eksempel bruke en hemocytometer eller en automatisert celle teller telle celler20,21.</li>
			<li>Sikre at cellene har minst 70% levedyktighet før du fortsetter med eksperimentet (f.eksvurdere levedyktigheten med trypan blå flekker)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inkuber cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og 95% fuktighet over natten for 14-20 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Screening eksempel forberedelse
	<ol>
<li>Fortynne emnet eller analysen kontroll prøver ved serum-frie medier (f.eksRPMI-1640). I eksempel metoden her fortynne prøver 1:2.5 i RPMI-1640 ved å legge til 60 µL av utvalget 90 µL av serum-frie medier. (f.eks8-stripen rør). Fortsett med trinn 3.1 analysen fremgangsmåten å forberede en fluorophore-merket ERT. Merk: Fortynning av 1:2.5 identifiserte eksperimentelt og er optimal for metoden presenteres her. Optimal eksempel fortynninger bør fastsettes for hver metode som er utviklet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bekreftende perle og prøve forberedelse
	<ol>
<li>Beregne antall ERT-konjugerte perler nødvendig for bekreftende prøver.<ol>
<li>For eksempel for 10 prøver, bruke 10 prøver x 100 µL av ERT-konjugerte perler per eksempel + 30% ekstra for å kompensere for tap under vask trinn = 1300 µL av ERT-konjugerte perler.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex perlene grundig. Legge til beregnede antall perler slik 15 mL koniske for vask.</li>
		<li>Vask ERT-konjugerte magnetiske perler ved å legge til 1300 µL kopling bufferen eller som foreslått av produsenten (f.eksmed fosfat-bufret saltvann med 0,1% polysorbat 20) fremgangsmåten under13.</li>
		<li>Vortex tube grundig. Sett røret i en magnetisk tube rack for 2 min. Uten å forstyrre perler, nøye Sug opp og kast nedbryting. Merk: Løsningen vil slå fra mørk brun å fjerne når perler er trukket til magneten.</li>
		<li>Resuspend perler med 1300 µL av bufferen. Gjenta vask for totalt fire vasker.</li>
		<li>Etter siste vask, avbryte perlene 1300 µL av buffer (tidligere beregnet i trinn 2.3.1.1). Legg 100 µL per godt en 96-brønnen, hvite, runde-bunn, uforpliktende polypropylen plate ifølge plate kart (f.eks, en bekreftende per prøve eller QC, vil prøven bli delt opp i like når inkubert med fluorophore-merket ERT).</li>
		<li>Plasser platen på en 96-brønns side-skirted magnet og la perler å danne pellets. Nøye Sug opp klare nedbryting og kaste den. Merk: Løsningen vil slå fra mørk brun til klart etter ca 1-2 min på side-skirted magneten. Innhentet perlene kalles "tørr" perler.</li>
		<li>Hvis utvalgene vist positive og blir bekreftet, Legg 100 µL av hvert utvalg med og uten ERT-konjugerte perler inn i det passende/tilordnet også. Seal platen med en plastfolie og rist den for minst 60 min på en roterende shaker på ca 800 rpm ved romtemperatur (RT). Merk: Tidligere utarbeidet og frosset positive og negative QCs og CC bør inkluderes på hver plate.</li>
		<li>Etter inkubasjon, plassere bekreftende platen på 96-brønns side-skirted magneten og tillate perler å danne pellets.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Titer fortynning serien forberedelse
	<ol>
<li>Å forberede en titer serie, serielt fortynne prøven i grupperte matrix et tilstrekkelig antall ganger å krysse den forhåndsbestemte titer kuttet punkt1.</li>
		<li>For eksempel bland 30 µL av utvalget til 60 µL av grupperte matrise i en 1:3 fortynning serie totalt 8 fortynninger (f.eks, 8-stripen rør). Fortsett med trinn 3.1 analysen fremgangsmåten å forberede fluorophore-merket ERT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dag 1: Analysen prosedyre
<ol><li>
Forbered den fluorophore-merket ERT i serum-free medium (f.eks, 60 µL per godt, eller ca 6 mL/plate).
	<ol>
<li>For eksempel, å forberede 10 mL 1 µg/mL fluorophore-merket ERT, legge 10 µL av lager 1 mg/mL fluorophore-merket ERTER til 9.99 mL av serum-frie medier (f.eksRPMI-1640).</li>
	</ol>
</li>
	<li>I en ny inkubasjonstiden plate (f.eks, 96-brønnen, hvite, runde bunn, uforpliktende polypropylen plate), Legg forberedt prøvene fra trinn 2.2, 2.3, eller 2.4 og en fluorophore-merket ERT i en 1:1 blanding i like brønner (f.eksoverføring 60 µL av hver forberedt eksempel og legge 60 µL av fluorophore-merket ERT per brønn). Merk: En eksempel eksperimentet plate kartet er gitt i figur 1.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> Figur 1: eksempel på et eksperiment plate oppsett. Prøver og en fluorophore-merket ERT ble inkubert natten på 2-8 ° C. Kontroller som høy kvalitet kontroll (HQC), lav kvalitet kontroll (LQC) og negative kvalitetskontroll (NQC) ble vist og bekreftet motsatte hjørner av plate å vurdere plate ensartethet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<ol start="3"><li>Bland prøver og fluorophore-merket ERT ved pipettering opp og ned flere ganger med en flerkanals pipette. Pakk platene i folien og ruge dem over natten ved 2-8 ° C 14-20 h.</li>
</ol>4. dag 2: Legge til forberedt prøvene i cellene
<ol><li>Fjerne eksempler inkubasjon plate(s) fra inkubering 2-8 ° c og varme platene ved å plassere dem i en perle bad på 37 ° C i 10-15 min.</li>
	<li>Fjerne celler fra CO2 inkubator. Utfør en visuell kontroll av belagt cellene med en invertert mikroskopet slik at cellene vises sunn og jevnt fordelt over brønner17,19.</li>
	<li>Legge til 100 µL av tidligere blandet prøver og fluorophore-merket ERT en celle plate ifølge eksperimentelle plate kartet.</li>
	<li>Plass celle platen med ekstra prøvene tilbake i CO2 inkubator på 37 ° C. Inkuber platen for 3t og ± 15 min. Merk: Denne gangen ble etablert i laboratoriet som optimalt for signal-til-støy respons i analysen.</li>
	<li>Sentrifuge celle platen i 6 min 320 x g i en tabletop sentrifuge på 14-18 ° C. Bekrefte tilstedeværelse av cellen pellets på bunnen av platen.</li>
	<li>Holde platen i 30-45° vinkel. Fjern forsiktig nedbryting fra hver brønn uten å forstyrre det cellen pellet. Legge til 200 µL av 1 x DPBS på cellen pellet i hver brønn til resuspend cellene.</li>
	<li>Gjenta cellen vaske trinnene for totalt 3 vasker. Fortsett rett til trinn 5 for den cellen levedyktighet flekker.</li>
</ol>5. dag 2: Celle levedyktighet flekker
<ol><li>Bruker en flerkanals pipette, tilsett 100 µL av en fungerende løsning av 1 x Live/Dead flekken hver brønn, valgt for et utslipp bølgelengde forskjellig fra fluorophore-merket ERT og utarbeidet etter produsentens instruksjoner22.</li>
	<li>Inkuber platen i 15 min på RT i mørket. Sentrifuge platen i 6 min 320 x g i en tabletop sentrifuge på 14-18 ° C.</li>
	<li>Fjern forsiktig nedbryting fra hver brønn uten å forstyrre det cellen pellet. Vask cellene 1 x med 1 x DPBS.</li>
</ol>6. dag 2: Feste cellene med 1% Paraformaldehyde
<ol><li>Bruker en flerkanals pipette, dispensere 100 µL av kjølt (på 2-8 ° C) 1% paraformaldehyde (PFA) i hver brønn.</li>
	<li>Forsegle platene og forsiktig puls vortex å blande. Pakk platen i folien og plassere det på 2 – 8 ° C i minst 10 min å tillate fiksering. Merk: Pass på å unngå spruting på plate segl.</li>
	<li>Legge til 50 µL av 1 x DPBS i hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette opp og ned før analysen.</li>
</ol>7. flowcytometri
<ol><li>Plasser platene på flyt cytometer med plate loader og kjøre dem.</li>
	<li>Kjøpe og registrere målt median fluorescens intensiteten (MFI) ved hjelp av flyt cytometri programvare (se Tabell for materiale). Merk: Se figur 2 som et eksempel for loader-innstillingene. Eksempel flow rate, prøve volum, blande volum, blande hastigheter og antall mikser er optimalisert for denne analysen. Disse kriteriene kan justeres ved hjelp av knappene "pilene opp" eller "ned" ved siden av tallene for hver kriterium, avhengig av flyt cytometri oppkjøpet programvare23.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> Figur 2: eksempel på flyt cytometer loader innstillingene. Innstillinger for oppstartslasting skal være optimalisert for hver analysen som er utviklet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<ol start="3"><li>Opprette en cytometer analyse/porter/tomter som vist i Figur 3. Merk: Gate etablering og programmet kan variere for hver flyt cytometri programvare23.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> Figur 3: Flow cytometri gating strategi. Jurkat celler var atskilt fra total hendelser og samlet inn av planlegger fremover-xy (FSC) vs side-xy (SSC) kanalene og tegne en gate rundt målgruppen. Singleter (enkeltceller) var separert fra doublets eller større celle samler bruker området FSC (FSC-A) og FSC høyde (FSC-H) kanaler. Levende celler ble valgt av gating på singlet celler negativ for en levedyktighet flekk. Median fluorescens intensiteten (MFI) ble målt i enkelt, bor Jurkat celler og tegnes som et histogram. MFI verdiene av celler med narkotika opptaket blokkert (f.eksHQC) og celler med kontroll mengder opptak vises (rød og blå, henholdsvis). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<ol start="4"><li>Utelukke døde celler fra analyse og registrere ca 10.000 hendelser23.</li>
</ol>8. analyse
<ol><li>Eksportere dataene (rå MFI) til analyseprogramvare (se Tabell for materiale). Merk: Avhengig av analysen nødvendig, følgende dataanalyse kan utføres ved hjelp av analyseprogramvare.</li>
	<li>Beregn gjennomsnittet MFI like brønner (QCs og prøver) og variasjonskoeffisienten (% CV) å vurdere spredning variasjon av duplikater fra middelverdien. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>For prøver og QCs som ble vist i analysen, beregne prosent signal hemming (% SI) i forhold til mener MFI av den for QCs gruppert matrisen CC. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Eventuelt kan du beregne utvinning forholdstallene (RRs) for bekreftet QCs og prøver i forhold til tilsvarende skjermverdier. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>CDER. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+design,+optimization,+and+qualification+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+responses+elicited+to+biological+therapeutics.">Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics.</a> Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+validation+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+immune+responses+elicited+against+biological+therapeutics.">Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).</li><li>Pedras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAb+me+well-+FDA+Regulatory+Perspectives+on+Neutralizing+Antibody+Assays.">NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays.</a> BEBPA Forum. , (2015).</li><li>Stovold, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAB+Assay+Development+and+Validation+Immunogencity+Workflow.">NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow.</a> Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).</li><li>Kromminga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , (2013).</li><li>Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+Fc+receptor+homologs+with+preferential+B+cell+expression.">Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).</li><li>Melton, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+neutralize+cellular+uptake+of+elosulfase+alfa+are+not+associated+with+reduced+efficacy+or+pharmacodynamic+effect+in+individuals+with+Morquio+A+syndrome.">Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome.</a> Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , (2012).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+pharmacological+comparison+of+enzyme+replacement+therapies+for+the+glycolipid+storage+disorder+Fabry+disease.">A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease.</a> Glycobiology. 13, 305-313 (2003).</li><li>Kirkegaard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapies+and+therapeutic+concepts+for+lysosomal+storage+diseases.">Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases.</a> Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).</li><li>Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm">https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm</a> (2012)</li><li>Invitrogen by ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DynabeadsTM M-270 Streptavidin. , (2015).</li><li>European Medicines Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , (2017).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular ProbesTM Alexa FluorTM 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Working+in+the+Hood.">An Introduction to Working in the Hood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Invitrogen and Gibco. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Basics Handbook. , (2010).</li><li>Coecke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+on+Good+Cell+Culture+Practice.">Guidance on Good Cell Culture Practice.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).</li><li>. Introduction to Cell Culture Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html</a> (2018)</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. Counting Cells with Bio-Rad&#39;s TC20(TM) Automated Cell Counter Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M">https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M</a> (2012)</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide LIVE / DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting Started with BD FACSDiva Software. , (2007).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).</li><li>Quirke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Flow+Cytometry:+A+Learning+Guide.">Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide.</a> Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).</li><li>. A guide to gating in flow cytometry Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html</a> (2016)</li><li>Minor, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , (2006).</li><li>Desilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Bioanalytical+Method+Validation+of+Ligand-binding+Assays+to+Support+Pharmacokinetic+Assessments+of+Macromolecules.">Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules.</a> Pharmaceutical Research. 20, (2003).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+and+non-cell-based+assay+platforms+for+the+detection+of+clinically+relevant+anti-drug+neutralizing+antibodies+for+immunogenicity+assessment+of+therapeutic+proteins.">Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+neutralizing+assay+for+antibodies+and+sera+against+hepatitis+E+virus.">A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Charles River. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow+Cytometric+Method+to+Assess+Neutralizing+Antibodies+to+AAV+Gene-Therapy+Vectors.">A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors.</a> Charles River Researcher. , (2015).</li><li>Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ELISA+protocol+to+improve+the+accuracy+and+reliability+of+serological+antibody+assays.">An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays.</a> MethodsX. 4, 153-165 (2017).</li><li>Iversen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+Assay+Validation.">HTS Assay Validation.</a> Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).</li><li>Long, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa+in+the+Treatment+of+Morquio+A+Syndrome:+Results+From+MOR-005,+a+Phase+III+Extension+Study.">Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study.</a> Clinical Therapeutics. 39, (2017).</li><li>Schweighardt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa,+an+Enzyme+Replacement+Therapy+in+Patients+with+Morquio+A+Syndrome:+Results+from+MOR-004,+a+Phase+III+Trial.">Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial.</a> Clinical Therapeutics. 37, (2015).</li><li>Mellman, I. R. A., Plutner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+and+Degradation+of+Macrophage+Fc+Receptors+Bound+to+Polyvalent+Immune+Complexes.">Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+the+therapeutic+enzymes:+considerations+for+testing,+prevention+and+treatment.">Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment.</a> Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).</li></ol>

Forfatterne er ansatte og aksjonærer BioMarin Pharmaceutical Inc.

Nøytraliserende antistoffer eller andre faktorer som hindrer ERT opptaket gjennom CI-M6PR har potensial til å påvirke ERT sikkerheten eller effekten1. Derfor er det viktig å vurdere NAbs i emnet prøver med en robust modell relevant for stoffets virkningsmekanismen. Vi har funnet at ytelsen til enkelte bioassay formater (f.eks, reseptoren dimerization, luciferase uttrykk, etc.) ikke align med helse myndighet anbefalinger for analysen presisjon, reproduserbarhet og følsomhet 29. i bioassay metoden beskrevet her Jurkat celler som uttrykker endogene CI-M6PR er ansatt overvåke NAbs gjelder for lysosomale ERT opptaket. Kombinert med en flyt cytometri avlesning, bruker denne analysen fysiologiske celle modell med passende analysen presisjon, følsomhet, reproduserbarhet og høy utvalg ytelse. NAb oppdagelsen med en flyt cytometri avlesning har også blitt brukt til andre indikasjoner. For eksempel har metoder blitt utviklet for å oppdage eksisterende antistoffer mot hepatitt E og adeno-assosiert virus (AAV)30,31.
Avgjørende skritt i protokollen inkludere velge en egnet fluorophore, omfatter en LQC at skjermer analysen følsomhet, sikre et tilstrekkelig nivå av cellen levedyktighet, og opprettholde streng overholdelse av inkubasjon tider. I eksemplet presenteres her fluorophores (f.eks, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 og CypHer 5e), konjugert til en lysosomale ERT, store variasjoner i resultatene. Alexa Fluor 647, som også var den smarteste fluorophore testet32, ble valgt for analysen videreutvikling. Det anbefales at flere fluorophores vurderes tidlig i utviklingen av analysen å gi den beste sensitivitet og dynamisk område. Analysen følsomhet under eksempelannonsene testing bør overvåkes ved å inkludere en LQC som er nært nok følsomhet grensen vil mislykkes i 1% av testing starter1. Sammen med HQC fungerer LQC også som et system egnet QC overvåke analysen drift over tid3. Optimal celle levedyktighet og ytelse oppnås ved forbereder en cellen bank av engangs dele og kvalifisering i ny cellen banker basert på sammenlignbare QC resultater3,18. Celle- og fluorophore-konjugerte drug-inkubering ganger er også sentralt i en konsekvent analysen ytelse siden narkotika opptak øker med tiden stoffet er ruges med celler. For å minimere daglige variasjon i stoffet opptak, kan eksempeldata normaliseres gruppert matrix kontroll smakebiter på hver plate (f.eks, kutt punkt kontroll eksemplene i metoden over). En annen viktig faktor i å produsere konsekvente data med denne metoden er å overvåke plate ensartethet og minimere mulige kanten. En innledende forsøket kan inkludere utfører analysen bruker en enkelt QC over hele platen, mens mer robust eksperimenter kan utføres under analysen validering (f.eks, presisjon og nøyaktighet)1. Dette demonstrerer viktigheten av platen kart oppsett33. Som vist i eksemplet plate kart, plassert kvalitetskontroll prøver på begge sider av platen skjermen en ensartethet som kan spores over tid med Levey-Jennings diagrammer34.
Mens denne analysen overvåker NAbs og andre faktorer som kan hemme lysosomale ERT opptak, kan flere eksperimenter utføres for å bekrefte en opptak hemming på grunn av antistoffer. Ett alternativ er å behandle prøver med protein A/G/L, som nonspecifically binder immunglobulin35. Hvis prøver fortsatt testen positiv etter protein A/finans utarming, kan en ikke-antistoff hemmende faktor være ansvarlig for sperring narkotika opptaket. Metoden beskrevet her ble utviklet for å måle antistoff-mediert opptak hemming, og positiv kontrollen og andre analysen parametere bør vurderes hvis en høy andel av emnet prøver med ikke-antistoff hemmende faktorer.
Analysen kan også være ytterligere preget for å demonstrere fluorophore-merket narkotika traffics riktig mobilnettet rommet basert på stoffets virkningsmekanismen. I eksemplet presenteres her forventes en ERT å binde CI-M6PR på cellens overflate og trafikk det til lysosome. Vi tidligere rapportert resultatene av flere eksperimenter som angir at nesten alle fluorescerende signalet observert i metoden resultatene fra fluorophore-merket ERT i lysosome8. Vi fant at fluorophore-merket ERT signalet ble eliminert etter behandling av celler med cytochalasin B, som forstyrrer internalisering gjennom hemming av utgangen omorganisering. Eksperimenter som slukket eksterne fluorophore med trypan blå eller redusert internalisering ved å plassere celler ved 4 ° C, angi også at ERT fluorophore-merket er raskt internalisert og lite fluorescens skyldes en ERT bundet på celleoverflaten. Lysosomale målretting ble bekreftet ved å visualisere den co lokaliseringen av pH-sensitive lysotracker farge med fluorophore-konjugerte stoffet med AC confocal mikroskopi. En spesifisitet for opptak gjennom CI-M6PR kan også verifiseres ved hjelp av eksogene M6P for å konkurrere med merket narkotika for reseptor bindende. Lignende eksperimenter skal utføres for å kontrollere opptak kinetics og mobilnettet lokalisering av fluorophore-konjugerte narkotika i andre analyser.
Denne cellen-basert analysen plattformen er brukt til å studere NAbs for terapeutisk stoffer som bruker CI-M6PR reseptor-mediert endocytose. Vi har nylig rapportert resultater denne analysen plattformen som viste ingen sammenheng mellom utviklingen av en NAb og narkotika effekt for elosulfase alfa36,37. For å validere analysen for klinisk prøve testing, parameterne, inkludert analysen følsomhet, presisjon, selektivitet, spesifisitet, narkotika toleranse, robusthet, og kutte poeng, bør vurderes i henhold til etablerte guidances3, 4. det også bemerkes for lysosomale ERTs, at NAbs kan utvikle til å forstyrre narkotika aktivitet gjennom bindende nær katalytisk enzym. Generelt vurdere vi overvåking denne typen NAb å ha lavere prioritet, fordi det harde syreholdig og proteolytisk miljøet i lysosome ikke er gunstig antistoff-ERT interaksjoner2,39,40. Det er imidlertid mulig at proteolytisk-resistente NAbs finnes og kan hemme den katalytiske delen av en narkotika-40. Denne analysen skjermer fluorophore-merket ERT opptak i lysosome, og en begrensning av analysen er manglende evne til å overvåke proteolytisk-resistente NAbs. Hvis denne typen NAb mistenkes basert på sikkerheten eller effekten data, bør en analyse som overvåker ERT bruk utviklet og brukes til å teste prøver.
Vurdering av immunogenisitet er viktig å forstå effekten av NAbs på stoffet sikkerhet og effekt. Identifikasjon av NAbs i stand til å hemme i vitro narkotika opptak via CI-M6PR gir en mulighet for å forstå NAb aktivitet i vivo. Metoden som presenteres her bruker en human celle linje som uttrykker CI-M6PR for å måle forstyrrelser av fluorophore-konjugerte lysosomale ERT mobilnettet opptak. Denne metoden er allerede brukt til å overvåke NAbs for flere ERTs skal behandle lysosomale lagring sykdommer. Denne analysen plattformen kan gjelde for andre metoder for å studere virkningene av NAbs på biologiske legemiddelselskap som krever en mobilnettet internalisering for sin rette funksjon.

Immunogenisitet vurdering er en viktig del av sikkerhet og effekt Overvåkingsprogram for biologiske terapeutiske produkter, inkludert ERTs. Pasienter kan utvikle en immunrespons som kan direkte påvirke narkotika sikkerhet og effekt farmakokinetiske/Farmakodynamiske profiler. Et delsett av disse ADA, kalt NAbs, kan hemme ERT effekt på to måter: gjennom hemming av ERT opptaket i målrettede cellen eller begrenser ERT katalytisk aktiviteten. Metoden som presenteres her er utviklet for å måle NAbs som forstyrrer ERT opptaket i celler. For å fullt overvåke effekten av den terapeutiske ERT, er kontinuerlig overvåking av NAbs avgjørende i Klargjørende alle mulige sammenhenger med kliniske utfall eller Farmakodynamiske effekter1.
Plattformer for å vurdere NAbs mot protein therapeutics inkluderer cellen-basert, enzymatisk aktivitet og ligand-bindende analyser1. Optimal analysen plattformen er valgt basert på en rekke kriterier: virkningsmekanismen av terapeutiske produktet, analysen plattform følsomhet, selektivitet, presisjon, og viktigst, dens evne til å etterligne hemmende effekten av NAbs i vivo . Ligand-bindende analyser kan være riktig i enkelte tilfeller (f.eksnår en aktuelle cellen linje ikke kan identifiseres eller hvis riktig følsomheten ikke kan oppnås i en cellebasert analysen). Men i 2016 utkastet FDA veiledning for bransje dokumentet og andre industri-akseptert utredninger, cellebasert NAb analyser er anbefalt fordi de kan bedre reflektere biologiske mekanismen av stoffet i vivo1,2 , 3.
De kritiske komponentene for å utvikle en flyt cytometri cellebasert NAb analysen omfatter en egnet cellen linje som svarer til stoffet stimulering, en surrogat positive-kontroll NAb som nøytraliserer ERT, en fluorophore-konjugerte ERT og test arten biologiske Matrix4,5,6. Linje celleutvalget er avhengig av ERT virkningsmekanismen og flere linjer skal vurderes under analysen utvikling3. I metoden beskrevet her, ble menneskelige Jurkat T celler valgt for deres endogene CI-M6PR uttrykk på celleoverflaten og mangel på antistoff fragment reseptorer (anleggene) som binder ukritisk regionen Fc i de fleste antistoffer7,8 . Under analysen utvikling er det viktig å etablere en negativ kontroll for validering studiene og pasienten prøven testing, som serum samlet fra personer som ikke har blitt behandlet med test artikkel1. Cellelinjer bør også tolerere relevante matriser fra ulike arter for kontinuitet over de nonclinical, kliniske og post markedsføring stadiene av narkotika utvikling1. En annen komponent er utvalget av analysens positiv kontroll. Kontrollen positiv for ERT celle opptaksanalyse ble valgt basert på dens evne til å binde terapeutisk og nøytralisere opptaket gjennom CI-M6PR9,1. Det er ofte vanskelig å få nyttig eller bærekraftig mengder nøytraliserende antisera fra menneskelig fag som en analysen kontroll, spesielt i sjeldne sykdommen pasientgrupper2. Alternativer inkluderer antisera fra hyper-vaksineres dyr eller affinitet-renset polyklonale eller monoklonale antistoffer piggete inn i analysen relevante matrise1. Mens du bruker en artsspesifikke matrise, er det mulig at hemmende faktorer enn antistoffer i matrisen kan hemme ERT opptaket. En annen komponent til analysen er fluorophore-konjugerte ERT. Valg av fluorophore for ERT Bøyning bør vurderes for hver ERT, basert på analysens behov for lysstyrke, pH stabilitet og potensielle spectral overlapping i andre kanaler på flyt-cytometer.
Analysen beskrevet her er et eksempel for å måle en NAb til en terapeutisk protein, for eksempel en ERT, som angir den celle via CI-M6PR. Flere ERTs, ment å behandle lysosomale lagring lidelser (LSDs), bruke denne veien for cellen opptak og lysosomale målretting, inkludert elosulfase alfa for Morquio A syndrom, cerliponase alfa for CLN2 Batten syndrom, agalsidase alfa for Fabrys sykdom, og alglucosidase alfa for Pompe sykdom10,11. Formålet med denne metoden er å måle den relative nivået av NAbs som forstyrrer narkotika bindende og internalisering via CI-M6PR. Dette utføres i lagdelt screening, bekreftende, og titer trinn3. Eksempler er først vist for NAb positivitet og deretter bekreftet positive i bekreftende trinn. Endelig, prøver som skjermen og bekrefte positive kan serielt fortynnes for å generere en antistoff titer1. Denne cellen-basert flyt cytometri narkotika opptaksanalyse gir en følsom og mechanistically relevante i vitro metoden av måler rusmiddelspesifikke NAbs som kan påvirke stoffets farmakologiske profil. Vi har tidligere godkjent metoden og testet klinisk prøver ved denne plattformen for narkotika elosulfase alfa8. Her beskriver vi detaljerte trinnvise protokollen som kan brukes på andre terapeutiske proteiner eller ERTs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

Administrasjon av enzymet erstatning terapi (ERTs) og andre biologiske terapier pasienter kan lokke fram en anti-narkotika immunrespons. Karakterisering av disse anti-narkotika-antistoffer (ADA), spesielt de som kan nøytralisere den biologiske aktiviteten av stoffet, kalt nøytraliserende antistoffer (NAbs), er avgjørende å forstå effekten av disse antistoffene på stoffets farmakologiske profil. Denne protokollen beskriver en cellebasert flyt cytometri metode for å finne faktorer som nøytraliserer mobilnettet opptaket av en representant lysosomale ERT i menneskelige matrise. Protokollen består av tre fremgangsmåter: screening og et bekreftende skritt titer analyser å merker, identifisere og etablere de relative nivået av nøytralisere antistoff titer i emnet eksempler.
I denne metoden prøver er først blandet med fluorophore-konjugerte ERT produktet, så inkubert med celler [f.eksmenneskelige T-lymfocytter (Jurkat celler)] som uttrykker en celle-overflate kasjon uavhengig mannose 6-fosfat reseptor (CI-M6PR), og til slutt, analysert med en flyt cytometer. Et utvalg uten NAbs vil resultere i opptaket av den fluorophore-konjugerte ERT produktet via CI-M6PR, mens, tilstedeværelse av NAbs vil binde til stoffet og forstyrre CI-M6PR bindingen og opptak. Hvor mye fluorophore-konjugerte ERT internalisert Jurkat cellene er målt ved flowcytometri og evaluert som prosent (%) signal hemming sammenlignet med svaret innhentet i nærvær av en representant stoffnaive matrise. I bekreftende trinn er prøvene pre inkubert med ERT-konjugerte magnetiske perler å utarme stoff-spesifikke faktorer som binder til stoffet (som NAbs) før en inkubasjon med celler. Prøver som skjermen og bekrefte positive for stoff-spesifikke NAbs i analysen er deretter serielt utvannet for å generere et antistoff titer. Semi kvantitative antistoff titers kan være korrelert med mål av narkotika sikkerhet og effekt.

På den første dagen av metoden, en frossen aliquot Jurkat celler var Tint og belagt og testprøvene ble utarbeidet. Figur 1 viser en eksempel plate kart. På den andre dagen, var prøvene blandet med Jurkat celler og ruges på 37 ° C i ca 3 h og 15 min. Cellene ble deretter vasket, fast med PFA og analysert på en flyt cytometer. Figur 2 viser eksempel flyt cytometer innstillinger.
Flowcytometri gating strategi var designet for å måle mengden av fluorophore-konjugerte stoffet i live enkelt Jurkat celler24 (Figur 3). Cellene ble skilt fra rusk ved å tegne en gate som utelukker mobilnettet rusk [vanligvis lav frem xy (FSC)] og døde celler [vanligvis høye siden punktdiagram (SSC)], forlater bare lever celler for analyse25. Enkeltceller ble deretter skilt fra cellen klynger ved å tegne en gate som utelukker høy FSC området og lav FSC høyde26. Cellene ble behandlet med en levedyktighet flekk som merket død eller usunn celler uten en intakt membran, og en ekstra gate ble opprettet for å utelate de døde celler22. MFI live enkelt cellene ble brukt for analyse av fluorophore-konjugerte ERT opptaket. Eksempel potensial screening analyseresultatene hemmet matrix spiked med en høy mengde surrogat anti-narkotika antistoff positiv kontroll [f.ekshøy kvalitet kontroll (HQC)] fluorophore-konjugerte ERT opptak, noe som resulterer i en lav MFI av ca 300 (Figur 3). Derimot celler inkubert med matrix i fravær av positive kontroll antistoffer bør ha en høyere MFI (MFI = 37,830 i Figur 3), demonstrere opptaket av fluorophore-konjugerte ERT.
Nøytralisere positiv kontroll antistoff for eksempel her ble valgt basert på virkningsmekanismen av stoffet (dvs., ERT opptaket gjennom CI-M6PR). Et panel av fluorophores ble også testet og sammenliknet for optimal analysen følsomhet og dynamisk område1. CypHer 5e ble testet på grunn av sin økt fluorescens på et surt pH, som kan være relevante for noen ERTs som et ekstra tiltak lysosomale rettet mot narkotika27. En grønn fluorescerende farge (f.eks Alexa Fluor 488), og en langt rødt fluorescerende farge (f.eksAlexa Fluor 647) ble også undersøkt. Et eksempel på hvordan ulike fluorophores kan utføre er presentert i figur 4a og 4b. I eksemplet er hadde Alexa Fluor 647 ERT best ytelse pga overlegen følsomhet (f.eks, den høyeste % SI på den laveste PC konsentrasjonen) og bredt dynamisk område (~ 3 størrelsesordener).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> Figur 4: eksempel resultater fra ulike fluorophore-ERT conjugates. (A) under analysen utviklingen, en positiv kontroll (PC) fortynning kurve skal evalueres ved hjelp av forskjellige fluorophore-konjugerte ERTs. I eksemplet som vises her, to fluorophore-konjugerte ERTs (Alexa Fluor 488 og CypHer 5e) på 6,25 µg/mL og en lysere fluorophore-konjugerte ERT (Alexa Fluor 647) på 1.56 µg/mL ble testet i nærvær av økende konsentrasjoner av positive-kontroll NAbs. (B) dette panelet viser kurvene panelet A grafisk, bruke MFI for å vise den betydelige økningen i det dynamiske området bruker en Alexa Fluor 647-konjugerte ERT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Metoden beskrevet er en lagdelt tilnærming for å oppdage, bekrefter og interpolere en kvasi kvantitative nivå av NAb titer3. For å opprette analysen er klar for validering, parameterne inkludert analysen følsomhet, presisjon, selektivitet, spesifisitet, narkotika toleranse, robusthet, og kutt punkter bør vurderes i henhold til etablerte guidances1,3 .
Prøvene ble ansett potensielt positivt i denne analysen når % SI verdier større enn screening kuttet punkt (SCP) ble innhentet. SCP ble bestemt statistisk av testing stoffnaive prøver fra en representant befolkning og måle en relativ reduksjon i signal intensitet (SI)3. Veiledningen er (for eksempel av FDA) anbefaler at SCP opprettes på 95th persentil av normalfordelt datasettet og metoder for beregning av SCP har blitt beskrevet i detalj andre steder1. Noen eksempler som redusert analysen signalet (målt som en økning i % SI) på eller over SCP var fast bestemt på å være potensielt positive og eksempler med resultater høyere enn SCP (uten endre eller nedgang i % SI) anses negative.
Prøver som vist positive (% SI over SCP) ble testet i bekreftende analysen å bestemme spesifisiteten av NAbs til ERT. Bekreftende analysen ble utført av pre rugende prøver med ERT-konjugerte magnetiske perler fjerne stoff-spesifikke antistoffer eller hemmende faktorer. RR (forholdet mellom bekreftende MFI å screening MFI) ble vurdert til å bestemme antall NAbs fjernet fra utvalget. En RR høyere enn beregnet terskelen positivitet [dvsbekreftende kuttet punktet (KKP)] tilstedeværelsen av anti-narkotika NAbs. I screening analysen, bør KKP først opprettes ved å evaluere behandling-naiv prøver fra en representant befolkning i bekreftende analysen. CCP var basert på en statistisk bestemmes 1% falske positive hastighet og var terskelen angi positivt bekreftet utvalg (figur 5)3.
Prøver som vist og bekreftet positive var serielt utvannet og testet i titer analysen til å bestemme den relative nivå eller titer av NAbs i hver prøve. Den høyeste fortynning som et utvalg tester positivt når det krysset en angitt terskel [f.eks titer kuttet punkt (TCP)] er den prøve titer (figur 5)1,3.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> Figur 5: eksempel utvalg testing resultater. Disse skjermbildene viser eksempler på prøver som testet positivt eller negativt av screening over eller under en SCP 17.51% SI. Positiv prøver ble testet i bekreftende analysen bruker narkotika-konjugerte magnetiske perler for å utarme stoff-spesifikke antistoffer fra prøvene før testing i analysen. Eksempler med utvinning forholdet (RR) større enn bekreftende kuttet punktet (i.e.RR = 1.315) ble ansett for å bli bekreftet positive. Prøver som bekreftet positive var utvannet til signalet krysset titer kuttet punkt (TCP) for å etablere titer (fortynningsfaktoren) som eksempel resultatet er lik titer kuttet punkt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Analysen repeterbarhet og variasjon ble testet over flere dager og med flere analytiker. QCs var opprinnelig forberedt i én omgang og sub-aliquoted for 1 x bruk. I løpet av 3 d utført to analytikere analysen med flere sett med QCs å demonstrere presisjonen for analysen. I eksempeldataene vises, % CV av inter - og intra-analysen presisjonen for QCs er mindre enn FDA veilednings anbefaling av % CV < 20% (figur 6)1.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> Figur 6: eksempel QC presisjon data generert over tre dager med to analytikere. Presisjon dataene ble beregnet ved en variansanalyse (ANOVA) ved hjelp av formelen i DeSilva et al. 28. intra-batch (i går) og mellom satsvise (mellom kjører) statistikk rapporteres som % CV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

Her presenterer vi en cellebasert flyt cytometri metode for å oppdage nøytraliserende antistoffer eller andre faktorer som påvirker mobilnettet opptaket av enzymet erstatning terapi i en menneskelige matrise som hjerne spinalvæske (CSF) eller humant serum.

Oppdagelsen av antistoffer som nøytraliserer mobilnettet opptaket av enzymet erstatning terapi med et cellebasert analysen

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediert Isotermisk forsterkning (LAMP) Analyser for Artenes spesifikke Påvisning av<em&gt; Eimeria</em&gt; Som infiserer Kyllinger

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunfluorescens å overvåke cellulært opptak av menneskelig lactoferrin og tilhørende antiviral aktivitet mot hepatitt C-viruset

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rensing av Viral DNA for identifikasjon av tilknyttet Viral og cellulær proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis i mus med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamisk vedheft analysen for funksjonell analyse av anti-vedheft terapi i inflammatorisk tarmsykdom

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...