Name: detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay
Uploaded: 2018-09-10T13:00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

Författarna har inga bekräftelser.

Mänskliga matriser köptes från kommersiella källor med godkännande från deras institutionella granskning Board (IRB) men skall hanteras som potentiellt smittförande. Se till att laboratoriemiljö används upprätthåller en kultur av säkerhet12.
1. innan analysen
<ol><li>Förbereda ERT-konjugerad streptividin magnetiska pärlor enligt tillverkarens anvisningar13.</li>
	<li>
Förbereda kvalitetskontroll prover (QCs): spika en positiv kontroll antikropp (PC) (t.ex., en NAb) i matrisen artspecifika (t.ex., poolade CSF eller serum). Obs: FDA och EMA vägledning rekommenderar en hög och en låg QC förbereda assay validering och rutinprovning1,14.<ol>
<li>Exempelvis för att erhålla en QC på 10 µg/mL, tillsätt 10 µL av 1 mg/mL lager positiv kontroll i 990 µL av relevanta matrisen (t.ex., CSF) för en total volym på 1000 µL.</li>
		<li>Alikvotens QC proverna i en volym som är lämplig för en enda använda (t.ex., 50 µL) och frysa alikvoter vid -60 till-80 ° C1.</li>
		<li>Alikvot en cut-punkt-kontroll (CC), artspecifika matris inte behandlas med testet artikeln (t.ex., poolade CSF eller serum) för en enda använda (t.ex., 50 µL) och frysa alikvoter vid -60 till-80 ° C1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utföra en konjugation reaktion mellan fluorophore och den ERT med en protein-märkning enligt tillverkarens protokoll15. Alikvotens provet i en volym som är lämplig för en enda använda (t.ex., 50 µL) och frysa alikvoter på -60-80 ° c.</li>
</ol>2. dag 1: Cell plätering och provberedning
<ol><li>
Cell plattan förberedelse
	<ol>
<li>Använder en vävnadskultur huva och upprätthålla en aseptisk miljö för följande steg. Spraya varje objekt som kommer att placeras i huven med 70% etanol och underhålla en ren miljö16,17,18.</li>
		<li>Värma cell odlingsmedium (t.ex., RPMI-1640 med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin) i badkar vatten eller pärla vid 37 ° C19.</li>
		<li>Räkna den mänskliga T lymfocyter Jurkat celler och platta 100 µL per brunn på 7,5 x 105 celler/mL i en 96-väl runda-botten cell kultur plattan lämpliga för användning på en flödescytometer utrustad med en tallrik lastare.<ol>
<li>Exempelvis använda en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare för att räkna celler20,21.</li>
			<li>Se till att cellerna har minst 70% lönsamhet innan du fortsätter med experimentet (t.ex., bedöma lönsamheten med trypan blå färgning)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inkubera cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 och 95% luftfuktighet över natten för 14-20 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Screening provberedning
	<ol>
<li>Späd ut föremål eller assay kontrollprover använder serum-fria medier (t.ex., RPMI-1640). Späd prover 1:2.5 RPMI-1640 genom att lägga 60 µL av provet till 90 µL serum-fria medier i exemplet metoden här. (t.ex., 8-strip rör). Fortsätt till steg 3.1 för analysförfarandet att förbereda en fluorophore-märkt ERT. Obs: Utspädning av 1:2.5 bestämdes experimentellt och är optimal för metoden presenteras här. Optimal provspädningar bör bestämmas för varje metod som utvecklats.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bekräftande pärla och prov förberedelse
	<ol>
<li>Beräkna antalet ERT-konjugerad pärlor behövs för bekräftande prover.<ol>
<li>För exempel, för 10 prover, Använd 10 prover x 100 µL av ERT-konjugerad pärlor per prov + 30% extra för att kompensera för eventuella förluster under tvätt steg = 1 300 µL av ERT-konjugerad pärlor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex pärlorna ordentligt. Tillsätt det beräknade antalet pärlor i en 15 mL koniska rör för tvätt.</li>
		<li>Tvätta ERT-konjugerad magnetiska pärlor genom att lägga till 1 300 µL av koppling buffert eller som föreslagits av tillverkaren (t.ex., med fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% polysorbat 20) enligt anvisningarna nedan13.</li>
		<li>Vortex röret ordentligt. Placera röret i ett magnetiskt rör rack i 2 min. Utan att störa pärlorna, noggrant aspirera och kasta bort supernatanten. Notera: Lösningen stängs från mörkbrun att rensa när pärlor dras till magneten.</li>
		<li>Återsuspendera pärlorna med 1 300 µL koppling buffert. Upprepa steg för tvätt för sammanlagt fyra tvättar.</li>
		<li>Efter den sista tvättningen, upphäva pärlorna i 1 300 µL koppling buffert (tidigare beräknade i steg 2.3.1.1). Tillsätt 100 µL per brunn till en 96 brunnar, vit, runda-botten, icke-bindande polypropylen tallrik enligt plattan kartan (t.ex., en bekräftande väl per prov eller QC; som provet ska delas upp i dubbletter när inkuberas med den fluorophore-märkt ERT).</li>
		<li>Placera plattan på en 96-bra sida-kjolar magnet och låt pärlor för att bilda en pellet. Försiktigt aspirera klara supernatanten och kassera den. Notera: Lösningen stängs från mörkt brun till klar efter ca 1 – 2 min på sida-kjolar magneten. Erhållna pärlorna kallas ”torr” pärlorna.</li>
		<li>Om proverna skärmad positiva och att bekräftas, tillsätt 100 µL av varje prov med och utan ERT-konjugerad pärlor i det lämpliga/tilldelat väl. Försegla plattan med en plastfilm och låt skaka i minst 60 min på en roterande skakapparat på ca 800 rpm vid rumstemperatur (RT). Obs: Tidigare beredd och fryst positiva och negativa QCs och CC bör ingå på varje tallrik.</li>
		<li>Efter inkubering, placera bekräftande plattan på 96 brunnar sida-kjolar magneten och låta pärlor för att bilda en pellet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Titer utspädning serien förberedelse
	<ol>
<li>Att förbereda en titer serie, seriellt späd provet i poolade matrisen ett tillräckligt antal gånger att korsa förutbestämda titern skär punkt1.</li>
		<li>Till exempel blanda 30 µL av provet 60 µL av poolade matris i en 1:3 spädningsserien för sammanlagt 8 utspädningar (t.ex., 8-strip rör). Fortsätt till steg 3.1 för analysförfarandet att förbereda fluorophore-märkt ERT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dag 1: Analysförfarande
<ol><li>
Förbereda den fluorophore-märkt ERT i serumfritt medium (t.ex., 60 µL per brunn, eller ca 6 mL/platta).
	<ol>
<li>Till exempel, att förbereda 10 mL av 1 µg/mL fluorophore-märkt ERT, tillsätt 10 µL av lager 1 mg/mL fluorophore-märkt ERT 9,99 ml serum-fria medier (t.ex., RPMI-1640).</li>
	</ol>
</li>
	<li>I en ny inkubation plattan (t.ex., 96 brunnar, vita, runda-botten, icke-bindande polypropylen plattan), lägga till beredda proverna från steg 2.2, 2.3 eller 2.4 och en fluorophore-märkt ERT i en 1:1 blandning i dubbla brunnar (t.ex., överföring 60 µL av varje förberett prov och tillsätt 60 µL av den fluorophore-märkt ERT per brunn). Observera: Ett exempel experiment plåt karta finns i figur 1.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> Figur 1: exempel på ett experiment plattan layout. Prover och en fluorophore-märkt ERT var inkuberas över natten vid 2 – 8 ° C. Kontroller som hög kvalitet kontroll (HQC), låg kvalitet kontroll (LQC) och negativa kvalitetskontroll (NQC) var avskärmade och bekräftades den motsatta hörn av plattan att bedöma plattan enhetlighet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<ol start="3"><li>Blanda proverna och den fluorophore-märkt ERT genom pipettering upp och ner flera gånger med en flerkanalspipett. Linda in plattorna i folien och inkubera dem över natten vid 2 – 8 ° C i 14 – 20 h.</li>
</ol>4. dag 2: Lägga till beredda proverna till cellerna
<ol><li>Ta bort de prov inkubation skylt(ar) från inkubering vid 2 – 8 ° C och värm plattorna genom att placera dem i en pärla bad vid 37 ° C i 10 – 15 min.</li>
	<li>Ta bort celler från CO2 inkubatorn. Utföra en okulärbesiktning av pläterad celler med ett inverterat Mikroskop för att säkerställa att cellerna visas friska och jämnt fördelade över de brunnar17,19.</li>
	<li>Tillsätt 100 µL av tidigare blandat proverna och fluorophore-märkt ERT till en cell tallrik enligt experimentella plattan kartan.</li>
	<li>Placera cell plattan med extra prover tillbaka i CO2 inkubatorn vid 37 ° C. Inkubera plattan för 3 h och ± 15 min. Obs: Denna gång var etablerad i labbet som optimal för signal-brus-svar i analysen.</li>
	<li>Centrifugera cell plattan för 6 min vid 320 x g i en bordsskiva centrifug på 14 – 18 ° C. Bekräfta förekomsten av en cellpelleten längst ned i plattan brunnarna.</li>
	<li>Håll plattan i 30 – 45° vinkel. Ta försiktigt bort supernatanten från varje brunn utan att störa cellpelleten. Tillsätt 200 µL av 1 x DPBS på cellpelleten i varje brunn för att resuspendera cellerna.</li>
	<li>Upprepa cellen tvätt steg för totalt 3 tvättar. Omedelbart gå vidare till steg 5 för cell livskraft färgningen.</li>
</ol>5. dag 2: Cell livskraft färgning
<ol><li>Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 100 µL av en fungerande lösning av 1 x Live/Dead fläcken i varje brunn, valts för emissionsvåglängden avviker från den fluorophore-märkt ERT och beredd enligt tillverkarens anvisningar22.</li>
	<li>Inkubera plattan för 15 min vid RT i mörkret. Centrifugera plattan för 6 min vid 320 x g i en bordsskiva centrifug på 14 – 18 ° C.</li>
	<li>Ta försiktigt bort supernatanten från varje brunn utan att störa cellpelleten. Tvätta cellerna 1 x med 1 x DPBS.</li>
</ol>6. dag 2: Fastställande av cellerna med 1% paraformaldehyd
<ol><li>Med hjälp av en flerkanalspipett, Dispensera 100 µL av kylda (vid 2 – 8 ° C) 1% PARAFORMALDEHYD (PFA) i varje brunn.</li>
	<li>Täta det plattor och försiktigt puls vortex att blanda. Linda in plattan i folien och placera den vid 2 – 8 ° C i minst 10 minuter för fixering. Obs: Var noga med att undvika stänk på plattan tätningen.</li>
	<li>Tillsätt 50 µL av 1 x DPBS i varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett upp och ner före analysen.</li>
</ol>7. flödescytometri
<ol><li>Placera plåtarna på flödescytometer med plattan lastaren och köra dem.</li>
	<li>Förvärva och registrera uppmätta median fluorescensintensiteten (MFI) använda programvaran flow flödescytometri (se Tabell för material). Obs: Se figur 2 som ett exempel för loader-inställningar. Provtagningsflödet, provvolymen, blanda volym, blandning hastigheter och antal mixar är optimerade för denna analys. Dessa kriterier kan justeras med knapparna ”pilarna upp” eller ”ner” bredvid siffrorna för varje kriterium, beroende på den flöde flödescytometri förvärv programvara23.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> Figur 2: exempel på flöde cytometer loader inställningarna. Loader inställningarna bör optimeras för varje test som är utvecklat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<ol start="3"><li>Skapa en cytometer analys/grindar/tomter som visas i figur 3. Obs: Gate inrättandet och tillämpningen kan variera för varje flöde flödescytometri programvara23.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> Figur 3: flödescytometri gating strategi. Jurkat celler skildes från de totala händelserna och samlats in av plottning framåt-scatter (FSC) vs. sida-scatter (SSC) kanalerna och rita en grind runt målpopulationen. Undertröjor (enstaka celler) avskildes från midjekort jacka eller större cell aggregat med hjälp av FSC-området (FSC-A) och FSC höjd (FSC-H) kanaler. Levande celler valdes av gating på singlet celler negativt för en livskraft fläck. Median fluorescensintensiteten (MFI) mättes i enda, levande Jurkat celler och ritas som ett histogram. MFI värden i celler med drogen upptaget blockerad (t.ex., HQC) och celler med kontroll redovisas mängder upptag (röd och blå, respektive). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<ol start="4"><li>Utesluta döda celler från analysen och spela in cirka 10 000 händelser23.</li>
</ol>8. dataanalys
<ol><li>Exportera data (rå MFI) till programvaran analys (se Tabell för material). Obs: Beroende på analysen behövs följande dataanalys kan utföras med analysprogramvara.</li>
	<li>Beräkna medelvärdet MFI för dubbla brunnar (QCs och prover) och variationskoefficienten (CV %) att utvärdera spridning variabilityen av dubbletter från medelvärdet. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>För prover och QCs som screenades i analysen, beräkna procent signal hämning (% SI) i förhållande till genomsnittlig MFI av den för QCs poolade matrisen CC. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Om det behövs, beräkna återhämtning kvoterna (RRs) för bekräftade QCs och prover i förhållande till motsvarande skärm värden. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>CDER. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+design,+optimization,+and+qualification+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+responses+elicited+to+biological+therapeutics.">Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics.</a> Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+validation+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+immune+responses+elicited+against+biological+therapeutics.">Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).</li><li>Pedras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAb+me+well-+FDA+Regulatory+Perspectives+on+Neutralizing+Antibody+Assays.">NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays.</a> BEBPA Forum. , (2015).</li><li>Stovold, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAB+Assay+Development+and+Validation+Immunogencity+Workflow.">NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow.</a> Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).</li><li>Kromminga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , (2013).</li><li>Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+Fc+receptor+homologs+with+preferential+B+cell+expression.">Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).</li><li>Melton, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+neutralize+cellular+uptake+of+elosulfase+alfa+are+not+associated+with+reduced+efficacy+or+pharmacodynamic+effect+in+individuals+with+Morquio+A+syndrome.">Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome.</a> Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , (2012).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+pharmacological+comparison+of+enzyme+replacement+therapies+for+the+glycolipid+storage+disorder+Fabry+disease.">A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease.</a> Glycobiology. 13, 305-313 (2003).</li><li>Kirkegaard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapies+and+therapeutic+concepts+for+lysosomal+storage+diseases.">Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases.</a> Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).</li><li>Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm">https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm</a> (2012)</li><li>Invitrogen by ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DynabeadsTM M-270 Streptavidin. , (2015).</li><li>European Medicines Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , (2017).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular ProbesTM Alexa FluorTM 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Working+in+the+Hood.">An Introduction to Working in the Hood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Invitrogen and Gibco. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Basics Handbook. , (2010).</li><li>Coecke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+on+Good+Cell+Culture+Practice.">Guidance on Good Cell Culture Practice.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).</li><li>. Introduction to Cell Culture Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html</a> (2018)</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. Counting Cells with Bio-Rad&#39;s TC20(TM) Automated Cell Counter Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M">https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M</a> (2012)</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide LIVE / DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting Started with BD FACSDiva Software. , (2007).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).</li><li>Quirke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Flow+Cytometry:+A+Learning+Guide.">Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide.</a> Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).</li><li>. A guide to gating in flow cytometry Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html</a> (2016)</li><li>Minor, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , (2006).</li><li>Desilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Bioanalytical+Method+Validation+of+Ligand-binding+Assays+to+Support+Pharmacokinetic+Assessments+of+Macromolecules.">Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules.</a> Pharmaceutical Research. 20, (2003).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+and+non-cell-based+assay+platforms+for+the+detection+of+clinically+relevant+anti-drug+neutralizing+antibodies+for+immunogenicity+assessment+of+therapeutic+proteins.">Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+neutralizing+assay+for+antibodies+and+sera+against+hepatitis+E+virus.">A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Charles River. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow+Cytometric+Method+to+Assess+Neutralizing+Antibodies+to+AAV+Gene-Therapy+Vectors.">A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors.</a> Charles River Researcher. , (2015).</li><li>Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ELISA+protocol+to+improve+the+accuracy+and+reliability+of+serological+antibody+assays.">An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays.</a> MethodsX. 4, 153-165 (2017).</li><li>Iversen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+Assay+Validation.">HTS Assay Validation.</a> Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).</li><li>Long, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa+in+the+Treatment+of+Morquio+A+Syndrome:+Results+From+MOR-005,+a+Phase+III+Extension+Study.">Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study.</a> Clinical Therapeutics. 39, (2017).</li><li>Schweighardt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa,+an+Enzyme+Replacement+Therapy+in+Patients+with+Morquio+A+Syndrome:+Results+from+MOR-004,+a+Phase+III+Trial.">Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial.</a> Clinical Therapeutics. 37, (2015).</li><li>Mellman, I. R. A., Plutner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+and+Degradation+of+Macrophage+Fc+Receptors+Bound+to+Polyvalent+Immune+Complexes.">Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+the+therapeutic+enzymes:+considerations+for+testing,+prevention+and+treatment.">Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment.</a> Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).</li></ol>

Författarna är anställda och aktieägare BioMarin Pharmaceutical Inc.

Neutraliserande antikroppar eller andra faktorer som hindrar ERT upptaget genom CI-M6PR har potential att påverka ERT säkerhet eller effekt1. Det är därför viktigt att utvärdera NAbs i ämnet prover med en robust modell som är relevanta för läkemedlets verkningsmekanism. Vi och andra har hittat att inte justeras prestanda för vissa bioassay format (t.ex., receptor dimerization, luciferas uttryck, etc.) med hälsa myndigheten rekommendationer för Analysens precision, reproducerbarhet och känslighet 29. i bioassayen metoden som beskrivs här Jurkat celler som uttrycker endogena CI-M6PR är anställda att övervaka NAbs specifika för lysosomala ERT upptaget. Denna analys i kombination med en flöde flödescytometri avläsning, och använder en fysiologisk cell modell med precision lämplig analys, känslighet, reproducerbarhet och hög provkapacitet. NAb upptäckt med ett flöde flödescytometri avläsning har också tillämpats på andra indikationer. Exempelvis har metoder utvecklats för att upptäcka befintliga antikroppar mot hepatit E och adeno-associerade virus (AAV)30,31.
Kritiska steg i protokollet är att välja en lämplig fluorophore, införliva en LQC att bildskärmar assay känslighet, att säkerställa en tillräcklig nivå av cellernas viabilitet, och upprätthålla strikt följsamhet till inkubationstider. I de exempel som presenteras här, fluorophores (t.ex., Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 och CypHer 5e), konjugerat till en lysosomala ERT, varierat mycket i sina prestationer. Alexa Fluor 647, som också var den ljusaste fluorophore testade32, valdes ut för vidare analys utveckling. Vi rekommenderar att flera fluorophores utvärderas tidigt i utvecklingen av analysen att ge den bästa känslighet och dynamiskt omfång. Analysens känslighet under provtagning bör övervakas av inklusive en LQC som är tillräckligt nära till känslighet gränsen att det kommer att misslyckas i 1% av tester körs1. Tillsammans med HQC fungerar LQC också som ett system lämplighet QC övervaka assay drift över tid3. Optimal cellernas viabilitet och prestanda uppnås genom att förbereda en cell bank engångsbruk alikvoter och kvalificerade i nya cellbanker baserat på jämförbara QC resultat3,18. Cellen och fluorophore-konjugerad drog inkubationstider är också central för en konsekvent assay prestanda eftersom drogen upptag ökar med mängden tid drogen inkuberas med celler. För att minimera variation i drogen upptag, kan exempeldata normaliseras mot poolade matrix kontrollprover på varje tallrik (t.ex., övergångspunkten kontroll proverna i metoden ovan). En annan viktig faktor i att producera konsekventa data med den här metoden är att övervaka plattan enhetlighet och minimera möjliga kanteffekter. Ett första experiment kan omfatta utför analysen använder en enda QC över hela plattan, medan mer robust experiment kan utföras under analysens giltighet (t.ex., precision och noggrannhet)1. Detta visar vikten av de platta karta layout33. Som visas i exemplet plattan karta, placeras kvalitetskontroll prover på båda sidor av den platta bildskärmen en enhetlighet som kan spåras över tid med Levey-Jennings diagram34.
Medan denna analys övervakar NAbs och andra faktorer som kan hämma lysosomala ERT upptag, kan ytterligare försök utföras för att bekräfta en upptag hämning på grund av antikroppar. Ett alternativ är att behandla prover med protein A/G/L, som icke-specifikt binder immunoglobulin35. Om prover fortsätter att testa positivt efter protein A/G/L utarmning, kan en icke-antikropp hämmande faktor vara ansvariga för att blockera drog upptaget. Den metod som beskrivs här var utformat för att mäta antikroppsmedierad upptag hämning, och den positiva kontrollen och andra assay parametrar bör omprövas om en hög andel av ämnet prover med icke-antikropp hämmande faktorer som finns.
Analysen kan också ytterligare kännetecknas för att demonstrera fluorophore-märkt läkemedel trafikerar till den lämpliga mobilfack baserat på läkemedlets verkningsmekanism. I exemplet presenteras här förväntas en ERT binda CI-M6PR på cellytan och trafiken det till Lysosomen. Tidigare rapporterade vi resultaten av flera experiment som visar att nästan alla av fluorescerande signalen observerats i metoden resultaten från fluorophore-märkt ERT i lysosomen8. Vi hittade att signalen fluorophore-märkt ERT eliminerades efter en behandling av cellerna med cytochalasin B, som stör internalisering genom hämning av aktin omorganisation. Även indikerar experiment som härdas externa fluorophore med trypan blå eller långsammare internalisering genom att placera celler vid 4 ° C, att den fluorophore-märkt ERT är snabbt internaliserat och mycket lite fluorescens beror på en ERT bundna på cellytan. Lysosomala inriktning bekräftades genom att visualisera samtidig localizationen av pH-känsliga lysotracker dye med fluorophore-konjugerad drogen med konfokalmikroskopi. En specificitet för upptag genom CI-M6PR kan också kontrolleras med hjälp av exogena M6P för att konkurrera med märkta läkemedel för receptorbindning. Liknande experiment bör utföras för att verifiera upptag kinetik och cellulär lokalisering av fluorophore-konjugerat läkemedel i andra analyser.
Denna cell-baserat test plattform har använts för att studera NAbs för terapeutiska läkemedel som använder CI-M6PR receptormedierad endocytos. Vi rapporterade nyligen resultat med hjälp av denna analys-plattform som visat något samband mellan utvecklingen av en NAb och drogen effekt för elosulfase alfa36,37. För att validera analysen för kliniska prov testning, parametrar, inklusive analysens känslighet, precision, selektivitet, specificitet, drog tolerans, robusthet, och skär punkter, bör utvärderas enligt etablerade guidances3, 4. det bör också noteras, för lysosomala ERTs, att NAbs kan utveckla med potential att störa drog aktivitet genom bindande nära enzym katalytisk platsen. I allmänhet, anser vi att övervaka denna typ av NAb vara av lägre prioritet eftersom den hårda sura och proteolytiska miljön i lysosomen inte är gynnsamt för antikropp-ERT interaktioner2,39,40. Det är dock möjligt att proteolytiska-resistenta NAbs existerar och kan hämma den katalytiska delen av en drog40. Denna assay bildskärmar fluorophore-märkt ERT upptag till lysosomen, och en begränsning av analysen är oförmågan att övervaka proteolytiska-resistenta NAbs. Om denna typ av NAb misstänks baserat på säkerhets- och effektdata, bör en analysmetod som övervakar ERT aktivitet utvecklas och används för att testa prover.
Bedömningen av immunogenicitet är viktigt för att förstå effekterna av NAbs på drog säkerhet och effekt. Identifiering av NAbs kan hämma i vitro drog upptag via CI-M6PR ger en möjlighet för att förstå NAb aktivitet in vivo. Metoden presenteras här utnyttjar en human cellinje som uttrycker CI-M6PR för att mäta störningar av fluorophore-konjugerad lysosomala ERT cellernas upptag. Denna metod har redan använts att övervaka NAbs för flera ERTs avsedd att behandla lysosomala lagring sjukdomar. Denna assay plattform kan gälla andra metoder för att studera effekterna av NAbs på biologiska läkemedel som kräver en cellulär internalisering för sin avsedda funktion.

Immunogenicitet bedömning är en viktig del av säkerheten och effekten övervakningsprogram för alla biologiska terapeutiska produkter, inklusive ERTs. Patienter kan utveckla ett immunsvar som kan direkt påverka drog säkerhet, effekt och farmakokinetiska/farmakodynamiska profiler. En delmängd av dessa ADA, kallas NAbs, kan hämma ERT effekt på två sätt: genom hämning av ERT upptaget in i riktade cellen eller genom att hämma den ERT katalytiska aktiviteten. Metoden presenteras här är utformat för att mäta NAbs som störa ERT upptaget in i celler. För att fullt ut följa säkerhet och effekt av den terapeutiska ERT, är kontinuerlig övervakning av NAbs avgörande att belysa eventuella potentiella korrelationer med kliniska resultat eller farmakodynamiska effekter1.
Plattformar för att utvärdera NAbs mot protein therapeutics omfattar cellbaserade, enzymatisk aktivitet och ligand-bindande analyser1. Den optimala assay plattformen väljs utifrån olika kriterier: verkningsmekanismen av produktens terapeutiska, assay plattform känslighet, selektivitet, precision och ännu viktigare, dess förmåga att härma den hämmande effekten av Joula i vivo . Ligand-bindande analyser kan vara lämpligt i vissa fall (t.ex.när en relevant cellinje inte kan identifieras eller om lämplig känslighet inte kan uppnås i en cell-baserad analys). Dock i 2016 utkastet till FDA riktlinjer för branschen dokument och andra branschen godtagna vitböcker, cellbaserade NAb analyser rekommenderas, eftersom de får bättre återspegla den biologiska mekanismen av drogen i vivo1,2 , 3.
De kritiska komponenterna för att utveckla en flöde flödescytometri cellbaserade NAb analysen inkludera en lämplig cellinje som svarar på läkemedlet stimulering, en surrogat positiva-kontroll NAb som neutraliserar ERT, en fluorophore-konjugerad ERT och den biologiska art Matrix4,5,6. Cell linjeval är beroende av ERT verkningsmekanismen och flera cellinjer bör utvärderas under den assay utveckling3. I den metod som beskrivs här, valdes mänskliga Jurkat T celler för deras endogena CI-M6PR uttryck på cellytan och avsaknaden av antikropp fragment receptorer (FcRs) som urskillningslöst binder regionen Fc i de flesta antikroppar7,8 . Under analysen utvecklingen är det viktigt att etablera en negativ kontroll för valideringsstudier och patientprovet testning, såsom serum som poolats från individer som inte har behandlats med den test artikel1. Cellinjer bör också tolerera relevanta matriser från olika arter för kontinuitet investeringsfaser de prekliniska, kliniska och efter godkännande för försäljning av läkemedlet utveckling1. En annan komponent är urvalet av analysens positiv kontroll. Den positiva kontrollen för ERT cell upptag analysen valdes utifrån dess förmåga att binda den terapeutiska och neutralisera upptaget genom CI-M6PR9,1. Det är ofta svårt att få användbar eller hållbar mängder neutraliserande antiserum från försökspersoner för användning som en assay kontroll, speciellt i sällsynt sjukdom patientpopulationer2. Alternativ inkluderar antiserum från hyper-vaccinerade djur eller affinitet-renat till spetsade in i assay relevanta matris1polyklonala eller monoklonala antikroppar. När du använder en artspecifik matris, är det möjligt att hämmande faktorer än antikroppar som är närvarande i matrisen kan hämma ERT upptaget. En annan viktig komponent i analysen är den fluorophore-konjugerad ERT. Valet av fluorophore för ERT konjugationen bör utvärderas för varje ERT, baserat på analysens behovet av ljusstyrka, pH stabilitet och potentiella spektrala överlappning i andra kanaler på flödescytometer.
Den analysmetod som beskrivs här är ett exempel för att mäta en NAb till en terapeutisk protein, såsom en ERT, som går in i cellen via CI-M6PR. Flera ERTs, avsedd att behandla lysosomala lagring sjukdomar (LSDs), utnyttja denna väg för cell upptag och lysosomala inriktning, inklusive elosulfase alfa för Morquio A syndrom, cerliponase alfa för CLN2 Batten disease, agalsidasalfa för Fabrys sjukdom, och alglukosidas alfa för Pompes sjukdom10,11. Syftet med denna metod är att mäta de relativa NAbs som störa drog bindande och internalisering via CI-M6PR. Detta utförs i skiktad screening, bekräftande och antikroppnivåns steg3. Proverna först screenas för NAb positivitet och sedan bekräftade positiva i bekräftande steg. Slutligen, prover som skärmen och bekräfta positiva seriellt spädas för att generera en antikropp titer1. Denna cell-baserad flöde flödescytometri drog upptag analys ger en känslig och slentrianmässigt relevanta in vitro- Metod för att mäta drogspecifika NAbs som kan påverka en läkemedlets farmakologiska profil. Vi har tidigare validerade metoden och testade kliniska prover med hjälp av denna plattform för drogen elosulfase alfa8. Här beskriver vi de detaljerade stegvisa protokoll som kan tillämpas på andra terapeutiska proteiner eller ERTs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

Administrering av enzymet ersättare terapier (ERTs) och andra biologiska behandlingar till patienter kan framkalla ett anti-drog immunsvar. Karakterisering av dessa anti-läkemedelsantikroppar (ADA), särskilt de som kan neutralisera den biologiska aktiviteten av läkemedlet, kallas neutraliserande antikroppar (NAbs), är avgörande för att förstå effekterna av dessa antikroppar på läkemedlets farmakologiska profilen. Det här protokollet beskriver en cellbaserade flöde flödescytometri metod för att upptäcka faktorer som neutraliserar cellulära upptaget av en representant lysosomala ERT i mänskliga matris. Protokollet består av tre processer: screening, ett bekräftande steg, titer analyser att upptäcka, identifiera och fastställa den relativa neutraliserande antikropp titer i ämnet prover.
Den här metoden prover först blandas med fluorophore-konjugerad ERT produkten sedan inkuberas med celler [e.g., humana T-lymfocyter (Jurkat celler)] som uttrycker en cellytan ering-oberoende mannos-6-fosfat receptor (CI-M6PR), och Slutligen analyseras med en flödescytometer. Ett prov utan NAbs resulterar i upptaget av den fluorophore-konjugerad ERT produkt via CI-M6PR, förekomsten av NAbs kommer att binda till drogen och störa de CI-M6PR bindande och upptag. Mängden av fluorophore-konjugerad ERT internaliseras av Jurkat celler mäts av flödescytometri och utvärderas som andel (%) signal hämning jämfört med de svar som erhållits i närvaro av en representant drog-naiva matris. I steget bekräftande är proven pre ruvade med ERT-konjugerad magnetiska pärlor att tömma drogspecifika faktorer som binder till drogen (såsom NAbs) före en inkubation med celler. Prover som skärmen och bekräfta positiva för drogspecifika NAbs i analysen är sedan seriellt spädas för att generera en titer. Semikvantitativ antikropp titrar kan vara korrelerade med mätningar av drogen säkerhet och effekt.

Den första dagen av metoden, var en fryst alikvot av Jurkat celler tinade pläterade och proven var beredda. Figur 1 visar ett exempel plattan karta. Den andra dagen, var proverna blandas med Jurkat celler och inkuberas vid 37 ° C i ca 3 h och 15 min. Cellerna var sedan tvättas, fast med PFA och analyseras på en flödescytometer. Figur 2 visar exempel flöde cytometer inställningar.
Den flödescytometri gating strategi var utformat för att mäta mängden fluorophore-konjugerat läkemedel i levande enda Jurkat celler24 (figur 3). Cellerna var separerade från skräp genom att rita en grind som utesluter cellulära skräp [vanligtvis låg framåt scatter (FSC)] och döda celler [vanligtvis hög side scatter (SSC)], lämnar endast levande celler för analys25. Enstaka celler skildes sedan från cell kluster genom att rita en grind som utesluter området hög FSC och den låga FSC höjd26. Cellerna behandlades med livskraft fläckar som märkt någon ohälsosam eller döda celler utan ett intakt membran, och en extra grind skapades för att utesluta de döda celler22. MFI live enda celler användes för analys av fluorophore-konjugerad ERT upptaget. Som ett exempel på potentiella screening test resultat, hämmade matrisen spetsade med en hög mängd surrogat narkotikabekämpning antikropp positiv kontroll [e.g., hög kvalitet kontroll (HQC)] fluorophore-konjugerad ERT upptag, vilket resulterar i en låg MFI av cirka 300 (figur 3). Däremot cellerna inkuberas med matrisen i avsaknad av den positiva kontroll antikroppen bör ha en högre MFI (MFI = 37 830 i figur 3), visar upptaget av de fluorophore-konjugerad ERT.
Den neutraliserande positiv kontroll antikropp för exemplet här valdes baserat på verkningsmekanismen av drogen (dvs, ERT upptaget genom CI-M6PR). En panel av fluorophores var också testade och jämförde för optimal analysens känslighet och dynamiskt omfång1. CypHer 5e testades på grund av dess ökade fluorescens på ett surt pH-värde, som kan vara relevant för vissa ERTs som en ytterligare åtgärd av lysosomala inriktning drog27. Ett grönt fluorescerande färgämne (t.ex. Alexa Fluor 488) och ett mån fluorescerande färgämne (t.ex., Alexa Fluor 647) undersöktes också. Ett exempel på hur olika fluorophores kan utföra presenteras i figur 4a och 4b. I exemplet hade den Alexa Fluor 647 ERT bästa prestanda tack vare överlägsen känslighet (t.ex., den högsta % SI vid den lägsta koncentrationen av PC) och brett dynamiskt omfång (~ 3 tiopotenser).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> Figur 4: exempel resulterar från olika fluorophore-ERT konjugat. (A) under assay utvecklingen, en positiv kontroll (PC) utspädning kurva utvärderas med hjälp av olika fluorophore-konjugerad ERTs. I exemplet som visas här, två fluorophore-konjugerad ERTs (Alexa Fluor 488 och CypHer 5e) på 6,25 µg/mL och en ljusare fluorophore-konjugerad ERT (Alexa Fluor 647) 1,56 µg/ml testades i närvaro av ökande koncentrationer av positiv-kontroll NAbs. (B) denna panel visar kurvorna från panel A diagram, använda MFI för att visa den betydande ökningen i det dynamiska omfånget med en Alexa Fluor 647-konjugerad ERT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Den beskrivna metoden är en stegvis metod för att upptäcka, bekräftar och interpolera kvasi kvantitativ nivå NAb titer3. För att fastställa analysen är klar för validering, parametrar inklusive analysens känslighet, precision, selektivitet, specificitet, drog tolerans, robusthet, och skär punkter bör utvärderas enligt etablerade guidances1,3 .
Prover ansågs potentiellt positiva i denna analys när % SI värden större än screening skära punkt (SCP) erhölls. SCP bestämdes statistiskt test narkotika-naiva prover från en representativ population och mäta en relativ minskning av signal intensiteten (SI)3. Väglednings (till exempel av FDA) rekommenderar att SCP är etablerad på den 95n : te percentilen av normalfördelade data och metoder för beräkning av SCP har varit beskrivs i detalj på annan plats1. Varje prov som minskade assay signalen (mätt som en ökning av % SI) vid eller över SCP var fast besluten att vara potentiellt positiva och prover med resultat högre än SCP (med ingen ändra eller minskning av % SI) betraktas som negativa.
Prover som positiv (% SI ovan SCP) testades i den bekräftande analysen att bestämma specificiteten av NAbs för ERT. Den bekräftande analysen utfördes före ruvning prover med ERT-konjugerad magnetiska pärlor att ta bort drogen-specifika antikroppar eller hämmande faktorer. RR (förhållandet mellan bekräftande MFI till screening MFI) utvärderades för att avgöra antalet NAbs bort från provet. En Resurspost som är högre än den beräknade tröskeln av positivitet [dvs, bekräftande övergångspunkten (CCP)] anges förekomsten av anti-drog NAbs. Liksom i den screening test, bör CCP först fastställas genom att utvärdera behandlingsnaiva prover från en representativ population i bekräftande analys. CCP baserades på en statistiskt bestämd 1% falskt positiva kurs och tröskeln var och utse en positivt bekräftade prov (figur 5)3.
Prover som screenas och bekräftade positiva var seriellt spädas och testade i titer analysen att avgöra den relativa nivån eller titer för NAbs i varje prov. Den högsta utspädning vid vilken ett prov testas positivt när det passerat en utsedda tröskel [e.g., titern cut point (TCP)] är provet titer (figur 5)1,3.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> Figur 5: exempel prov testresultat. Dessa paneler visar exempel på prover som testat positivt eller negativt av screening antingen ovanför eller nedanför en Tjänstanslutningspunkt 17.51% SI. Positiva prover testades sedan i bekräftande analys använder drogen-konjugerad magnetiska pärlor för att tömma drogspecifika antikroppen från proverna före testning i analysen. Prover med en återhämtning förhållandet (RR) större än bekräftande övergångspunkten (dvs., RR = 1.315) ansågs bekräftas positiva. Prover som bekräftade positiva späddes tills signalen korsade titern cut point (TCP) för att fastställa antikroppnivåns (utspädningsfaktor) på vilken provet resultatet motsvarar titern skär punkt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Assay repeterbarhet och variabilitet testades under flera dagar och med mer än en analytiker. QCs var inledningsvis beredd i en batch och sub-aliquoted för 1 x användning. Under loppet av 3 d utförs två analytiker analysen med flera uppsättningar av QCs att demonstrera precisionen i analysen. I exempeldata visas, % CV på inter - och intra-Analysens precision för QCs är mindre än FDA vägledningens rekommendation av % CV < 20% (figur 6)1.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> Figur 6: exempel på QC precisionsdata genereras under tre dagar med två analytiker. Precisionsdata beräknades genom en variansanalys (ANOVA) med hjälp av formeln som presenteras i DeSilva o.a. 28. den intra-batch (inom körningar) och mellan batch (mellan körningar) statistik redovisas som % CV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

Här presenterar vi en cellbaserade flöde flödescytometri metod för att detektera neutraliserande antikroppar eller andra faktorer som stör det cellernas upptaget av enzymet ersätter behandlingar i en mänsklig matris, såsom cerebral spinalvätskan (CSF) eller humant serum.

Påvisande av antikroppar som neutraliserar cellulära upptaget av enzymet ersättare terapier med en Cell-baserad analys

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzymkopplad immunospot analys (ELISPOT): Kvantifiering av TH-1 cellulära immunsvaret mot mikrobiella antigener

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

In vitro-tRNA Metylering Analysera med Entamoeba histolytica DNA och tRNA metyltransferas Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-medierad Isothermal Amplification (LAMP) Analyser för de artspecifika Upptäckt av<em&gt; Eimeria</em&gt; Som infekterar Kycklingar

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescens att Övervaka Cellular Upptag av humant laktoferrin och dess associerade antiviral aktivitet mot hepatit C-virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rening av virus-DNA för identifiering av associerade Viral och cellulära proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis hos möss med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamiska vidhäftning test för funktionell analys av anti vidhäftning terapier vid inflammatorisk tarmsjukdom

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...