Name: assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

ونحن ممتنون للدعم المالي السخي من "لورانس جيه أليسون معهد تحويلية الطب" من المؤتمر الصومالي الموحد (هدية لديفيد اجوس). ونحن نقدر الدعم الذي بيمير الخريف وليزا فلاشنير التي تؤدي إلى توليد ونشر هذه المخطوطة. ونحن نشكر نغ لورا للدعم الإداري لها.

1-البروتين الاستخراج
<ol><li>لوحة 5 × 106 خلايا على لوحة زراعة الأنسجة 10 ملم (أو قارورة) في غطاء زراعة الأنسجة. عد الخلايا في وقت الطلاء مع عداد خلية تلقائي أو هيموسيتوميتير. وبدلاً من ذلك، تقدير عدد الخلايا.</li>
	<li>شطف الخلايا المزروعة في لوحة 10 ملم (أو قارورة) دقة 3 x مع 10 مل من المحلول الملحي ...

<ol>
	<li>Knauer, D. J., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+biological+activity+of+multiplication-stimulating+activity+by+binding+to+its+carrier+protein.">Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).</li><li>Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin+inhibits+tyrosine+phosphorylation+by+the+cyclic+nucleotide-independent,+transforming+protein+kinase,+pp60src.">Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).</li><li>Di Fiore, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+EGF+receptor+confers+an+EGF-dependent+transformed+phenotype+to+NIH+3T3+cells.">Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells.</a> Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).</li><li>Maguire, H. C., Greene, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neu+(c-erbB-2)+oncogene.">The neu (c-erbB-2) oncogene.</a> Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).</li><li>Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+G(1)+arrest+induced+by+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+requires+up-regulation+of+p27(KIP1)+independent+of+MAPK+activity.">Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).</li><li>Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitor+as+a+novel+signal+transduction+and+antiproliferative+agent:+prostate+cancer.">Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).</li><li>Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Effectiveness+of+EGFR-TKIs+versus+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer:+a+meta-analysis].">[Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis].</a> Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+turning+point+in+cancer+research:+sequencing+the+human+genome.">A turning point in cancer research: sequencing the human genome.</a> Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).</li><li>Barinaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DoE+provides+funds+for+human+genome+sequencing.">DoE provides funds for human genome sequencing.</a> Nature. 331 (6152), 103 (1988).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li><li>McCain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome+atlas:+new+weapon+in+old+war?.">The cancer genome atlas: new weapon in old war?.</a> Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).</li><li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+Pan-Cancer+analysis+project.">The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li><li>Carlson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing:+The+Next+Iteration+of+Personalized+Medicine:+Next+generation+sequencing,+along+with+expanding+databases+like+The+Cancer+Genome+Atlas,+has+the+potential+to+aid+rational+drug+discovery+and+streamline+clinical+trials.">Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials.</a> Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).</li><li>Huang, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+antibody+arrays:+a+promising+tool+to+identify+molecular+targets+for+drug+discovery.">Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).</li><li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics.">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).</li><li>Rani, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+changes+in+phosphorylation+of+receptor+tyrosine+kinases:+antibody+arrays.">Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays.</a> Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).</li><li>Kani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JUN-Mediated+Downregulation+of+EGFR+Signaling+Is+Associated+with+Resistance+to+Gefitinib+in+EGFR-mutant+NSCLC+Cell+Lines.">JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).</li><li>Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+the+control+of+gene+expression.">Signal transduction and the control of gene expression.</a> Science. 295 (5556), 813-818 (2002).</li><li>Rikova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+phosphotyrosine+signaling+identifies+oncogenic+kinases+in+lung+cancer.">Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.</a> Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).</li><li>Chen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+stage+and+clinical/prognostic+factors+for+colon+and+rectal+cancer+from+SEER+registries:+AJCC+and+collaborative+stage+data+collection+system.">Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system.</a> Cancer. 120, 3793-3806 (2014).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Ward, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Grouping+to+Optimize+an+Objective+Function.">Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function.</a> Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Griffin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+quantitative,+automated+analysis+of+protein+glycosylation.">Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation.</a> Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ubiquitin+target+proteins+using+cell-based+arrays.">Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).</li><li>McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia,+oxidative+stress+and+inflammation.">Hypoxia, oxidative stress and inflammation.</a> Free Radical Biology and Medicine. , (2018).</li></ol>

النهج التي تجمع بين العديد من قراءات البيولوجية تمثيلات طبيعتها أكثر دقة الأجهزة الخلوية في تجربة أداء. ظهور جسم والرمات صفائف تمكن وصف سريع للنمط التعديلات التي قد تكون مفيدة أكثر من حالة تعديل أي البروتين وحيد. سير العمل العامة لتطبيق المصفوفات والرمات جسم يستند إلى تعديل في سيرين، ثري?...

تنفيذ السريرية من مثبطات كيناز تيروزين المستهدفة (TKI) حولت علاج السرطان بتزويد الأطباء بأدوات فعالة لاستهداف البروتينات المحددة هذا التحول الورمية محرك الأقراص. تمنع هذه المركبات أو كتلة الفسفرة البروتينات التي يستهدفها تيروسين مؤنزم1،2. وقد وضعت تكيس جزئيا نظراً للتعديلات الوراثية في مفتاح مختلف الإشارات الجينات كافية لبدء السرطان بالسيارة والتقدم [مثلمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، بروتوونكوجيني بروتين تيروزين كيناز Src (SRC)، المركز-ABL، ومستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2)]3،4. تأثير تكيس على دورة الخلية5 و مسارات الإشارات الجزيئية6 يمثل تحولاً من تشتته إلى علاج السرطان مرشدين جزيئيا. أن الميزة الأساسية تكيس مقابل العلاج الكيميائي هو معدلات زيادة استجابة ومخاطر أقل سمية للخلايا السليمة7. كنتيجة لذلك، تزايد الاهتمام بالبحث والتطوير من الرواية تكيس.
الوصول إلى نتائج تسلسل الجينوم بدأت مع "مشروع الجينوم البشري"8،،من910 ويستمر اليوم مع الجيل المقبل (الجيل القادم) سرطان تسلسل الجهود المختلفة [مثلاً، "السرطان الجينوم" أطلس (تكجا)،من1112]. هذا وقد الهم العديد من المنهجيات التجريبية التي توفر المعلومات المتزامنة على آلاف جينات و/أو تقديم لقطات غير منحازة للجينات أو البروتينات عن طريق الاضطرابات البيولوجية13التضمين. منذ تنظيم وظيفة الخلوية يحدث على مستويات متعددة، من نسخ جينات لتعديل بوستترانسلاشونال للبروتينات ونشاطهم، فهم كامل للأحداث التي وقعت في السيطرة على وظيفة الخلوية سوف وفي نهاية المطاف تتطلب تكامل البيانات من قراءات البيولوجية المختلفة. القدرة على رصد مستويات الرنا الرسول (مرناً) الآلاف من الجينات مع قرار خلية واحدة جين زادت القدرة على جعل استنتاجات حول وظيفة الجينات والتفاعلات على نطاق الجامعة-الجينوم. مع ذلك، سيتم تفسير صفائف التعبير الجيني دائماً ناقصة أصلاً دون تكامل المستويات الأخرى للتنظيم: إلا وهي مستويات التعبير البروتين، والدول تعديل البروتين، والبروتين بوستترانسلاشونال تعديلات (الفسفرة، أوبيكويتيليشن، مثلايشن، إلخ). وهنا يصف لنا فائدة المصفوفات الأجسام المضادة كوسيلة استجواب بوستترانسلاشونال إدخال تعديلات على مكونات إشارات هامة كدالة لمختلف الظروف في تجربة واحدة14،15، 16.
يمكن أن تستخدم صفائف جسم والرمات للتمييز، وتحليل التغيرات في ممرات توصيل الإشارات16. وهذه يمكن أن تنشأ من تعديل الوراثي أو علاجات من خطوط الخلايا مع مثبطات كيناز، وتشريعات، والإجهاد الناجم عن المجاعة الحرمان أو نقص أو مصل الجلوكوز. ملاحظة، ومقاومة المخدرات أو جين معين حتى-أو downregulation يمكن أيضا أن يسبب تغييرات في ممرات توصيل الإشارات17.
المقاومة للعقاقير، وعلى سبيل المثال، يمكن أن تنشأ من الطفرات الهدف المخدرات لتجنب حساسية. في سرطان الرئة، ويعرف بالطفرات EGFR تجعل السرطان يغيرها إلى تكيس معينة، ولكن أكثر عرضه للآخرين. يمكن تنشيط إشارات المسارات البديلة بناء على الطفرة17. كتطبيق أوسع نطاقا للتعرف على سبل توصيل الإشارات تشارك في المقاومة ونقص، و ما إلى ذلك، توفر صفيفات والرمات جسم ثاقبة أكثر، وبالتالي فهم، تنطوي الآليات.
التكنولوجيات التي تسمح بتقييم التعديلات البروتين تمثل عنصرا هاما في نظم علم الأحياء لأنها غالباً ما تخدم وظيفة تنظيمية، مثل تحوير نشاط إنزيم أو التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات. وتتجلى أهمية التعديلات بوستترانسلاشونال هو بدور الفسفرة البروتين في توصيل الإشارات خارج الخلية تسبب ما يقرب من جميع مسارات18. تقليديا، تحديد مؤنزم أو حالة الفسفرة من البروتينات يمكن أيضا أن تحددها تحليل لطخة غربية، خاصة إذا كان الباحث مهتما فقط 1-5 أهداف. ولكن البقع الغربية هي انتقائية جداً ويمكن أن يكون متحيزا نحو معرفة مسبقة وقد يغيب عن أهداف هامة نتيجة لذلك. توفير array(s) جسم قراءات الإنتاجية المتوسطة لأهداف متعددة عن طريق تضمين مختلف التقاط أجسام [الخاصة بعموم فوسفوريلاتيد tyrosine(s)، أوبيكويتين المضادة، إلخ] في مصفوفة صلبة (مثلالزجاج أو النيتروسليلوز). الأجسام المضادة الثانوية تقديم معلومات عن بروتينات محددة في شكل أليسا على أساس ساندويتش (الشكل 1). هذا التحليل يصبح أكثر قوة وذات الصلة بالمزيد من الأهداف ذات الأهمية أو المعرفة المسبقة هو مقيد15. والرمات-الصفائف القادرين على نطاق أوسع كما يمكن مقارنة الفسفرة، فضلا عن المبالغ العامة من بروتين مجموعة أوسع من الأهداف في تجربة واحدة وتوفير إجراء تقييم كمي تحسنت بشكل ملحوظ عبر الطيف الكتلي. هذا الأسلوب لا ينطبق على تحديد مواقع الفسفرة جديدة أو لم تكن معروفة سابقا.
يمكن استخدام البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي على نطاق واسع لتحديد مواقع محددة الفسفرة من البروتينات19. على الرغم من أن هذا الأسلوب يمكن تعداد آلاف من الأحداث بوستترانسلاشونال، فإنه يتطلب أجهزة مكلفة وأنابيب تجريبية مكرسة خبرة حسابية التي بعيدة عن متناول معظم الباحثين.
توفر صفيفات جسم قراءات متزامنة على قراءات البروتين المختلفة16. قد تكون هذه التغييرات في أوبيكويتيليشن بروتين (ubiquitin صفيف) أو الفسفرة. والميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا صفيف أنه يوفر معلومات هامة عن الحالة البيولوجية لمختلف المسارات البيولوجية المرتبطة بالخلية هام المعلمات (البروتين 53 كاتشين، p53، ومستقبلات تيروسين مؤنزم ومسارات داخل الخلايا) في نفس الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، من الممكن للجمع بين مختلف أنواع الصفيف لزيادة تغلغل التحليل (مثلاً، المبرمج وأوبيكويتين والفسفره). هذه القدرة على الجمع بين صفائف متعددة لتقييم مختلف التعديلات بوستترانسلاشونال في عدة عينات في وقت واحد في طريقة الوقت--وفعالة من حيث التكلفة التي لا تتطلب أجهزة معينة أو خبرة من ميزة كبيرة في القضية جسم صفائف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1045">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Odysee SA Imager</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Fluorescent Imager</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1.5 ml tube</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:195px;">Falkon (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td>wash buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tissue Culture dish 100mm</td>
			<td style="width:195px;">TRP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ICC Insulin syringe U100</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td>27G5/8,&#160; 1ml for needle treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY003B</td>
			<td>Human phospho MAPK array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY002B</td>
			<td>Human phospho kinase array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge Eppendorf 5430R</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">SpectraMAX M2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Absorbance reader for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IRDye 800CW Streptavidin</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">925-32230</td>
			<td>Streptavidin conjugate for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet</td>
			<td style="width:195px;">NuAire</td>
			<td style="width:119px;">NU-425-400</td>
			<td>Tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F60</td>
			<td>sonicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Rocking platform shaker</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10860-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:195px;">NIH open source</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAS Institutie JMP&#174; 12.1.0 (64-bit)</td>
			<td style="width:195px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays

كثيرا ما تعامل مرضى السرطان مع لائحة شاذة من شبكات الفسفرة البروتين مع مثبطات كيناز تيروزين. معدلات الاستجابة التي تقترب من 85% من الأمور الشائعة. ولسوء الحظ، المرضى غالباً ما تصبح مقاوم للعلاج بتغيير بهم سبل توصيل الإشارات. تطبيق التنميط التعبير مع [ميكروارس] يمكن التعرف التغيرات في مستوى مرناً إجمالاً، والبروتيوميات يمكن التعرف على التغييرات الشاملة في مستويات البروتين، أو يمكن تحديد البروتينات المشاركة، ولكن نشاط توصيل الإشارة لا يمكن إنشاء مسارات باستجواب تعديلات بوستترانسلاشونال من البروتينات. نتيجة لذلك القدرة على تحديد سواء علاج من تعاطي المخدرات بنجاح أو ما إذا كانت قد نشأت المقاومة، أو القدرة على تميز أي تغييرات في مسارات الإشارات، تحديا هاما سريرية. هنا، نحن نقدم شرحاً مفصلاً لجسم صفائف كأداة يمكن أن تحدد التعديلات المنظومة في مختلف التعديلات بوستترانسلاشونال (مثلاً، الفسفرة). واحدة من مزايا استخدام صفائف جسم يتضمن إمكانية الوصول (صفيف لا تتطلب أي خبير في البروتيوميات أو معدات مكلفة)، والسرعة. توفر صفيفات استهداف مجموعة من التعديلات بوستترانسلاشونال هو القيد الرئيسي. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون النهج غير منحازة (فوسفوبروتيوميكس) أكثر مناسبة لاكتشاف الرواية، بينما جسم الصفائف مثالية للأهداف التي تميز على نطاق واسع.

للتحقيق في تأثير المقاومة TKI على سبل توصيل الإشارات في خطوط الخلايا، حللت العينات الأربع. نموذج عنصر تحكم واحد (H3255r1) و 3 خطوط الخلايا TKI المقاوم (H3255r2-4) (الشكل 2) تتصل بالقالب أضداد موضعية (الشكل 3). أعدت جميع العينات 4 باستخدام هذا البروتوكول. ت...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

نقدم هنا، بروتوكولا لجسم صفائف لتحديد التغييرات في مسارات الإشارات في مختلف النماذج الخلوية. هذه التغييرات، ناجمة عن المخدرات/نقص/فائقة-فيوليت الضوء/الإشعاع، أو عن أوفيريكسبريشن/دوونريجوليشن/بالضربة القاضية، مهمان لنماذج مختلفة من المرض، ويمكن أن تشير إلى ما إذا كان علاج تكون فعالة، أو يمكن تحديد آليات للمخدرات المقاومة.

تقييم للمقاومة إلى تيروزين كيناز مثبطات تجواب مسارات توصيل الإشارات بجسم صفائف

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الانزعاجات في شبكات الإشارة التي يمكن أن تسبب نمو السرطان أو تطوير مقاومة علاجات محددة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن توفر تغذية مرتدة سريعة وموثوقة على حالة الفوسفور من شبكات متعددة التي يتم تحريرها في كثير من الأحيان في السرطان. ويمتد تأثير هذه التقنية على علاج السرطانات المقاومة للأدوية لأن تحديد التعديلات والتعديلات اللاحقة للترجمة يمكن أن يوضح التغيرات في نشاط مسار تحويل الإشارات.في حين أن هذه التقنية تستخدم في الفسفر، يمكن أيضا أن تستخدم للنظر في التعديلات الأخرى بعد الترجمة مثل جليكوسيل وجليكيتيشن. تبدأ بشطف الخلايا المستزرعة بين عشية وضحاها ثلاث مرات مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع الحرص على إزالة كل من برنامج تلفزيوني بعد الغسيل الماضي. بعد ذلك، إضافة الحجم المناسب من العازلة تحلل من مجموعة تحليل البروتين واستخدام مكشطة الخلية لفصل الخلايا.اجرِدُ حل الخلية الناتجة 10 مرات تقريبًا قبل نقل مرة واحدة على الأقل إلى الخلايا السابعة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية مع اهتزاز. ثم قم بتحميل الليسات إلى حقنة مجهزة بإبرة قياس 27 وpiratesate والاستغناء عن العينة 10 مرات لتهي أغشية الخلايا.عندما أغشية الخلايا قد تعطلت تماما، الطرد المركزي وlysate ونقل sunatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر لتحديد كمية البروتين الكلي اللاحقة وفقا للبروتوكولات القياسية. لإجراء مقايسة فوسفوكيناز الإنسان، استخدم أولاً ملاقط مسطحة الشكل لوضع غشاء صفيف واحد في كل بئر من علبة متعددة الآبار تحتوي على ميليلترين من عازلة صفيف طازجة معدة واحدة في البئر مع أعداد الأغشية التي تواجه ما يصل. عند الغمر ، ستختفي الصبغة على الغشاء.غطي الصينية بغطاء وحضن الأغشية على منصة هزازة شاكر لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الحضانة منع، تمييع كل عينة lysate إلى 50 إلى 100 ميكروغرام من تركيز البروتين في حجم أقصى 334 ميكرولترات من العازلة تحلل وجلب الحجم النهائي من عينة البروتين المستخرج تصل إلى 1.5 ملليلتر مع عازلة صفيف جديد. المقبل، بعناية الطامح العازلة صفيف من كل بئر من علبة متعددة واحتضان الأغشية مع 1.5 ملليلتر من عينة البروتين في جيدا بين عشية وضحاها في درجتين إلى ثماني درجات مئوية على شاكر منصة هزاز.في صباح اليوم التالي، قم بنقل كل مجموعة بعناية إلى حاويات بلاستيكية فردية تحتوي على 20 ملليلترًا من عازل الغسيل لمدة ثلاث غسيلات لمدة 10 دقائق على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير، إضافة 20 ميكرولترات من مناسبة تشكيلها كوكتيل الأجسام المضادة إلى مليلتر اثنين من العازلة صفيف، اثنين في بئر، وبعناية لطخة الحافة السفلى من كل غشاء على منشفة ورقية لإزالة أي العازلة غسل الزائدة. ثم ضع كل صفيف مرة أخرى في البئر المناسب من علبة الأجسام المضادة واغطي الصينية لاحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز.في نهاية الحضانة، نقل بعناية كل مجموعة في حاوية بلاستيكية جديدة ثمانية من 11 سنتيمترا تحتوي على 20 ملليلتر من عازلة غسل لمدة ثلاثة 10 دقيقة يغسل كما أظهرت للتو. بعد الغسيل الأخير، أضف ملليلترًا واحدًا من محلول الفجل بيروكسيديز الحصان streptavidin المناسب لكل بئر من علبة الآبار المتعددة وارجع الأغشية إلى آبارها المناسبة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، ضع كل غشاء بين قطعتين من ورقة تصفية خمسة ملليمتر لإزالة أي العازلة الزائدة واحتضان الأغشية المجففة مع حل الكشف عن بيروكسيديز الفجل الحصان المناسب لمدة ثلاث دقائق.ثم ضع الأغشية في واقيات ورقة بلاستيكية واضحة فردية للتصوير اللاحق. لتقييم تعبير التيروزين كيناز المستقبلات في كل عينة، افتح الصور في برنامج مناسب لمعالجة الصور مثل Image J وحدد Edit وVert من القوائم المنسدلة المناسبة لعكس البقع السوداء على الخلفية البيضاء للصورة إلى بقع بيضاء على خلفية سوداء. بعد ذلك، استخدم الأداة البيضاوية لتطويق زوج واحد من النقاط البيضاء على لطخة النقطة وحدد تحليل وقياس لفتح نافذة جديدة تعرض القيم للمنطقة المحددة تلقائيًا.ثم ضع نقطة سهم الماوس في وسط البيضاوي واسحب المنطقة الدائرية حول منطقة النقطة التالية حتى يتم قياس جميع النقاط ذات الاهتمام. في هذه التجربة التمثيلية، تم تحليل آثار مقاومة مثبطات التيروزين كيناز على مسارات نقل الإشارة في عنصر تحكم واحد في ثلاثة خطوط خلايا مقاومة مثبطات التيروزين كيناز. تم اختيار ستة بروتينات فوسفو مع نشاط تفاضلي وتم تحديد الكثافة النسبية للعديد من البروتينات المرشحة في كل خط خلية.كما يتضح من خريطة الحرارة، يمكن بعد ذلك توليد قراءة شبه كمية للتغيرات في فوسفوريل البروتين من بروتينات تحويل الإشارة الهامة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تبدأ بالخلايا الصحية والتقسيم النشط لأن الضغوطات قد تحفز على تغييرات في نشاط مسار نقل الإشارة. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل PCR الرقمية و المناعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل هل تؤدي التغييرات في الفسفر إلى تنشيط عوامل النسخ؟بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في بيولوجيا السرطان لاستكشاف التغييرات الأساسية في التعديل اللاحق للبروتينات مما يؤدي إلى ظهور دواء شخصي للمرضى المصابين بالسرطان. لا ننسى أن العمل مع خطوط الخلايا السرطانية هو خطير للغاية لذلك تأكد من استخدام تقنيات معقمة، والحذر عند التخلص من الحادة وارتداء معطف المختبر في جميع الأوقات.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

تنبيغ-زرع نموذج الفأر من مرض تكاثر نقوي

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

توليد نماذج خلية سرطان البروستاتا لمقاومة دوسيتاكسيل عامل مكافحة الانقسامية

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

التقييم السريري بيواكتيفيتي OT48 الكومارين السرطان الماغنيسيوم وفحوصات تشكيل مستعمرة، وتكثيفها الزرد

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

التقوية لكفاءة جسم السرطان بالعقاقير أنتينيوبلاستيك: الكشف عن التآزر جسم-المخدرات باستخدام معادلة الجمع بين مؤشر

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

تقييم المشاركة المستهدفة الخلوية من قبل SHP2 (PTPN11) مثبطات Phosphatase

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...