Name: assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00
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Wir sind dankbar für die großzügige finanzielle Unterstützung von Lawrence J. Ellison Institut für Transformative Medizin der USC (ein Geschenk an David Agus). Wir freuen uns über die Unterstützung der Herbst Beemer und Lisa Flashner führt zu der Generation und Veröffentlichung dieses Manuskriptes. Wir danken Laura Ng für ihre administrative Unterstützung.

(1) Proteingewinnung
<ol><li>Platte 5 x 106 Zellen auf einer 10 mm Gewebekultur Platte (oder Kolben) in einer Gewebekultur-Haube. Zählen der Zellen zum Zeitpunkt der Beschichtung mit einem automatischen Zelle Zähler oder Hemocytometer. Alternativ, schätzen Sie die Zellzahl.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen gewachsen auf 10 mm Platte (oder Kolben) gründlich 3 X 10 ml von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4). Achten Sie darauf, alle PBS zu entfernen, bevor Sie Hinzufügen des Lyse-Puffers.<...

<ol>
	<li>Knauer, D. J., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+biological+activity+of+multiplication-stimulating+activity+by+binding+to+its+carrier+protein.">Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).</li><li>Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin+inhibits+tyrosine+phosphorylation+by+the+cyclic+nucleotide-independent,+transforming+protein+kinase,+pp60src.">Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).</li><li>Di Fiore, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+EGF+receptor+confers+an+EGF-dependent+transformed+phenotype+to+NIH+3T3+cells.">Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells.</a> Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).</li><li>Maguire, H. C., Greene, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitor+as+a+novel+signal+transduction+and+antiproliferative+agent:+prostate+cancer.">Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).</li><li>Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Effectiveness+of+EGFR-TKIs+versus+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer:+a+meta-analysis].">[Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis].</a> Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+turning+point+in+cancer+research:+sequencing+the+human+genome.">A turning point in cancer research: sequencing the human genome.</a> Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).</li><li>Barinaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DoE+provides+funds+for+human+genome+sequencing.">DoE provides funds for human genome sequencing.</a> Nature. 331 (6152), 103 (1988).</li><li>Lander, E. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+Pan-Cancer+analysis+project.">The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li><li>Carlson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing:+The+Next+Iteration+of+Personalized+Medicine:+Next+generation+sequencing,+along+with+expanding+databases+like+The+Cancer+Genome+Atlas,+has+the+potential+to+aid+rational+drug+discovery+and+streamline+clinical+trials.">Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials.</a> Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).</li><li>Huang, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+antibody+arrays:+a+promising+tool+to+identify+molecular+targets+for+drug+discovery.">Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).</li><li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics.">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).</li><li>Rani, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+changes+in+phosphorylation+of+receptor+tyrosine+kinases:+antibody+arrays.">Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays.</a> Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).</li><li>Kani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JUN-Mediated+Downregulation+of+EGFR+Signaling+Is+Associated+with+Resistance+to+Gefitinib+in+EGFR-mutant+NSCLC+Cell+Lines.">JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).</li><li>Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+the+control+of+gene+expression.">Signal transduction and the control of gene expression.</a> Science. 295 (5556), 813-818 (2002).</li><li>Rikova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+phosphotyrosine+signaling+identifies+oncogenic+kinases+in+lung+cancer.">Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.</a> Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).</li><li>Chen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+stage+and+clinical/prognostic+factors+for+colon+and+rectal+cancer+from+SEER+registries:+AJCC+and+collaborative+stage+data+collection+system.">Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system.</a> Cancer. 120, 3793-3806 (2014).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Ward, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Grouping+to+Optimize+an+Objective+Function.">Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function.</a> Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Griffin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+quantitative,+automated+analysis+of+protein+glycosylation.">Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation.</a> Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ubiquitin+target+proteins+using+cell-based+arrays.">Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).</li><li>McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia,+oxidative+stress+and+inflammation.">Hypoxia, oxidative stress and inflammation.</a> Free Radical Biology and Medicine. , (2018).</li></ol>

Ansätze, die viele biologische anzeigen zu kombinieren sind von Natur aus eine genauere Darstellungen der zellulären Maschinerie in einem Experiment durchgeführt. Das Aufkommen des Phospho-Antikörper Arrays ermöglicht eine schnelle Charakterisierung des Musters der Änderungen, die informativer als der Änderungsstand jeder einzigen Proteins werden kann. Die allgemeine Workflow für die Anwendung des Phospho-Antikörper Arrays basiert auf einer Änderung in Serin, Threonin oder Tyrosin. Dieses Beispiel konzentriert ...

Die klinische Umsetzung von gezielten Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) hat Krebsbehandlung umgewandelt, indem Ärzte mit wirksame Instrumente, um die spezifische Proteine gezielt diese Fahrt neoplastische Transformation. Diese Verbindungen hemmen oder blockieren die Phosphorylierung von Proteinen gezielt durch Tyrosin-Kinasen1,2. TKIs wurden teilweise entwickelt, weil genetische Veränderungen in verschiedenen wichtigen Gene Signalisierung ausreichen, um Laufwerk Krebs Initiierung und Progression [z. B.epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), protoonkogenproduktes Tyrosin-Protein Kinase Src (SRC), BCR-ABL und menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)]3,4. Die Auswirkungen der TKIs auf den Zellzyklus-5 und der molekularen Signalisierung Wege6 stellt eine Transformation von der ungezielte Molekular geführte Krebsbehandlung dar. Der entscheidende Vorteil von TKIs versus Chemotherapie ist die erhöhte Response-Raten und die geringere Gefahr der Toxizität auf gesunde Zellen7. Infolgedessen hat es Aufmerksamkeit auf die Erforschung und Entwicklung neuartiger TKIs erhöht.
Zugang zu den Ergebnissen der Genom-Sequenzierung mit dem Human Genome Project8,9,10 begann und bis heute mit verschiedenen nächsten Generation (NextGen) Krebs Sequenzierung Bemühungen [z.B., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Dies inspirierte viele experimentelle Methoden, die gleichzeitige informieren über Tausende von Genen und/oder geben unvoreingenommene Schnappschüsse von Genen oder Proteinen, die durch biologische Störungen13moduliert. Da die Verordnung der zellulären Funktion auf mehreren Ebenen aus der Transkription von Genen, die Post-translationale Modifikation von Proteinen und deren Aktivität auftritt wird ein vollständiges Verständnis der Ereignisse steuern die zelluläre Funktion Schließlich erfordern Sie eine Integration von Daten aus verschiedenen biologischen auslesen. Die Fähigkeit, die Boten-RNA (mRNA) Pegel Tausender Gene mit einer einzelligen gen Auflösung überwachen, hat die Möglichkeit, Rückschlüsse auf die Genfunktion und Interaktionen im Maßstab des gesamten Genoms machen erhöht. Die Interpretation der Gen-Expression-Arrays werden jedoch immer von Natur aus unvollständig ohne die Integration von anderen Ebenen der Verordnung: nämlich die proteingehalte Ausdruck, die Protein Modifikation Staaten und das Post-translationale Protein Änderungen (Phosphorylierung, Ubiquitylation, Methylierung, etc.). Hier beschreiben wir die Nützlichkeit des Antikörper-Arrays als Mittel zur Post-translationalen Modifikationen wichtiger Signalisierung Komponenten in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Experiment14,15, zu befragen 16.
Phospho-Antikörper-Arrays können eingesetzt werden, zu unterscheiden und zu Änderungen in den Signal Transduction Bahnen16zu analysieren. Diese können durch eine genetische Veränderung oder Behandlungen von Zelllinien mit Kinase-Inhibitoren, Chemotherapeutika, Belastungen durch Glukose Entbehrung, Hypoxie oder Serum Hunger entstehen. Note, Resistenzen oder ein bestimmtes Gen kann up- oder Herabregulation auch Änderungen im Signal Transduction Bahnen17führen.
Resistenzen, entstehen beispielsweise durch Mutationen des Drug Targets Empfindlichkeit zu vermeiden. Bei Lungenkrebs, bekannt EGFR-Mutationen Rendern den Krebs zu bestimmten TKIs stoßunempfindlich, aber anfälliger für andere. Bei der Mutation17kann Alternative Signalwege aktiviert werden. Als eine breitere Anwendung zur Identifizierung der Transduktion Signalwege Widerstand und Hypoxie usw.beteiligt Phospho-Antikörper Arrays bieten einen besseren Einblick in und folglich zu verstehen, die Mechanismen beteiligt.
Technologien, die Bewertung der Protein Änderungen darstellen einen wichtigen Bestandteil der Systembiologie, weil sie oft eine regulatorische Funktion, z. B. Modulation der Aktivität eines Enzyms oder die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen dienen. Die Bedeutung der Post-translationalen Modifikationen wird durch die Rolle des Protein-Phosphorylierung in fast alle extrazellulären ausgelöste Signal Transduction Bahnen18dargestellt. Traditionell, konnte die Identifizierung der Kinasen oder über den Status der Phosphorylierung von Proteinen auch von Western-Blot Analyse ermittelt werden, vor allem, wenn die Forscher nur 1 – 5 Ziele interessiert ist. Aber Western Blots sind sehr wählerisch und Vorkenntnisse voreingenommen sein können und möglicherweise verpassen wichtige Ziele als Ergebnis. Antikörper-Arrays bieten eine Medium-Durchsatz Auslesen der mehrere Ziele durch das Einbetten von verschiedenen Aufnahme-Antikörper [Pan-spezifische phosphorylierten Tyrosine(s), Anti-Ubiquitin usw.]auf einer festen Matrix (z.B., Glas oder Nitrozellulose). Sekundärantikörper geben Auskunft über bestimmte Proteine in einem Sandwich-basierte ELISA-Format (Abbildung 1). Dieser Assay wird leistungsfähiger und relevant wie mehr Ziele von Interesse sind oder der Vorkenntnissen nur15 ist. Die Phospho-Arrays sind breiter einsetzbar, da sie können Phosphorylierung sowie allgemeine Mengen des Proteins eine breitere Palette von Zielen in einem Experiment zu vergleichen und eine deutlich bessere Quantifizierung über Massenspektrometrie bieten. Dieses Verfahren gilt nicht für die Identifizierung von neuen oder bisher unbekannten Phosphorylierung Websites.
Große Massen Spektrometrie-basierte Proteomics könnte eingesetzt werden, um spezifische Phosphorylierung Standorte von Proteinen19. Obwohl diese Technik Tausende von Post-translationalen Veranstaltungen auflisten kann, erfordert es teuer Instrumentierung, engagierten experimentellen Pipelines und eine rechnerische Expertise, die außerhalb der Reichweite der meisten Forscher sind.
Antikörper-Arrays bieten eine gleichzeitige Anzeige auf verschiedenen Protein Auslesen16. Diese dürfen Änderungen im Protein Ubiquitylation (Ubiquitin Array) oder Phosphorylierung. Der entscheidende Vorteil dieser Array-Technologie ist, dass es wichtige Rückmeldungen auf den biologischen Zustand verschiedener biologischer Signalwege zugeordnet wichtige zellenparameter (Protein p53, 53 kDa, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und intrazellulären Signalwege) bietet gleichzeitig. Darüber hinaus ist es möglich, verschiedene Arraytypen um das Eindringen von einem Assay (z.B., Apoptose und Ubiquitin und Phosphorylierung) erhöhen zu kombinieren. Diese Fähigkeit, mehrere Arrays um verschiedene Post-translationalen Änderungen in mehreren Proben gleichzeitig in einer Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Weise zu bewerten, die nicht spezielle Instrumente oder Know-how erfordert zu kombinieren ist ein wesentlicher Vorteil im Fall der Antikörper-Arrays.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1045">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Odysee SA Imager</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Fluorescent Imager</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1.5 ml tube</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:195px;">Falkon (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td>wash buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tissue Culture dish 100mm</td>
			<td style="width:195px;">TRP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ICC Insulin syringe U100</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td>27G5/8,&#160; 1ml for needle treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY003B</td>
			<td>Human phospho MAPK array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY002B</td>
			<td>Human phospho kinase array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge Eppendorf 5430R</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">SpectraMAX M2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Absorbance reader for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IRDye 800CW Streptavidin</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">925-32230</td>
			<td>Streptavidin conjugate for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet</td>
			<td style="width:195px;">NuAire</td>
			<td style="width:119px;">NU-425-400</td>
			<td>Tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F60</td>
			<td>sonicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Rocking platform shaker</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10860-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:195px;">NIH open source</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAS Institutie JMP&#174; 12.1.0 (64-bit)</td>
			<td style="width:195px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays

Krebspatienten mit einer aberranten Regulierung der Protein-Phosphorylierung-Netzwerke sind oft mit der Tyrosin-Kinase-Inhibitoren behandelt. Annähernd 85 % Response-Raten sind häufig. Leider werden Patienten oft durch eine Änderung ihrer Signalwege Transduktion refraktär gegenüber der Behandlung. Eine Implementierung der Expression profiling mit Microarrays kann insgesamt mRNA-Ebene Änderungen erkennen und Proteomics erkennen die allgemeinen Änderungen im Protein-Ebene oder erkennen die Proteine beteiligt, aber die Aktivität der Signaltransduktion Wege können nur durch Vernehmung Post-translationalen Modifikationen der Proteine hergestellt werden. Infolgedessen ist die Fähigkeit, festzustellen, ob eine medikamentöse Behandlung erfolgreich ist oder ob Widerstand entstand, oder die Fähigkeit, Änderungen in der Signalwege charakterisieren eine wichtige klinische Herausforderung. Hier bieten wir eine ausführliche Erläuterung der Antikörper-Arrays als ein Werkzeug, das systemweite Änderungen in verschiedenen Post-translationalen Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) identifizieren kann. Einer der Vorteile der Verwendung von Antikörper-Arrays enthält ihre Zugänglichkeit (ein Array entweder ein Experte für Proteomics oder teure Ausrüstung erfordert keine) und Geschwindigkeit. Die Verfügbarkeit von Arrays, die Ausrichtung auf eine Kombination von Post-translationalen Modifikationen ist die größte Einschränkung. Darüber hinaus möglicherweise unvoreingenommene Ansätze (Phosphoproteomics) besser geeignet für die neuartige Entdeckung, während Antikörper Arrays ideal für die am weitesten verbreitete zeichnet sich Ziele sind.

Um die Wirkung von TKI-Resistenz auf Transduktion Signalwege in Zelllinien zu untersuchen, wurden vier Proben analysiert. Eine Kontrollprobe (H3255r1) und 3 TKI-resistente Zelllinien (H3255r2-4) (Abbildung 2) bezogen sich auf die vor Ort Antikörper-Vorlage (Abbildung 3). Alle 4 Proben waren bereit, unter Verwendung dieses Protokolls. Für die Demonstration der Analyse der Antikörper-Arrays (Abbildung 4</str...

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Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Antikörper-Arrays zu Veränderungen im Signalwege in verschiedenen zellulären Modellen zu identifizieren. Diese Veränderungen, verursacht durch Medikamente/Hypoxie/ultra-violet Licht/Strahlung oder durch Überexpression/Herabregulation/Knockouts, sind wichtig für die verschiedenen Krankheitsmodelle und können angeben, ob eine Therapie wirksam werden oder Mechanismen der Drogen identifizieren kann Widerstand.

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über Störungen in Signalnetzwerken zu beantworten, die Krebswachstum oder die Entwicklung von Resistenzen gegen bestimmte Therapien verursachen können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnelle und zuverlässige Rückmeldungen über den Phosphorylierungszustand mehrerer Netzwerke liefern kann, die häufig bei Krebs dereguliert werden. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von medikamentenresistenten Krebsarten, da die Identifizierung von Veränderungen und posttranslationalen Modifikationen Veränderungen in der Signaltransduktionswegaktivität aufklären kann.Während diese Technik auf Phosphorylierung verwendet wird, Kann es auch verwendet werden, um andere post-translationale Modifikationen wie Glykosylierung und Ubiquitylierung zu betrachten. Beginnen Sie damit, über Nacht kultivierte Zellen dreimal gründlich zu spülen, wobei 10 Milliliter PBS darauf achten, alle PBS nach der letzten Wäsche zu entfernen. Als Nächstes fügen Sie das entsprechende Volumen des Lysepuffers aus dem Protein-Assay-Kit hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen.Trituieren Sie die resultierende Zelllösung etwa 10 Mal, bevor Sie mindestens ein mal 10 auf die siebten Zellen in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen. Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit Schütteln. Dann laden Sie das Lysat in eine Spritze mit einer 27-Spur-Nadel und Aspirat und geben Sie die Probe 10 Mal, um die Zellmembranen zu scheren.Wenn die Zellmembranen vollständig gestört sind, zentrifugieren Sie das Lysat und übertragen Sie den Überstand in ein neues 1,5 Milliliter-Rohr zur anschließenden Gesamtproteinquantifizierung nach Standardprotokollen. Um einen humanen Phosphokinase-Test durchzuführen, verwenden Sie zunächst eine flache Pinzette, um eine Arraymembran in jeden Bohrwert eines Vier-Well-Multi-Trays mit zwei Millilitern frisch zubereitetem Arraypuffer eins pro Brunnen mit der Anzahl der nach oben gerichteten Membranen zu platzieren. Beim Eintauchen verschwindet der Farbstoff auf der Membran.Bedecken Sie das Tablett mit einem Deckel und bebrüten Sie die Membranen auf einem Schaukelplattform-Shaker 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Während dieser blockierenden Inkubation jede Lysatprobe auf eine Proteinkonzentration von 50 bis 100 Mikrogramm in einem maximalen Volumen von 334 MikroliterLysepuffer verdünnen und das Endvolumen der extrahierten Proteinprobe mit frischem Arraypuffer auf 1,5 Milliliter erhöhen. Als nächstes saugen Sie vorsichtig den Arraypuffer aus jedem Brunnen des Multi-Trays und bebrüten die Membranen mit 1,5 Millilitern Proteinprobe pro Brunnen über Nacht bei zwei bis acht Grad Celsius auf einem Schaukelplattform-Shaker.Am nächsten Morgen jedes Array sorgfältig in einzelne Kunststoffbehälter mit 20 Milliliter Waschpuffer für drei 10-minütige Wäschen auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur übertragen. Nach der letzten Wäsche 20 Mikroliter des entsprechenden rekonstituierten Antikörpercocktails zu zwei Millilitern Arraypuffer, zwei pro Brunnen, hinzufügen und vorsichtig den unteren Rand jeder Membran auf ein Papiertuch bleichen, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen. Legen Sie dann jedes Array wieder in den entsprechenden Brunnen des Antikörperfachs und bedecken Sie das Tablett für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform.Übertragen Sie am Ende der Inkubation jedes Array sorgfältig in einen neuen acht mal 11 Zentimeter großen Kunststoffbehälter mit 20 Milliliter Waschpuffer für drei 10-Minuten-Waschungen, wie gerade gezeigt wurde. Nach der letzten Wäsche einen Milliliter einer geeigneten Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Lösung in jeden Brunnen des Multi-Well-Trays geben und die Membranen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in ihre entsprechenden Brunnen zurückbringen. Legen Sie am Ende der Inkubation jede Membran zwischen zwei Stücke von fünf Millimeter Filterpapier, um überschüssigePuffer zu entfernen und die getrockneten Membranen mit einer geeigneten Pferderettich-Peroxidase-Erkennungslösung für drei Minuten zu bebrüten.Legen Sie die Membranen dann für die nachfolgende Bildgebung in einzelne klare Kunststoffplattenprotektoren. Um den Rezeptor-Tyrosinkinase-Ausdruck in jeder Probe zu bewerten, öffnen Sie die Bilder in einem geeigneten Bildverarbeitungsprogramm wie Bild J und wählen Sie Bearbeiten und Invertieren aus den entsprechenden Dropdown-Menüs aus, um die schwarzen Flecken auf dem weißen Hintergrund des Bildes in weiße Flecken auf einem schwarzen Hintergrund umzukehren. Verwenden Sie als Nächstes das Werkzeug Oval, um ein Paar weißer Punkte auf dem Punktfleck einzukreisen, und wählen Sie Analysieren und Messen aus, um automatisch ein neues Fenster zu öffnen, in dem die Werte für den ausgewählten Bereich angezeigt werden.Platzieren Sie dann den Punkt des Mauspfeils in die Mitte des Ovals und ziehen Sie den kreisförmigen Bereich um den nächsten Punktbereich, bis alle Sehenswürdigkeiten gemessen wurden. In diesem repräsentativen Experiment wurden die Auswirkungen der Tyrosinkinase-Inhibitorresistenz auf Signaltransduktionswege in einer Kontrolle in drei Tyrosinkinase-Inhibitor-resistenten Zelllinien analysiert. Es wurden sechs Phosphoproteine mit Differentialaktivität ausgewählt und die relative Intensität für mehrere Kandidatenproteine in jeder Zelllinie bestimmt.Wie die Heatmap zeigt, könnte dann eine semiquantitative Auslesung der Veränderungen der Proteinphosphorylierung wichtiger Signaltransduktionsproteine erzeugt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, mit gesunden und aktiv teilenden Zellen zu beginnen, da Stressoren Veränderungen in der Signaltransduktionswegaktivität induzieren können. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie digitale PCR und Immunoblotting verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Veränderungen der Phosphorylierung zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führen?Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher in der Krebsbiologie geebnet, grundlegende Veränderungen in der posttranslationalen Modifikation von Proteinen zu erforschen, die zum Aufkommen personalisierter Medizin für Krebspatienten führen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krebszelllinien extrem gefährlich ist, also achten Sie darauf, aseptische Techniken zu verwenden, Vorsicht beim Entsorgen von Schärfen und tragen Sie einen Labormantel zu jeder Zeit.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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