Name: assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

. אנחנו אסירי תודה על תמיכה כספית נדיבה של לורנס ג'יי אליסון המכון טרנספורמטיבי לרפואה של אוניברסיטת דרום קליפורניה (מתנה דוד בני אהרוני). אנו מעריכים את התמיכה של סתיו בימר, ליסה Flashner אשר להוביל הדור והפרסום של כתב היד הזה. אנו מודים Ng לורה על שלה תמיכה מנהלתית.

1. חלבון החילוץ
<ol><li>צלחת 5 x 10 תאים6 על הלוחית תרביות רקמה 10 מ מ (או הבקבוק) בשכונה תרביות רקמה. לספור את התאים בזמנו של ציפוי עם מונה תא אוטומטית או hemocytometer. לחלופין, מעריכים את ספירת התאים.</li>
	<li>לשטוף את התאים גדל על צלחת 10 מ מ (או הבקבוק) ביסודיות 3 x 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) (ה-pH = 7.4). הק?...

<ol>
	<li>Knauer, D. J., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+biological+activity+of+multiplication-stimulating+activity+by+binding+to+its+carrier+protein.">Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).</li><li>Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin+inhibits+tyrosine+phosphorylation+by+the+cyclic+nucleotide-independent,+transforming+protein+kinase,+pp60src.">Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).</li><li>Di Fiore, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+EGF+receptor+confers+an+EGF-dependent+transformed+phenotype+to+NIH+3T3+cells.">Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells.</a> Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).</li><li>Maguire, H. C., Greene, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neu+(c-erbB-2)+oncogene.">The neu (c-erbB-2) oncogene.</a> Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).</li><li>Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+G(1)+arrest+induced+by+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+requires+up-regulation+of+p27(KIP1)+independent+of+MAPK+activity.">Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).</li><li>Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitor+as+a+novel+signal+transduction+and+antiproliferative+agent:+prostate+cancer.">Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).</li><li>Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Effectiveness+of+EGFR-TKIs+versus+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer:+a+meta-analysis].">[Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis].</a> Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+turning+point+in+cancer+research:+sequencing+the+human+genome.">A turning point in cancer research: sequencing the human genome.</a> Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).</li><li>Barinaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DoE+provides+funds+for+human+genome+sequencing.">DoE provides funds for human genome sequencing.</a> Nature. 331 (6152), 103 (1988).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li><li>McCain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome+atlas:+new+weapon+in+old+war?.">The cancer genome atlas: new weapon in old war?.</a> Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).</li><li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+Pan-Cancer+analysis+project.">The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li><li>Carlson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing:+The+Next+Iteration+of+Personalized+Medicine:+Next+generation+sequencing,+along+with+expanding+databases+like+The+Cancer+Genome+Atlas,+has+the+potential+to+aid+rational+drug+discovery+and+streamline+clinical+trials.">Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials.</a> Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).</li><li>Huang, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+antibody+arrays:+a+promising+tool+to+identify+molecular+targets+for+drug+discovery.">Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).</li><li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics.">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).</li><li>Rani, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+changes+in+phosphorylation+of+receptor+tyrosine+kinases:+antibody+arrays.">Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays.</a> Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).</li><li>Kani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JUN-Mediated+Downregulation+of+EGFR+Signaling+Is+Associated+with+Resistance+to+Gefitinib+in+EGFR-mutant+NSCLC+Cell+Lines.">JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).</li><li>Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+the+control+of+gene+expression.">Signal transduction and the control of gene expression.</a> Science. 295 (5556), 813-818 (2002).</li><li>Rikova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+phosphotyrosine+signaling+identifies+oncogenic+kinases+in+lung+cancer.">Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.</a> Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).</li><li>Chen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+stage+and+clinical/prognostic+factors+for+colon+and+rectal+cancer+from+SEER+registries:+AJCC+and+collaborative+stage+data+collection+system.">Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system.</a> Cancer. 120, 3793-3806 (2014).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Ward, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Grouping+to+Optimize+an+Objective+Function.">Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function.</a> Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Griffin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+quantitative,+automated+analysis+of+protein+glycosylation.">Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation.</a> Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ubiquitin+target+proteins+using+cell-based+arrays.">Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).</li><li>McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia,+oxidative+stress+and+inflammation.">Hypoxia, oxidative stress and inflammation.</a> Free Radical Biology and Medicine. , (2018).</li></ol>

גישות המשלבות המפרט ביולוגיים רבים הן ייצוגים מטבעו מדויקת יותר של מכונות הסלולר בניסוי שבוצעה. כניסתו של מערכים פוספו-נוגדן מאפשרת אפיון מהירה של התבנית של שינויים אשר עשוי להיות אינפורמטיבי יותר מאשר המצב השינוי של כל חלבון יחיד. תהליך העבודה הכללי עבור היישום של מערכים פוספו-נוגדן מבו...

יישום קליני מעכבי קינאז טירוזין יישוב (TKI) שינתה טיפול בסרטן על ידי מתן רופאים עם כלים אפקטיביים כדי למקד את החלבונים ספציפית את השינוי אמצעים כונן. תרכובות אלו לעכב או לחסום את זרחון של חלבונים ממוקד על ידי טירוזין kinases1,2. TKIs פותחו באופן חלקי בגלל שינויים גנטיים שונים מפתח איתות גנים מספיקים כדי נסיעה סרטן החניכה, התקדמות [למשל, גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), proto-oncogene חלבון טירוזין קינאז Src (SRC), BCR-ABL, קולטן גורם הגדילה באפידרמיס אנוש 2 (HER2)]3,4. השפעת TKIs על מחזור התא5 ו מולקולרית של איתות המסלולים6 מייצגת שינוי מן untargeted לטיפול בסרטן מולקולרי מודרכים. היתרון המפתח של TKIs לעומת כימותרפיה הוא את שיעורי ההיענות מוגברת לבין סיכון נמוך יותר של רעילות תאים בריאים7. כתוצאה מכך, שם גדל תשומת הלב על מחקר ופיתוח של רומן TKIs.
גישה על פי התוצאות רצף גנטי התחיל עם9,8,10 פרוייקט הגנום האנושי וממשיך כיום עם שונים הדור הבא (NextGen) סרטן רצף מאמצים [למשל, גנום הסרטן אטלס (TCGA)11,12]. זה נתן השראה מתודולוגיות ניסיוני רבים אשר מספקים מידע בו זמנית על אלפי גנים ו/או לספק תמונות לא משוחדת של גנים או חלבונים מווסת על ידי לפליטת ביולוגי13. מאז ברגולציה של הפונקציה הסלולר מתרחש ברמות מרובות, שעתוק של גנים על שינוי post-translational של חלבונים ופעילותם, הבנה מלאה של האירועים שליטה הפונקציה הסלולר יהיה בסופו של דבר דורשים שילוב של נתונים המפרט ביולוגיים שונים. היכולת לנטר את רמות RNA שליח (mRNA) של אלפי גנים עם רזולוציה תא בודד הגן גברה היכולת לגרום מסקנות על תפקוד הגן ואת האינטראקציות בקנה מידה הגנום כולו. עם זאת, הפרשנות של מערכים ביטוי גנים תמיד יהיה מטבעו לא שלם בלי השילוב של רמות אחרות של רגולציה: כלומר, רמות ביטוי חלבון הברית שינוי חלבון, החלבון post-translational שינויים (זרחון, ubiquitylation, מתילציה, וכו '). כאן, אנו מתארים את התועלת של נוגדן מערכים כאמצעי לחקור שינויים post-translational של מרכיבים חשובים איתות כפונקציה של מצבים שונים ניסוי אחת14,15, 16.
יכול להיות מועסק פוספו-נוגדן מערכים הבחנה וניתוח השינויים האות התמרה חושית מסלולים16. אלה יכולים לנבוע שינוי גנטי או טיפולים של שורות תאים עם מעכבי קינאז, chemotherapeutics, מתח נגרמת על ידי הרעבה קיפוח, היפוקסיה או סרום גלוקוז. הערה, תרופתיים או גנים ספציפיים למעלה - או downregulation יכולה גם לגרום לשינויים האות התמרה חושית מסלולים17.
עמידות לתרופות, למשל, יכול לנבוע מוטציות של המטרה סמים כדי למנוע רגישות. סרטן ריאות, ידועה EGFR מוטציות רינדור הסרטן insusceptible כדי TKIs מסוימות, אך יותר רגיש לאחרים. ניתן להפעיל חלופה מסלולי איתות על מוטציה17. כיישום רחבה יותר לצורך זיהוי מסלולים התמרה חושית אות מעורב ההתנגדות, היפוקסיה, וכו ', מערכים פוספו-נוגדן מספקים תובנה רבה יותר, וכתוצאה מכך הבנתו, המנגנונים המעורבים.
טכנולוגיות לאפשר הערכה של חלבון שינויים מייצגים מרכיב חשוב של ביולוגיה מערכתית כי הם משמשים לעתים קרובות פונקציה רגולטוריות כגון הכוח ויסות הפעילות של אנזים או את האינטראקציות פיזי בין חלבונים. חשיבות השינויים post-translational מודגם על-ידי התפקיד של זירחון חלבונים כמעט כל אות חוץ-תאית המופעלות התמרה חושית מסלולים18. באופן מסורתי, הזיהוי של kinases או של המצב זרחון של חלבונים יכול גם להיקבע על ידי ניתוח תספיג, במיוחד אם החוקר מעוניין רק 1 – 5 מטרות. עם זאת, שהכלים המערבי מאוד סלקטיבי, עלולים להיות מוטים לכיוון ידע מוקדם, עלולים לפספס מטרות חשובות כתוצאה מכך. נוגדנים array(s) לספק תפוקה בינונית מפרט. של החלקים מטרות מרובות על-ידי הטבעת שונים לכידת נוגדנים [tyrosine(s) phosphorylated פן ספציפי, אנטי-אוביקוויטין, וכו '] על מטריצה מוצק (למשל, זכוכית או ניטרוצלולוזה). נוגדנים משניים מספקים מידע אודות חלבונים ספציפיים בתבנית אליסה מבוסס-כריך (איור 1). זה וזמינותו הופכת חזקה יותר רלוונטי גם מטרות יותר עניין או ידע מוקדם הוא מוגבל15. פוספו-המערכים הם להפכה תעסוקה כפי שהם יכולים להשוות זרחון, כמו גם כללי בכמות החלבון של מגוון רחב יותר של מטרות בניסוי אחד לספק של כימות משופרת באופן משמעותי מעל ספקטרומטר מסה. טכניקה זו אינה ישימה עבור זיהוי אתרי זירחון חדשה או לא מוכרת.
יכול להיות מועסק פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה בקנה מידה גדול כדי לזהות אתרים ספציפיים זרחון של חלבונים19. למרות טכניקה זו ניתן למנות אלפים של אירועים post-translational, היא דורשת מכשור יקר, צינורות ניסיוני ייעודי, התמחות חישובית שנמצאים מעבר להישג רוב החוקרים.
נוגדן מערכי מספקים readout סימולטני של חלבונים שונים המפרט16. אלה עשויים להיות שינויים חלבון ubiquitylation (מערך אוביקוויטין) או זירחון. היתרון המפתח של טכנולוגיה זו מערך הוא שהיא מספקת משוב חשוב על מצב ביולוגי מסלולים ביולוגיים שונים הקשורים עם פרמטרים חשובים תא (חלבון של 53 kDa, p53, קולטן טירוזין kinases מסלולים תאיים) בעת ובעונה אחת. בנוסף, אפשרי לשלב סוגי מערכים שונים להגברת החדירה של assay (למשל, אפופטוזיס, אוביקוויטין, זרחון). זו היכולת לשלב מערכים מרובים כדי להעריך שונות post-translational שינויים מספר דגימות בו זמנית באופן זמן cost effective אינה דורשת מכשור מסוים או מומחיות הוא בעל יתרון משמעותי במקרה של נוגדן מערכים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1045">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Odysee SA Imager</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Fluorescent Imager</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1.5 ml tube</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:195px;">Falkon (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td>wash buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tissue Culture dish 100mm</td>
			<td style="width:195px;">TRP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ICC Insulin syringe U100</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td>27G5/8,&#160; 1ml for needle treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY003B</td>
			<td>Human phospho MAPK array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY002B</td>
			<td>Human phospho kinase array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge Eppendorf 5430R</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">SpectraMAX M2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Absorbance reader for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IRDye 800CW Streptavidin</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">925-32230</td>
			<td>Streptavidin conjugate for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet</td>
			<td style="width:195px;">NuAire</td>
			<td style="width:119px;">NU-425-400</td>
			<td>Tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F60</td>
			<td>sonicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Rocking platform shaker</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10860-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:195px;">NIH open source</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAS Institutie JMP&#174; 12.1.0 (64-bit)</td>
			<td style="width:195px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays

חולי סרטן תקנה aberrant של הרשתות זירחון חלבונים מטופלים לעיתים קרובות עם מעכבי קינאז טירוזין. שיעורי ההיענות מתקרב 85% נפוצים. למרבה הצער, המטופלים לעיתים קרובות להיות עקשן לטיפול על ידי שינוי מסלולים התמרה חושית שלהם אותות. יישום של פרופיל ביטוי עם מיקרו-מערכים ניתן לזהות את השינויים באופן כללי ברמת mRNA, פרוטאומיקס ניתן לזהות שינויים הכוללת את רמות החלבון או ניתן לזהות את החלבונים המעורבים, אך הפעילות של אותות מסלולים יכול להתבסס רק על ידי חוקר את השינויים post-translational של החלבונים. כתוצאה מכך, היכולת לזהות אם טיפול תרופתי הוא מוצלח או התנגדות התעוררו, או את היכולת לאפיין שינויים בהמסלולים איתות, הוא מהווה אתגר קליני חשוב. כאן, אנו מספקים הסבר מפורט של נוגדן מערכים ככלי אשר ניתן לזהות שינויים מערכתיים למגוון שינויים post-translational (למשל, זרחון). אחד היתרונות של השימוש במערכים נוגדן כולל נגישות (מערך אינה דורשת מומחה פרוטאומיקס או ציוד יקר) והמהירות שלהם. הזמינות של מערכים מיקוד שילוב של שינויים post-translational היא המגבלה העיקרית. בנוסף, גישות לא משוחדת (phosphoproteomics) עשוי להיות מתאים יותר עבור גילוי הרומן, ואילו מערכי נוגדנים הינם אידיאליים עבור המטרות מאופיין נרחב ביותר.

כדי לחקור את השפעת TKI ההתנגדות על האות התמרה חושית שבילים בשורות תאים, נותחו הארבעה. פקד אחד מדגם (H3255r1) ו- 3 שורות תאים עמידים TKI (H3255r2-4) (איור 2) היו קשורים אל התבנית נוגדן ספוט (איור 3). כל הדגימות 4 הוכנו תוך שימוש בפרוטוקול זה. Phosphoproteins שש עם פעי...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכים נוגדנים לזהות שינויים איתות המסלולים במודלים שונים של הסלולר. שינויים אלה, הנגרם על ידי תרופות/היפוקסיה/אולטרא-violet אור/קרינה, או על ידי ביטוי/downregulation/הסתרה, חשובים עבור מודלים שונים של המחלה, ניתן לציין אם טיפול יהיה יעיל או ניתן לזהות מנגנונים של סמים . התנגדות.

הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על הפרעה ברשתות איתות שיכול לגרום לצמיחה סרטן או התפתחות של עמידות לטיפולים ספציפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא יכולה לספק משוב מהיר ואמין על מצב זרחון של רשתות מרובות כי הם לעתים קרובות deregulated בסרטן. המשמעות של טכניקה זו משתרעת לכיוון טיפול של סרטן עמידים לתרופות כי זיהוי של שינויים ושינויים שלאחר התרגום יכול להבהר שינויים בפעילות מסלול התמרת אותות.בעוד טכניקה זו משמשת על זרחון, זה יכול לשמש גם כדי להסתכל על שינויים אחרים שלאחר התרגום כגון גליקוזילציה בכל מקום. התחל על ידי שטיפה יסודית של תאים מתורבתים לילה שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של PBS דואג להסיר את כל PBS לאחר הכביסה האחרונה. לאחר מכן, הוסיפו את הנפח המתאים של מאגר תיזה מערכת בדיקה של חלבונים ולהשתמש מגרד תאים כדי לנתק את התאים.טרייטוראט פתרון התא וכתוצאה מכך כ 10 פעמים לפני העברת לפחות פעם אחת 10 לתאים השביעיים לצינור 1.5 מיליליטר. דגירה התאים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות. לאחר מכן לטעון את lysate לתוך מזרק מצויד מחט מד 27 ולוותר ולחלק את המדגם 10 פעמים כדי לגנווט את קרום התא.כאשר קרום התא שובש לחלוטין, צנטריפוגה lysate ולהעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מיליליטר לכמות החלבון הכולל הבאים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לבצע בדיקת פוספוקינאז אנושית, השתמש תחילה בציוצים שטוחים כדי למקם קרום מערך אחד בכל באר של מגש רב-תכליתי בן ארבע בארות המכיל שני מיליליטר של מאגר מערך טרי אחד ל הבאר עם מספרי הממברנות הפונים כלפי מעלה. עם הטביעה, הצבע על הממברנה ייעלם.מכסים את המגש במכסה ודורגים את הממברנות על שייקר פלטפורמת נדנדה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך דגירה זו חסימה, לדלל כל מדגם lysate ל 50 עד 100 מיקרוגרם של ריכוז חלבון בנפח מרבי של 334 microliters של חיץ תזה ולהביא את הנפח הסופי של דגימת חלבון שחולצו עד 1.5 מיליליטר עם חיץ מערך טרי. לאחר מכן, שאפו בזהירות את חיץ המערך מכל באר של המגשים הרב-מגשיים והדגירה את הממברנות עם 1.5 מיליליטר של דגימת חלבון למשך לילה בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס על שייקר פלטפורמת נדנדה.למחרת בבוקר, להעביר בזהירות כל מערך לתוך מיכלי פלסטיק בודדים המכילים 20 מיליליטר של חיץ לשטוף במשך שלוש 10 דקות לשטוף על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המוסכם המתאים לשני מיליליטר של חיץ מערך, שניים ל הבאר, ונפחו בזהירות את הקצה התחתון של כל קרום על מגבת נייר כדי להסיר כל חיץ שטיפה עודף. לאחר מכן מניחים כל מערך בחזרה לתוך הבאר המתאימה של מגש הנוגדנים ומכסים את המגש עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה.בסוף הדגירה, מעבירים בזהירות כל מערך למיכל פלסטיק חדש באורך שמונה על 11 ס"מ המכיל 20 מיליליטר של חיץ שטיפה במשך שלוש שטיפות של 10 דקות כפי שהודגם זה בלבד. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון צנון סוס סטרפטוודין מתאים לכל באר של המגש רב הבאר ולהחזיר את הממברנות ל הבאר המתאימה שלהם עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים כל קרום בין שתי חתיכות של נייר מסנן חמישה מילימטר כדי להסיר כל חיץ עודף דגירה קרום מיובש עם פתרון זיהוי peroxidase צנון סוס המתאים במשך שלוש דקות.לאחר מכן מניחים את הממברנות לתוך מגיני יריעות פלסטיק ברורים בודדים להדמיה עוקבת. כדי להעריך את ביטוי הקולטן טירוזין קינאז בכל דגימה, פתח את התמונות בתוכנית עיבוד תמונה מתאימה כגון Image J ובחר ערוך והתהפך מהתפריטים הנפתחים המתאימים כדי להפוך את הכתמים השחורים על הרקע הלבן של התמונה לנקודות לבנות על רקע שחור. לאחר מכן, השתמש בכלי אליפסה כדי להקיף זוג אחד של נקודות לבנות על כתם הנקודה ובחר נתח ולמדוד כדי לפתוח באופן אוטומטי חלון חדש המציג את הערכים עבור האזור שנבחר.לאחר מכן מקם את הנקודה של חץ העכבר למרכז האליפסה וגרור את האזור המעגלי סביב אזור הנקודה הבא עד שכל נקודות העניין נמדדו. בניסוי מייצג זה, ההשפעות של עמידות מעכבי טירוזין קינאז על מסלולי ההטלה אות נותחו בבקרה אחת בשלושה קווי תאים עמידים מעכבי טירוזין קינאז. שישה חלבוני פוספו עם פעילות דיפרנציאלית נבחרו והעוצמה היחסית נקבעה עבור מספר חלבונים מועמדים בכל קו תא.כפי שהודגם על ידי מפת החום, קריאה כמותית למחצה על השינויים בזרחון החלבון של חלבונים חשובים להעתקת אותות יכולה להיווצר לאחר מכן. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתחיל עם תאים בריאים ומפרידים באופן פעיל כמו לחצים עלול לגרום לשינויים בפעילות מסלול התמרה אות. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון PCR דיגיטלי ואימונובלוטציה כדי לענות על שאלות נוספות כגון האם שינויים בזרחון מובילים להפעלת גורמי שעתוק?לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בביולוגיה של סרטן לחקור שינויים יסודיים בשינוי שלאחר התרגום של חלבונים המובילים ל הופעתה של רפואה מותאמת אישית לחולים עם סרטן. אל תשכח כי עבודה עם קווי תאים סרטניים הוא מסוכן מאוד כדי להיות בטוח להשתמש בטכניקות aseptic, זהירות בעת סילוק חדים ללבוש חלוק מעבדה בכל עת.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

דור של סרטן הערמונית תאים מודלים של ההתנגדות דוסטקסול סוכן אנטי mitotic

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...