Name: assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

Vi er takknemlige for den finansiell støtten av Lawrence J. Ellison Institute of Transformative Medicine av USC (en gave til David Agus). Vi setter pris på støtte fra høsten Beemer og Lisa Flashner som fører til generering og publisering av dette manuskriptet. Vi takker Laura Ng for hennes Administrativ støtte.

1. protein utvinning
<ol><li>Plate 5 x 106 celler på et 10 mm vev kultur plate (eller kolbe) i vev kultur hette. Telle celler ved plating med en automatisk celle teller eller hemocytometer. Alternativt, anslå celletall.</li>
	<li>Skyll celler dyrket på 10 mm plate (eller kolbe) grundig 3 x med 10 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) (pH = 7.4). Husk å fjerne alle PBS før du legger lyseringsbuffer. Merk: Lyseringsbuffer tilbys vanligvis med kit. Hvis ikke, bruk en radioimmunoprecipitation analysebuf...

<ol>
	<li>Knauer, D. J., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+biological+activity+of+multiplication-stimulating+activity+by+binding+to+its+carrier+protein.">Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).</li><li>Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin+inhibits+tyrosine+phosphorylation+by+the+cyclic+nucleotide-independent,+transforming+protein+kinase,+pp60src.">Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).</li><li>Di Fiore, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+EGF+receptor+confers+an+EGF-dependent+transformed+phenotype+to+NIH+3T3+cells.">Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells.</a> Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).</li><li>Maguire, H. C., Greene, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neu+(c-erbB-2)+oncogene.">The neu (c-erbB-2) oncogene.</a> Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).</li><li>Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+G(1)+arrest+induced+by+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+requires+up-regulation+of+p27(KIP1)+independent+of+MAPK+activity.">Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).</li><li>Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitor+as+a+novel+signal+transduction+and+antiproliferative+agent:+prostate+cancer.">Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).</li><li>Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Effectiveness+of+EGFR-TKIs+versus+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer:+a+meta-analysis].">[Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis].</a> Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+turning+point+in+cancer+research:+sequencing+the+human+genome.">A turning point in cancer research: sequencing the human genome.</a> Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).</li><li>Barinaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DoE+provides+funds+for+human+genome+sequencing.">DoE provides funds for human genome sequencing.</a> Nature. 331 (6152), 103 (1988).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li><li>McCain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome+atlas:+new+weapon+in+old+war?.">The cancer genome atlas: new weapon in old war?.</a> Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).</li><li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+Pan-Cancer+analysis+project.">The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li><li>Carlson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing:+The+Next+Iteration+of+Personalized+Medicine:+Next+generation+sequencing,+along+with+expanding+databases+like+The+Cancer+Genome+Atlas,+has+the+potential+to+aid+rational+drug+discovery+and+streamline+clinical+trials.">Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials.</a> Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).</li><li>Huang, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+antibody+arrays:+a+promising+tool+to+identify+molecular+targets+for+drug+discovery.">Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).</li><li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics.">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).</li><li>Rani, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+changes+in+phosphorylation+of+receptor+tyrosine+kinases:+antibody+arrays.">Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays.</a> Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).</li><li>Kani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JUN-Mediated+Downregulation+of+EGFR+Signaling+Is+Associated+with+Resistance+to+Gefitinib+in+EGFR-mutant+NSCLC+Cell+Lines.">JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).</li><li>Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+the+control+of+gene+expression.">Signal transduction and the control of gene expression.</a> Science. 295 (5556), 813-818 (2002).</li><li>Rikova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+phosphotyrosine+signaling+identifies+oncogenic+kinases+in+lung+cancer.">Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.</a> Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).</li><li>Chen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+stage+and+clinical/prognostic+factors+for+colon+and+rectal+cancer+from+SEER+registries:+AJCC+and+collaborative+stage+data+collection+system.">Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system.</a> Cancer. 120, 3793-3806 (2014).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Ward, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Grouping+to+Optimize+an+Objective+Function.">Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function.</a> Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Griffin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+quantitative,+automated+analysis+of+protein+glycosylation.">Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation.</a> Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ubiquitin+target+proteins+using+cell-based+arrays.">Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).</li><li>McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia,+oxidative+stress+and+inflammation.">Hypoxia, oxidative stress and inflammation.</a> Free Radical Biology and Medicine. , (2018).</li></ol>

Innfallsvinkler som kombinerer mange biologiske readouts er iboende mer nøyaktig representasjoner av den cellulære maskineriet i et eksperiment utført. Ankomsten av phospho-antistoff matriser kan en rask karakterisering av mønster av endringer som kan være mer informative enn endringsstatusen for enhver enkelt protein. Den generelle arbeidsflyten for anvendelse av phospho-antistoff matriser er basert på en endring i serine, threonin eller Tyrosin. Dette eksemplet fokusert på karakteriserer endres forbundet med mot...

Klinisk gjennomføring av målrettede tyrosine kinase hemmere (TKI) har transformert kreftbehandling ved å gi leger med effektive verktøy for å målrette bestemte proteiner at stasjonen neoplastic transformasjon. Disse forbindelsene hemmer eller blokkere fosforylering proteiner målrettet av tyrosin kinaser1,2. TKIs ble utviklet delvis fordi genetiske endringer i ulike nøkkel signalering gener er tilstrekkelig til å kjøre kreft initiering og progresjon [f.eksepidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), proto-oncogene tyrosin protein kinase Src (SRC), BCR-ABL og menneskelige epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2)]3,4. Virkningen av TKIs på cellen syklus5 og molekylære signalnettverk trasé6 representerer en transformasjon fra den uønskede til molecularly guidede kreftbehandling. Den viktigste fordelen av TKIs versus kjemoterapi er de økte svarprosenten og lavere risiko for toksisitet for friske celler7. Som et resultat har det økt fokus på forskning og utvikling av Roman TKIs.
Tilgang til genomisk sekvensering resultatene begynte med Human Genome Project8,9,10 og fortsetter i dag med ulike neste generasjon (NextGen) kreft sekvensering innsats [f.eksThe kreft Genome Atlas (TCGA)11,12]. Dette har inspirert mange eksperimentell metodikk som gir samtidig informasjon om tusenvis av gener og/eller gi saklig øyeblikksbilder av gener eller proteiner modulert av biologiske forstyrrelser13. Siden regulering av funksjonen mobilnettet skjer på flere nivåer, fra transkripsjon av gener til den post-translasjonell modifikasjonen av proteiner og deres aktivitet, vil en fullstendig forståelse av hendelsene kontrollere den cellulære funksjonen til slutt kreve en integrasjon av data fra ulike biologiske readouts. Evnen å dataskjerm budbringer RNA (mRNA) nivåer av gener med en enkeltcelle genet oppløsning har økt mulighet til å gjøre slutninger om gen funksjon og interaksjoner i hele-genome skala. Men tolkningen av gene expression matriser vil alltid være iboende ufullstendig uten integrering av andre nivåer av regulering: nemlig protein uttrykk nivåene, protein endring statene og protein post-translasjonell endringer (fosforylering, ubiquitylation, metylering, osv.). Her beskriver vi verktøyet antistoff matriser som betyr å forhøre post-translasjonell modifikasjoner av viktig signalnettverk komponenter som en funksjon av ulike forhold i et enkelt eksperiment14,15, 16.
Phospho-antistoff matriser kan brukes til å skille og analysere endringer i signal signaltransduksjon trasé16. Dette kan oppstå fra en genetisk modifisering eller behandlinger cellen linjer med kinase hemmere, chemotherapeutics, stress forårsaket av glukose deprivasjon, hypoksi eller serum sult. Merk, resistens eller et bestemt gen kan opp- eller downregulation også forårsake endringer i signal signaltransduksjon trasé17.
Resistens, for eksempel kan oppstå fra mutasjoner av narkotika målet å unngå følsomhet. Lungekreft, kjent EGFR mutasjoner gjengi kreft insusceptible til visse TKIs, men mer utsatt for andre. Alternativ signalnettverk trasé kan aktiveres på mutasjon17. Som et bredere program til å identifisere de signaltransduksjon trasé involvert i motstand og hypoksi, etc., phospho-antistoff matriser gir mer innsikt i, og dermed forståelse av, mekanismer involvert.
Teknologi som tillater en vurdering av protein modifikasjoner representerer en viktig komponent for systemer biologi fordi de ofte tjene en regulerende funksjon, for eksempel modulerende aktiviteten til et enzym eller fysiske interaksjonene mellom proteiner. Betydningen av post-translasjonell modifikasjoner er illustrert av rollen protein fosforylering i nesten alle ekstracellulære utløser signal signaltransduksjon trasé18. Tradisjonelt kunne identifikasjon av kinaser eller statusen fosforylering proteiner også fastslås ved Western blot analyse, spesielt hvis hun er interessert i bare 1 – 5 mål. Men vestlige blots er svært selektive og kan være partisk mot forkunnskaper og kanskje savne viktige mål som et resultat. Antistoff array(s) gir en medium gjennomstrømming avlesning av flere mål ved å bygge ulike fange antistoffer [pan-spesifikke fosforylert tyrosine(s), anti-ubiquitin, etc.] på en solid matrise (f.eks, glass eller nitrocellulose). Sekundær antistoffer gir informasjon om spesifikke proteiner i en sandwich-basert ELISA format (figur 1). Denne analysen blir kraftigere og mer relevant som flere mål av interesse eller tidligere kunnskap er begrenset15. Phospho-arrayene er videre arbeidsføre som de kan sammenligne fosforylering samt generelle mengder protein av flere mål i et eksperiment og gir en betydelig forbedret kvantifisering over massespektrometri. Denne teknikken er ikke anvendelig for identifisering av nye eller tidligere ukjente fosforylering nettsteder.
Store masse massespektrometri-baserte Proteomikk kan brukes til å identifisere bestemte fosforylering områder proteiner19. Selv om denne teknikken kan liste opp tusenvis av post-translasjonell hendelser, krever det dyre instrumentering, dedikert eksperimentelle rørledninger og en beregningsformelen kompetanse som er utenfor rekkevidden av de fleste forskere.
Antistoff matriser gir en samtidige avlesning på ulike protein readouts16. Disse kan være endringer i protein ubiquitylation (ubiquitin matrise) eller fosforylering. Hovedfordelen ved denne matrisen teknologi er at det gir viktig tilbakemelding om biologiske tilstanden av ulike biologiske forbundet med viktig celle parametere (protein 53 kDa, p53, receptor tyrosine kinaser og intracellulær veier) samtidig. I tillegg er det mulig å kombinere ulike matrisetyper å øke gjennomtrengning av analysen (f.eks, apoptose og ubiquitin og fosforylering). Denne muligheten til å kombinere flere matriser for å vurdere ulike post-translasjonell endringer på flere prøver samtidig på en gang - og kostnadseffektive måte som ikke krever bestemte instrumentering eller ekspertise er en betydelig fordel i tilfelle antistoff matriser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1045">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Odysee SA Imager</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Fluorescent Imager</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1.5 ml tube</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:195px;">Falkon (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td>wash buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tissue Culture dish 100mm</td>
			<td style="width:195px;">TRP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ICC Insulin syringe U100</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td>27G5/8,&#160; 1ml for needle treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY003B</td>
			<td>Human phospho MAPK array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY002B</td>
			<td>Human phospho kinase array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge Eppendorf 5430R</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">SpectraMAX M2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Absorbance reader for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IRDye 800CW Streptavidin</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">925-32230</td>
			<td>Streptavidin conjugate for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet</td>
			<td style="width:195px;">NuAire</td>
			<td style="width:119px;">NU-425-400</td>
			<td>Tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F60</td>
			<td>sonicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Rocking platform shaker</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10860-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:195px;">NIH open source</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAS Institutie JMP&#174; 12.1.0 (64-bit)</td>
			<td style="width:195px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays

Pasienter med en avvikende regulering av protein fosforylering nettverk er ofte behandlet med tyrosine kinase hemmere. Svarprosenten nærmer 85% er vanlig. Dessverre bli pasienter ofte ildfaste til behandling ved å endre deres signaltransduksjon trasé. Implementering av expression profilering med microarrays kan identifisere endres samlet mRNA nivå og Proteomikk kan identifisere de samlede endringene i protein nivå eller kan identifisere proteiner involvert, men aktiviteten til signaltransduksjon veier kan bare opprettes av avhør post-translasjonell modifikasjoner av proteiner. Følgelig er evnen til å identifisere enten en behandling er vellykket eller motstand oppsto, eller evnen til å beskrive noen endringer i signalveier, en viktig klinisk utfordring. Her gir vi en detaljert forklaring av antistoff matriser som et verktøy som kan identifisere systemomfattende endringer i ulike post-translasjonell endringer (f.eks, fosforylering). En av fordelene med å bruke antistoff matriser inkluderer deres tilgjengelighet (en matrise ikke krever enten en ekspert i Proteomikk eller dyrt utstyr) og hastighet. Tilgjengeligheten av matriser målretting en kombinasjon av post-translasjonell modifikasjoner er den største begrensningen. I tillegg kan upartiske tilnærminger (phosphoproteomics) være mer egnet for romanen oppdagelsen, mens antistoff matriser er ideelle for de mest preget mål.

For å undersøke effekten av TKI motstand på signaltransduksjon trasé i linjer, ble fire prøver analysert. Én kontroll prøven (H3255r1) og 3 TKI-resistente cellelinjer (H3255r2-4) (figur 2) var knyttet til malen spot antistoff (Figur 3). Alle 4 prøver ble utarbeidet bruker denne protokollen. Seks fosfoproteiner med differensial aktivitet ble valgt for demonstrasjon av analyse av antistoff arrayene (Fig...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Her presenterer vi en protokoll for antistoff matriser til å identifisere endringer i signalveier i ulike mobilnettet modeller. Disse endringene, forårsaket av narkotika/hypoksi/ultra-violet lys/stråling, eller overuttrykte/downregulation/knockouts, er viktige for ulike sykdom modeller og kan indikere om en behandling vil være effektiv eller kan identifisere mekanismer av narkotika motstand.

Vurdering av motstand mot Tyrosine Kinase hemmere av en avhør av signaltransduksjon trasé av antistoff matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om perturbasjoner i signalnettverk som kan forårsake kreftvekst eller utvikling av resistens mot spesifikke terapier. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan gi rask og pålitelig tilbakemelding på fosforyleringstilstanden til flere nettverk som ofte er deregulert i kreft. Implikasjonen av denne teknikken strekker seg mot behandling av legemiddelresistente kreftformer fordi identifisering av endringer og endringer etter oversettelsen kan belyse endringer i signaltransduksjonsveiaktivitet.Mens denne teknikken brukes på fosforylering, kan den også brukes til å se på andre post-translasjonelle modifikasjoner som glykosylering og ubiquityation. Begynn med å skylle over nattens kultiverte celler tre ganger med 10 milliliter PBS som tar vare på å fjerne alle PBS etter siste vask. Deretter legger du til riktig volum lysisbuffer fra proteinanalysesettet og bruker en celleskraper til å løsne cellene.Triturate den resulterende celleløsningen ca 10 ganger før du overfører minst en ganger 10 til de syvende cellene til et 1,5 milliliter rør. Inkuber cellene i 30 minutter ved fire grader Celsius med risting. Deretter laster du lysatet inn i en sprøyte utstyrt med en 27 gauge nål og aspirerer og dispenser prøven 10 ganger for å skjære cellemembranene.Når cellemembranene er fullstendig forstyrret, sentrifugerer lysatet og overfører supernatanten til et nytt 1,5 milliliter rør for påfølgende total proteinkvantifisering i henhold til standardprotokoller. For å utføre en menneskelig fosfokinaseanalyse, bruk først flatt tippede pinsett til å plassere en arraymembran i hver brønn av en fire-brønns multi-skuff som inneholder to milliliter nylaget arraybuffer en per brønn med antall membraner vendt opp. Ved nedsenking vil fargestoffet på membranen forsvinne.Dekk brettet med et lokk og inkuber membranene på en gyngeplattformshaker i 60 minutter ved romtemperatur. Under denne blokkerende inkubasjonen fortynnes hver lysateprøve til 50 til 100 mikrogram proteinkonsentrasjon i et maksimalt volum på 334 mikroliter lysisbuffer og bringe det endelige volumet av ekstrahert proteinprøve opptil 1,5 milliliter med fersk arraybuffer. Deretter aspirerer du forsiktig arraybufferen fra hver brønn av multi-skuffen og inkubere membranene med 1,5 milliliter proteinprøve per brønn over natten ved to til åtte grader Celsius på en gyngeplattformshaker.Neste morgen, nøye overføre hver matrise til individuelle plastbeholdere som inneholder 20 milliliter vaskebuffer for tre 10-minutters vasker på en gyngeplattform ved romtemperatur. Etter den siste vasken legger du til 20 mikroliter av riktig rekonstituert antistoffcocktail til to milliliter arraybuffer, to per brønn, og tørk forsiktig den nedre kanten av hver membran på et papirhåndkle for å fjerne overflødig vaskebuffer. Plasser deretter hver matrise tilbake i den aktuelle brønnen på antistoffet og dekk til brettet for en to timers inkubasjon ved romtemperatur på en gyngeplattform.På slutten av inkubasjonen, nøye overføre hver matrise til en ny åtte av 11 centimeter plastbeholder som inneholder 20 milliliter vaskebuffer for tre 10-minutters vasker som nettopp demonstrert. Etter siste vask, tilsett en milliliter av en passende streptavidin hest reddik peroxidase løsning til hver brønn av multi-brønnbrettet og returnere membranene til sine egnede brønner for en 30-minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen plasserer du hver membran mellom to stykker fem millimeter filterpapir for å fjerne overflødig buffer og inkubere de tørkede membranene med en passende heste reddikperoksidasedeteksjonsløsning i tre minutter.Plasser deretter membranene i individuelle klare plastarkbeskyttere for etterfølgende bildebehandling. For å vurdere reseptortyrosinkinaseuttrykket i hver prøve, åpner du bildene i et passende bildebehandlingsprogram som Bilde J og velger Rediger og inverter fra de riktige rullegardinmenyene for å invertere de svarte flekkene på den hvite bakgrunnen av bildet til hvite flekker på en svart bakgrunn. Deretter bruker du det ovale verktøyet til å omringe ett par hvite prikker på prikken og velge Analyser og mål for å åpne et nytt vindu automatisk som viser verdiene for det valgte området.Plasser deretter musepilen inn i midten av ovalen og dra det sirkulære området rundt neste prikkområde til alle interessepunktene er målt. I dette representative eksperimentet ble effekten av tyrosinkinasehemmerresistens på signaltransduksjonsveier analysert i en kontroll i tre tyrosinkinasehemmereresistente cellelinjer. Seks fosfoproteiner med differensialaktivitet ble valgt, og den relative intensiteten ble bestemt for flere kandidatproteiner i hver cellelinje.Som demonstrert av varmekartet, kan en semi-kvantitativ avlesning av endringene i proteinfosforylering av viktige signaltransduksjonsproteiner deretter genereres. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å starte med sunne og aktivt skille celler som stressorer kan indusere endringer i signaltransduksjonsveiaktivitet. Etter denne prosedyren kan andre metoder som digital PCR og immunoblotting brukes til å svare på flere spørsmål som endringer i fosforylering føre til aktivering av transkripsjonsfaktorer?Etter utviklingen har denne teknikken banet vei for forskere i kreftbiologi for å utforske grunnleggende endringer i post-translasjonell modifikasjon av proteiner som fører til bruk av personlig medisin for pasienter med kreft. Ikke glem at arbeid med kreftcellelinjer er ekstremt farlig, så sørg for å bruke aseptiske teknikker, vær forsiktig når du kaster skarpe og bærer en labfrakk til enhver tid.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduksjon-Transplantasjon musemodell for myeloproliferative Svulst

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Levende Imaging å studere microtubule Dynamic Ustabilitet i taxan-resistent brystkreft

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Generasjon av prostata kreft cellen modeller av motstand mot anti-mitotisk Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Leter Driver veier av ervervet motstand mot målrettet terapi: resistente Subclone generasjon og følsomhet gjenoppretting av Gene sammenleggbare

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av Orthotopic Homograft (Syngeneic) av Murine primære KPC bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma av flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Prekliniske vurdering av Bioactivity av Anticancer kumarin OT48 ved Spheroids, koloni formasjon analyser og sebrafisk Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potensiering av Anticancer antistoff effekten av Antineoplastic legemidler: påvisning av antistoff-stoff Synergism ved hjelp av kombinasjon Index formelen

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo Immunofluorescence lokalisering for vurdering av terapeutiske og diagnostiske antistoff Biodistribusjon i Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Vurdere cellulært målengasjement etter SHP2 (PTPN11) Fosfatasehemmere

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...