Name: assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

Vi är tacksamma för generöst ekonomiskt stöd av Lawrence J. Ellison Institute of omvälvande Medicine av USC (en gåva till David Agus). Vi uppskattar stöd av hösten Beemer och Lisa Flashner som leder till generation och offentliggörandet av detta manuskript. Vi tackar Laura Ng för hennes administrativt stöd.

1. protein utvinning
<ol><li>Tallrik 5 x 106 celler på en 10 mm vävnadsodling plattan (eller kolv) i vävnadsodling huva. Räkna cellerna vid tidpunkten för plätering med en automatisk cell counter eller hemocytometer. Alternativt kan du uppskatta celltalet.</li>
	<li>Skölj de celler som odlas på 10 mm plåt (eller kolv) grundligt 3 x med 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH = 7.4). Se till att ta bort alla PBS innan du lägger lyseringsbuffert. Obs: Lyseringsbuffert tillhandahålls vanligtvis...

<ol>
	<li>Knauer, D. J., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+biological+activity+of+multiplication-stimulating+activity+by+binding+to+its+carrier+protein.">Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).</li><li>Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quercetin+inhibits+tyrosine+phosphorylation+by+the+cyclic+nucleotide-independent,+transforming+protein+kinase,+pp60src.">Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).</li><li>Di Fiore, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+EGF+receptor+confers+an+EGF-dependent+transformed+phenotype+to+NIH+3T3+cells.">Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells.</a> Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).</li><li>Maguire, H. C., Greene, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neu+(c-erbB-2)+oncogene.">The neu (c-erbB-2) oncogene.</a> Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).</li><li>Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+G(1)+arrest+induced+by+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+requires+up-regulation+of+p27(KIP1)+independent+of+MAPK+activity.">Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).</li><li>Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitor+as+a+novel+signal+transduction+and+antiproliferative+agent:+prostate+cancer.">Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).</li><li>Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Effectiveness+of+EGFR-TKIs+versus+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer:+a+meta-analysis].">[Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis].</a> Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+turning+point+in+cancer+research:+sequencing+the+human+genome.">A turning point in cancer research: sequencing the human genome.</a> Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).</li><li>Barinaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DoE+provides+funds+for+human+genome+sequencing.">DoE provides funds for human genome sequencing.</a> Nature. 331 (6152), 103 (1988).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li><li>McCain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome+atlas:+new+weapon+in+old+war?.">The cancer genome atlas: new weapon in old war?.</a> Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).</li><li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Genome+Atlas+Pan-Cancer+analysis+project.">The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li><li>Carlson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing:+The+Next+Iteration+of+Personalized+Medicine:+Next+generation+sequencing,+along+with+expanding+databases+like+The+Cancer+Genome+Atlas,+has+the+potential+to+aid+rational+drug+discovery+and+streamline+clinical+trials.">Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials.</a> Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).</li><li>Huang, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+antibody+arrays:+a+promising+tool+to+identify+molecular+targets+for+drug+discovery.">Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).</li><li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics.">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).</li><li>Rani, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+changes+in+phosphorylation+of+receptor+tyrosine+kinases:+antibody+arrays.">Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays.</a> Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).</li><li>Kani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JUN-Mediated+Downregulation+of+EGFR+Signaling+Is+Associated+with+Resistance+to+Gefitinib+in+EGFR-mutant+NSCLC+Cell+Lines.">JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).</li><li>Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+the+control+of+gene+expression.">Signal transduction and the control of gene expression.</a> Science. 295 (5556), 813-818 (2002).</li><li>Rikova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+phosphotyrosine+signaling+identifies+oncogenic+kinases+in+lung+cancer.">Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.</a> Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).</li><li>Chen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+stage+and+clinical/prognostic+factors+for+colon+and+rectal+cancer+from+SEER+registries:+AJCC+and+collaborative+stage+data+collection+system.">Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system.</a> Cancer. 120, 3793-3806 (2014).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Ward, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Grouping+to+Optimize+an+Objective+Function.">Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function.</a> Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Griffin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+quantitative,+automated+analysis+of+protein+glycosylation.">Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation.</a> Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ubiquitin+target+proteins+using+cell-based+arrays.">Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).</li><li>McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia,+oxidative+stress+and+inflammation.">Hypoxia, oxidative stress and inflammation.</a> Free Radical Biology and Medicine. , (2018).</li></ol>

Strategier som kombinerar många biologiska utläsningar är till sin natur mer exakt representationer av det cellulära maskineriet i ett experiment som utförs. Tillkomsten av phospho-antikropp matriser gör en snabb karakterisering av mönstret för ändringar som kan vara mer informativa än ändring status för någon enda protein. Det allmänna arbetsflödet för tillämpningen av phospho-antikropp matriser är baserad på en ändring i serine, treonin eller tyrosin. Detta exempel fokuserat på karakterisera de fö...

Det kliniska genomförandet av de riktade tyrosinkinashämmare (TKI) har förvandlat cancerbehandling genom att tillhandahålla läkare med effektiva verktyg för att rikta specifika proteinerna att driva neoplastisk transformation. Dessa föreningar hämma eller blockera fosforyleringen av proteiner riktade av tyrosin kinaser1,2. TKI utvecklades delvis eftersom genetiska förändringar i olika nyckel signalering gener är tillräckliga för att driva cancer initiering och progression [e.g., epidermal tillväxtfaktor (EGFR), proto-onkogener tyrosin-proteinkinas Src (SRC), BCR-ABL och human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2)]3,4. Inverkan av TKI på cell cykeln5 och molekylär signalering vägar6 representerar en omvandling från de oriktade till molekylärt guidade cancerbehandlingen. Den viktigaste fördelen med TKI jämfört med kemoterapi är de ökad svarsfrekvenserna och den lägre risken för toxicitet till friska celler7. Som ett resultat, det har varit att öka uppmärksamhet på forskning och utveckling av nya TKI.
Tillgång till genomisk sekvensering resultaten började med Human Genome Project8,9,10 och fortsätter idag med olika nästa generation (NextGen) cancer sekvensering ansträngningar [e.g., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Detta har inspirerat många experimentella metoder som ger samtidig information om tusentals gener och/eller ge opartisk ögonblicksbilder av gener eller proteiner som moduleras av biologiska störningar13. Eftersom regleringen av cellulära funktionen sker på flera nivåer, från transkriptionen av gener den posttranslationella modifieringen av proteiner och deras verksamhet, kommer en fullständig förståelse av de händelser som styr cellulära funktionen Slutligen kräver en integration av data från olika biologiska utläsningar. Möjlighet att övervaka budbärar-RNA (mRNA) nivåerna av tusentals gener med en enskild cell gene upplösning har ökat förmågan att göra slutledningar om geners funktion och interaktioner i helgenom-skala. Dock tolkningen av gene expression arrays kommer alltid att vara inneboende ofullständig utan integration av andra nivåer av förordning: nämligen protein uttryck nivåer protein modifiering staterna och proteinet posttranslationella ändringar (fosforylering, ubiquitin, metylering, etc.). Här, beskriver vi verktyget antikropp-matriser som medel att förhöra post-translationella modifieringar av viktiga signalering komponenter som en funktion av olika villkor i en enda experiment14,15, 16.
Phospho-antikropp matriser kan användas för att urskilja och analysera förändringar i signaltransduktion vägar16. Dessa kan uppstå från en genetisk modifiering eller behandlingar av cellinjer med kinashämmare, kemoterapeutika, stress orsakad av glukos deprivation, hypoxi eller serum svält. Obs, resistens eller en specifik gen kan upp- eller nedreglering också orsaka förändringar i signaltransduktion vägar17.
Läkemedelsresistens, kan exempelvis uppstå mutationer av drogen målet att undvika känslighet. I lungcancer, kända EGFR-mutationer återge cancer mottaglig till vissa TKI, men mer mottagliga för andra. Alternativ signalering vägar kan aktiveras vid mutation17. Phospho-antikropp matriser ger mer insikt om som ett bredare program för identifiering av de cellsmedierade reaktioner deltar i motstånd och hypoxi, etc., och följaktligen förståelse av, mekanismerna involverade.
Teknik som möjliggör en bedömning av protein ändringar utgör en viktig komponent i systembiologi eftersom de tjänar ofta en reglerande funktion, såsom modulera aktiviteten hos ett enzym eller fysiska interaktioner mellan proteiner. Vikten av post-translationella modifieringar illustreras av rollen av protein fosforylering i nästan alla extracellulära-utlöst signaltransduktion vägar18. Traditionellt, kan identifiering av kinaser eller phosphorylation status av proteiner också bestämmas genom Western blot analys, särskilt om forskaren är intresserad av endast 1 – 5 mål. Dock Western blotting är mycket selektiva och kan vara partisk mot förkunskaper och kan missa viktiga mål som ett resultat. Antikropp array(s) ger en medium-genomströmning avläsning av flera mål genom att bädda in olika capture-antikroppar [pan-specifika fosforylerade tyrosine(s), anti-ubiquitin, etc.] på en solid matris(t exglas eller nitrocellulosa). Sekundära antikroppar ger information om specifika proteiner i en sandwich-baserade ELISA-format (figur 1). Denna analys blir mer kraftfull och relevant som mer mål är av intresse eller tidigare kunskap är begränsad15. De phospho-arrayer är mer allmänt anställningsbara som de kan jämföra fosforylering samt allmänna mängder protein av ett bredare utbud av mål i ett experiment och ger en betydligt bättre kvantifiering över masspektrometri. Denna teknik är inte tillämplig för identifiering av nya eller tidigare okända fosforylering platser.
Storskaliga mass spectrometry-baserad proteomik kunde användas för att identifiera specifika fosforylering områden av proteiner19. Även om denna teknik kan räkna upp tusentals posttranslationella händelser, kräver det dyra instrumentering, dedikerad experimentella rörledningar och en computational sakkunskap som är utom räckhåll för de flesta forskare.
Antikropp matriser ger en samtidig avläsning på olika protein utläsningar16. Dessa kan vara förändringar i protein ubiquitin (ubiquitin matris) eller fosforylering. Den viktigaste fördelen med denna array-teknik är att det ger viktig feedback på biologiska tillståndet för olika biologiska spridningsvägar är associerad med viktig cell parametrar (protein 53 kDa, p53, receptortyrosinkinaser och sockernivån) samtidigt. Dessutom är det möjligt att kombinera olika matristyper för att öka penetrationen av ett test (t.ex., apoptos och ubiquitin och fosforylering). Denna förmåga att kombinera flera matriser för att bedöma olika posttranslationella förändringar i flera prover samtidigt på en tid och cost effective sätt som inte kräver specifik instrumentering eller expertis är av en betydande fördel i fall antikropp-matriser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1045">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Odysee SA Imager</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Fluorescent Imager</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1.5 ml tube</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22363212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:195px;">Falkon (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dulbeco&#39;s Phosphate buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td>wash buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tissue Culture dish 100mm</td>
			<td style="width:195px;">TRP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ICC Insulin syringe U100</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td>27G5/8,&#160; 1ml for needle treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY003B</td>
			<td>Human phospho MAPK array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Protein Profiler ARRAY&#160;</td>
			<td style="width:195px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">ARY002B</td>
			<td>Human phospho kinase array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Centrifuge Eppendorf 5430R</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Table top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">SpectraMAX M2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Absorbance reader for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IRDye 800CW Streptavidin</td>
			<td style="width:195px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">925-32230</td>
			<td>Streptavidin conjugate for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet</td>
			<td style="width:195px;">NuAire</td>
			<td style="width:119px;">NU-425-400</td>
			<td>Tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:195px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F60</td>
			<td>sonicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Rocking platform shaker</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10860-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:195px;">NIH open source</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAS Institutie JMP&#174; 12.1.0 (64-bit)</td>
			<td style="width:195px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays

Patienter med en avvikande reglering av protein fosforylering näten behandlas ofta med tyrosinkinashämmare. Svarsfrekvenser närmar sig 85% är vanliga. Tyvärr blir patienter ofta refraktär till behandling genom att ändra deras cellsmedierade reaktioner. En implementering av uttrycket profilering med microarrays kan identifiera förändringarna som övergripande mRNA-nivå, och proteomik kan identifiera de övergripande förändringarna i proteinnivåer eller kan identifiera proteinerna som är inblandade, men aktiviteten av Signaltransduktion vägar kan endast fastställas genom förhör post-translationella modifieringar av proteiner. Som ett resultat, är förmåga att identifiera huruvida en läkemedelsbehandling är lyckad eller om motstånd uppstod, eller förmåga att karakterisera eventuella ändringar i signalvägar, en klinisk utmaning. Här ger vi en utförlig förklaring av antikropp matriser som ett verktyg som kan identifiera systemomfattande ändringar i olika post-translationella modifieringar (t.ex., fosforylering). En av fördelarna med att använda antikropp arrayer innehåller deras tillgänglighet (en matris inte kräver antingen en expert inom proteomik eller dyr utrustning) och hastighet. Tillgången på matriser inriktning en kombination av post-translationella modifieringar är den primära begränsningen. Dessutom kanske opartiska metoder (phosphoproteomics) mer lämplig för roman upptäckten, medan antikropp matriser är idealiska för de mest kännetecknas mål.

För att undersöka effekten av TKI motstånd på cellsmedierade reaktioner i cellinjer, analyserades fyra prover. Ett kontrollprov (H3255r1) och 3 TKI-resistenta cellinjer (H3255r2-4) (figur 2) var relaterade till mallen plats antikropp (figur 3). Alla 4 prover var beredda använder detta protokoll. Sex phosphoproteins med differentiell aktivitet valdes för demonstration av analysen av de antikroppar arrayer (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays at JoVE.com

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Här presenterar vi ett protokoll för antikropp matriser för att identifiera förändringar i signalvägar i olika cellular-modeller. Dessa förändringar kan orsakas av läkemedel/hypoxi/ultra-violet ljus/strålning, eller överuttryck/nedreglering/knockouts, är viktiga för olika sjukdomsmodeller och kan indikera om en terapi blir effektivt eller kan identifiera mekanismer av droger motstånd.

Bedömning av resistens mot tyrosinkinashämmare av ett förhör av cellsmedierade reaktioner av antikropp matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om störningar i signalering nätverk som kan orsaka cancertillväxt eller utveckling av resistens mot specifika terapier. Den största fördelen med denna teknik är att den kan ge snabb och tillförlitlig återkoppling på fosforyleringstillståndet i flera nätverk som ofta avregleras i cancer. Innebörden av denna teknik sträcker sig mot terapi av läkemedelsresistenta cancer eftersom identifiering av ändringar och post-translational ändringar kan klargöra förändringar i signaltransduktion utbildningsavsnitt verksamhet.Medan denna teknik används på fosforylering, det kan också användas för att titta på andra post-translationella modifieringar såsom glykosylering och ubiquitylation. Börja med att grundligt skölja över natten odlade celler tre gånger med 10 milliliter PBS noga med att ta bort alla PBS efter den sista tvätten. Därefter lägger du till lämplig volym av lysbuffert från proteinanalyssatsen och använd en cellskrapa för att lossa cellerna.Triturtera den resulterande celllösningen ungefär 10 gånger innan du överför minst en gånger 10 till de sjunde cellerna till ett 1,5 milliliterrör. Inkubera cellerna i 30 minuter vid fyra grader Celsius med skakningar. Ladda sedan lysate i en spruta utrustad med en 27 gauge nål och aspirera och dosera provet 10 gånger för att skjuvning av cellmembranen.När cellmembranen har störts helt, centrifugera lysate och överföra supernatanten till ett nytt 1,5 milliliterrör för efterföljande total proteinkvantifiering enligt standardprotokoll. För att utföra en mänsklig fosfokinasanalys, använd först plattippcett för att placera ett matrismembran i varje brunn av en fyra-väl multi-bricka som innehåller två milliliter av nyberedda array buffert en per brunn med antalet membran uppåt. Vid nedsänkning kommer färgämnet på membranet att försvinna.Täck brickan med lock och inkubera membranen på en gungande plattformsskakner i 60 minuter i rumstemperatur. Under denna blockerande inkubation späd varje lysateprov till en 50 till 100 mikrogram proteinkoncentration i en maximal volym av 334 mikroliter av lysbuffert och för den slutliga volymen extraherat proteinprov upp till 1,5 milliliter med färsk arraybuffert. Därefter aspirera försiktigt arraybufferten från varje brunn av flerbrickan och inkubera membranen med 1,5 milliliter proteinprov per brunn över natten vid två till åtta grader Celsius på en gungande plattformsskakning.Nästa morgon, försiktigt överföra varje matris till enskilda plastbehållare som innehåller 20 milliliter tvättbuffert för tre 10-minuters tvättar på en gunga plattform vid rumstemperatur. Efter den sista tvätten, tillsätt 20 mikroliter av lämplig rekonstituerad antikroppscocktail till två milliliter av matrisbuffert, två per brunn, och noggrant blot den nedre kanten av varje membran på en pappershandduk för att ta bort eventuella överskott tvätta buffert. Placera sedan tillbaka varje matris i lämplig brunn av brickan av antikropp och täck facket för en två timmars inkubation vid rumstemperatur på en gungande plattform.I slutet av inkubationen, försiktigt överföra varje matris i en ny åtta med 11 centimeter plastbehållare som innehåller 20 milliliter tvätt buffert för tre 10-minuters tvättar som just visat. Tillsätt efter den sista tvättningen en milliliter av en lämplig streptavidin-pepparsasperoxidaslösning till varje brunn i flerbrunnsbrickan och återföra membranen till deras lämpliga brunnar för en inkubering på 30 minuter vid rumstemperatur. Placera varje membran mellan två bitar av fem millimeters filterpapper i slutet av inkubationen för att avlägsna eventuellt överskottsbuffert och inkubera de torkade membranen med en lämplig pepparsyta peroxidasdetektionslösning i tre minuter.Placera sedan membranen i enskilda klar plastfolie beskyddare för efterföljande bildbehandling. För att bedöma receptortyrosinkinasuttrycket i varje prov öppnar du bilderna i ett lämpligt bildbehandlingsprogram som Bild J och väljer Redigera och Invertera från lämpliga dropdown-menyer för att invertera de svarta fläckarna på bildens vita bakgrund till vita fläckar på en svart bakgrund. Därefter använder du ovalverktyget om du vill omringa ett par vita punkter på punktfläcken och välj Analysera och mäta för att automatiskt öppna ett nytt fönster som visar värdena för det markerade området.Placera sedan punkten på muspilen i mitten av ovalen och dra det cirkulära området runt nästa punktområde tills alla fläckar av intresse har mätts. I detta representativa experiment, effekterna av tyrosin kinas inhibitor motstånd på signaltransduktion vägar analyserades i en kontroll i tre tyrosin kinas hämmare resistenta cellinjer. Sex fosfoproteiner med differentiell aktivitet valdes och den relativa intensiteten fastställdes för flera kandidatproteiner i varje cellinje.Som värmekartan visar kunde sedan en semi-kvantitativ avläsning om förändringarna i proteinfosforylering av viktiga signaltransduktionsproteiner genereras. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att börja med friska och aktivt dela celler som stressfaktorer kan framkalla förändringar i signaltransduktion väg aktivitet. Efter detta förfarande kan andra metoder som digital PCR och immunoblotting användas för att besvara ytterligare frågor som gör förändringar i fosforylering leda till aktivering av transkriptionsfaktorer?Efter dess utveckling har denna teknik banat väg för forskare inom cancerbiologi att utforska grundläggande förändringar i post-translational modifiering av proteiner som leder till tillkomsten av personlig medicin för patienter med cancer. Glöm inte att arbeta med cancer cellinjer är extremt farligt så se till att använda aseptiska tekniker, försiktighet när du kasserar vassa och bära en labbrock hela tiden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduktion-Transplantation musmodell av myeloproliferativa Tumör

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Live Imaging att studera mikrotubuli Dynamisk Instabilitet i taxan resistent bröstcancer

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Generationen av prostatacancer cellmodeller av motstånd mot den anti mitotiska Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Söker förare vägar av förvärvad resistens till riktad terapi: resistenta Subclone Generation och känslighet återställa av genen Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av ortotop Homograft (syngena) av murina primära KPC pankreas duktal adenokarcinom av flödescytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinisk utvärdering av bioaktiviteten av den mot cancer kumarin OT48 av Spheroids, koloni bildandet analyser och zebrafiskar xenograft

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiering av Anticancer antikropp effekt av antineoplastiska läkemedel: Påvisande av antikropp-drogen Synergism med kombination Index formel

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo Immunofluorescenslokalisering för bedömning av terapeutisk och diagnostisk antikropps biodistribution i cancer forskning

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Bedöma cellulära Target Engagement av SHP2 (PTPN11) Fosfatashämmare

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...