Name: single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry at JoVE.com

Nous tenons à remercier Aimee Pugh-Bernard pour son apport intellectuel et commentaires utiles. Ce travail est soutenu par le nombre Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award et prix K23-1K23AR070897 du NIH à Elena W.Y. Hsieh. Elle est également soutenue par attribution numéro K12-HD000850 de l’Institut National d’Eunice Kennedy Shriver , de la santé de l’enfant et le développement humain et la Lucile Packard Foundation pour la santé de l’enfant, Stanford CSTC UL1 TR001085 et Child Health Research Institut de Stanford University.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Colorado plusieurs institutionnels Review Board (COMIRB) de l’Université du Colorado. Toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être effectuées sous une hotte de vitroplants stérile, sauf indication contraire, avec des pointes de pipette filtrée, et tous les réactifs filtrée.
1. préparation des réactifs pour le traitement du sang périphérique
<ol><li>Préparer ruxolitinib stocks aliquotes (10 – 15 μL/fla...

<ol>
	<li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+diseases:+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States.">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li><li>Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus:+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s.">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li><li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).</li><li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+effector+CD4++T+cells.">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 11 (6), 257 (2009).</li><li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function:+the+T+helper+type+17+example.">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li><li>Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+stories+on+Th17+cells.">More stories on Th17 cells.</a> Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).</li><li>Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry.">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).</li><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Mass+Cytometry+of+Differential+Immune+and+Drug+Responses+Across+a+Human+Hematopoietic+Continuum.">Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.</a> Science. 332 (6030), 687-696 (2011).</li><li>Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometry:+Technique+for+Real+Time+Single+Cell+Multitarget+Immunoassay+Based+on+Inductively+Coupled+Plasma+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry.">Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).</li><li>Rahman, A., Isenberg, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).</li><li>O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems-level+analysis+of+human+Toll-like+receptor+activation+defines+a+chemokine+signature+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).</li><li>O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+identifies+a+distinct+monocyte+cytokine+signature+shared+by+clinically+heterogeneous+pediatric+SLE+patients.">Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients.</a> Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).</li><li>Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).</li><li>Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations.">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li><li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li><li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation.">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li><li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li><li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference.">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li></ol>

Nous décrivons ici un roman, unicellulaires, approche protéomique à évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Cette méthode emploie le sang périphérique comme véhicule analytique et masse cytométrie de flux comme outil pour évaluer les anomalies immunitaires cellulaires phénotypiques et fonctionnelles. La méthode est facilemen...

Les maladies auto-immunes sont une cause majeure de morbidité et de mortalité touchant 3-8 % de la population. Aux États-Unis, les maladies auto-immunes sont parmi les principales causes de décès chez les femmes jeunes et d’âge moyen (âges < 65 ans)1,2. Maladies auto-immunes sont caractérisées par une présentation clinique hétérogène et divers processus immunologiques sous-jacents. Le spectre de l’hétérogénéité est bien représenté à travers différents troubles, comme articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) et les maladies neurologiques dans la sclérose en plaques (MS). Toutefois, ce niveau d’hétérogénéité est également illustré dans un trouble unique, comme le lupus érythémateux systémique (les) : certains patients peuvent présenter des pathologie rénale, alors que d’autres souffrent de participation hématologique ou mixte3.
L’immunopathogenèse sous-jacente dans les maladies auto-immunes reflète l’hétérogénéité clinique, impliquant et hyper-activation automatique de plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative et la production de cytokines dysrégulation concomitante. Alors que les cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie auto-immune, comprendre leur rôle spécifique dans le mécanisme de la maladie s’est avéré difficile. Cytokines sont caractérisés par la pléiotropie (une cytokine peut avoir des effets multiples sur différents types de cellules), redondance (cytokines multiples peuvent avoir le même effet), la dualité (une cytokine peut avoir des effets pro - ou anti-inflammatoires, dans des conditions différentes), et la plasticité (cytokines peut être moulé dans un rôle différent de son « original », selon l’environnement)4,5,6. Par conséquent, méthodes l’échelle de la population ne peut pas distinguer les réponses cellulaires hétérogènes à la même « milieu de cytokine ». De même, les plans d’études qui mettent l’accent sur un aspect spécifique du système immunitaire (cellules du même type ou cytokine), n’offrent pas une évaluation globale de tous les éléments impliqués dans des maladies auto-immunes complexes. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés.
Récemment, nous avons développé une approche protéomique monocellulaires pour évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Le workflow décrit ici est caractérisé par l’utilisation d’échantillons de sang périphérique intacte, par opposition aux cellules mononucléaires isolées du sang périphérique (PBMC). Sang périphérique représente le véhicule plus physiologiquement pertinent pour étudier la maladie auto-immune systémique, incluant 1) non-sang des mononucléaires souvent impliqués dans les maladies auto-immunes (p. ex., neutrophiles, plaquettes) et le plasma 2) circulant de facteurs, tels que les acides nucléiques, complexes immuns et cytokines, qui ont un rôle activateur immunitaire. Pour capturer le « intrinsèque pathogènes » dysrégulation la production de cytokines, les échantillons sont traités immédiatement après le tirage de sang (T0, temps zéro) et après 6 h d’incubation à 37 ° C (température du corps physiologique) avec un transport des protéines du sang périphérique inhibiteur en l’absence de toute condition de stimulation exogène (T6, durée 6 h), pour détecter la production de cytokines (accumulation, T6-T0) qui reflète l’état de la maladie « intrinsèque » (Figure 1). Pour étudier les processus de dysrégulation qui reflètent plus ou moins activation des voies de signalisation impliquées dans les réponses immunitaires pertinents à la maladie, des échantillons de sang périphérique sont traités (6 h d’incubation à 37 ° C avec un inhibiteur de transport de protéine) avec une exogène stimuler la condition qui reflète la pathogenèse de la maladie, tels que les agonistes des récepteurs Toll-Like (TLR) dans le cas de SLE (T6 + R848, temps de 6 h avec 1 µg/mL R848), pour détecter la production de cytokines qui refléterait une réponse aux acides nucléiques (comparant T0 vs T6 vs T6 + R848, Figure 1). Afin d’étudier les effets immunomodulateurs de thérapeutique disponible ex vivo, en ce qui concerne les processus précis dysrégulation immunitaire des patients spécifiques, des échantillons de sang périphérique sont traitées par un inhibiteur JAK à la thérapeutique concentration (ici, 5 uM ruxolitinib ; T6 + 5R, temps de 6 h avec 5 uM ruxolitinib), pour détecter des changements dans l’état de la maladie « intrinsèque » en réponse à la drogue (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figure 1). Un inhibiteur JAK a été choisi pour cette étude parce que les inhibiteurs de JAK auraient dû être divulgués pour réussir dans le traitement de maladies auto-immunes telles que RA
Evaluer simultanément les dysrégulation des processus décrits ci-dessus en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, des échantillons de sang périphérique de SLE patients et témoins sains ont été traitées comme décrit ci-dessus et analysés par cytométrie de flux massique. Cytométrie en masse, également connu sous le nom Cytometry-Time-Of-Flight, offre une analyse unicellulaires de plus de 40 paramètres sans problèmes de spectral chevauchent7,8,9. Cette technique utilise des isotopes métalliques de terres rares sous forme d’ions métalliques solubles sous forme de balises liés aux anticorps, au lieu de fluorophores10. Des détails supplémentaires au sujet de la plateforme technologique de cytométrie de flux massique (c.-à-d., tuning et étalonnage, l’acquisition de l’échantillon) se trouvent dans Leipold et coll. et McCarthy et al. 11 , 12 la haute-dimensionnalité de cytométrie de flux massique permet mesure simultanée de plusieurs cytokines dans l’ensemble des sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative avec granularité unicellulaires (Table des matières).
Les paramètres cliniques et de laboratoire classiques actuels ne sont souvent pas sensibles ou suffisamment précis pour détecter l’activité en cours de la maladie ou la réponse aux immunomodulateurs spécifiques13, reflétant la nécessité de mieux délimiter le système immunitaire sous-jacent changements qui animent les poussées. Compte tenu de l’omniprésence de dérèglement de cytokine dans une maladie auto-immune, une multitude de méthodes de traitement qui utilisent des anticorps ou des petits inhibiteurs moléculaires ciblant les cytokines ou la signalisation des protéines impliquées dans la régulation de la production de cytokines ont récemment vu le jour. Dans son format de base, l’approche analytique de sang périphérique décrite ici fournit une plate-forme pour identifier les sous-ensembles de cellules spécifiques au patient dysrégulation et leur production de cytokines anormale dans une maladie auto-immune avec des manifestations systémiques. Cette méthodologie permet la personnalisation des choix thérapeutiques comme dysrégulation spécifique cytokines peuvent être identifiés, et un traitement spécifique peut être testé ex vivo pour évaluer leur capacité à immunomodulate la patiente maladie spécifique processus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ruxolitinib</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-364729A</td>
			<td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R848</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-r848-5</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EK</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix Buffer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>558049</td>
			<td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD Phosflow perm/wash buffer I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>557885</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Stock Conc: &#62;99.9%; Final Conc: 0.0002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>00-4980-93</td>
			<td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Intercalator</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192B</td>
			<td>Stock Conc: 500 &#956;M; Final Conc: 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Media (CSM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201057</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-plex Pd Barcode Set</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>S0014</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ TM Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% MeOH-free Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28908</td>
			<td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-496</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-9001</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios CyTOF instrument</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Helios</td>
			<td>All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 M&#937;.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies used for Mass Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L161</td>
			<td>Mass: 161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>Mass: 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK3</td>
			<td>Mass: 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD7</td>
			<td>BD</td>
			<td>M-T701</td>
			<td>Mass: 149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Mass: 142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>ICRF44</td>
			<td>Mass: 209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-ly6</td>
			<td>Mass: 152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15</td>
			<td>BD</td>
			<td>HI98</td>
			<td>Mass: 115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Mass: 154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>B73.1</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SJ25C1</td>
			<td>Mass: 163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Bu32</td>
			<td>Mass: 141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>L128</td>
			<td>Mass: 155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>HIT2</td>
			<td>Mass: 172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 total</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI30</td>
			<td>Mass: 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI100</td>
			<td>Mass: 153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>REA196</td>
			<td>Mass: 168</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66</td>
			<td>BD</td>
			<td>B1.1/CD66</td>
			<td>Mass: 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>IT2.2</td>
			<td>Mass: 150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>6H6</td>
			<td>Mass: 143</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD278/ICOS</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>C398.4A</td>
			<td>Mass: 156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179/PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>EH12.2H7</td>
			<td>Mass: 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>IA6-2</td>
			<td>Mass: 146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MHM-88</td>
			<td>Mass: 151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR5</td>
			<td>BD</td>
			<td>RF8B2</td>
			<td>Mass: 173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLADR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L243</td>
			<td>Mass: 167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>364-3B3-14</td>
			<td>Mass: 147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>H1b-98</td>
			<td>Mass: 169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1RA</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>AS17</td>
			<td>Mass: 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MQ2-13A5</td>
			<td>Mass: 164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>BD</td>
			<td>E8N1</td>
			<td>Mass: 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12/IL-23p40</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>C8.6</td>
			<td>Mass: 171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>BL168</td>
			<td>Mass: 148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL23p19</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>23dcdp</td>
			<td>Mass: 176</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP1&#946;</td>
			<td>BD</td>
			<td>D21-1351</td>
			<td>Mass: 158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP1</td>
			<td>BD</td>
			<td>5D3-F7</td>
			<td>Mass: 170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#945;</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>LT27:295</td>
			<td>Mass: 175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>4S.B3</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>BD</td>
			<td>A2B1</td>
			<td>Mass: 159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Mab11</td>
			<td>Mass: 166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling&#160; Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry

Cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse des maladies auto-immunes. Par conséquent, la mesure des niveaux de cytokine a fait l’objet de plusieurs études pour tenter de comprendre les mécanismes précis qui conduisent à la rupture de l’autotolérance et l’auto-immunité ultérieure. Les approches jusqu’ici ont été fondées sur l’étude d’un aspect spécifique du système immunitaire (un seul ou quelques types de cellules ou de cytokines) et n’offrent pas une évaluation globale d’une maladie auto-immune complexe. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés. Une approche globale de la cellule unique pour évaluer la production de cytokines en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, dans le cadre de « intrinsèque » spécifique au patient plasmatique circulant des facteurs, est décrite ici. Cette approche permet la surveillance du phénotype immunitaire spécifique au patient (marqueurs de surface) et fonction (cytokines), soit dans son indigène » intrinsèque pathogènes » maladie, État, ou en présence d’agents thérapeutiques (in vivo ou ex vivo).

Figure 1 illustre le flux de travail pour la stimulation et traitement des échantillons de sang périphérique, y compris la répartition des aliquotes d’échantillons sanguins, date de l’ajout d’agents de stimulation, protéine de transport cocktail inhibiteur et incubation fois jusqu'à la lyse des globules rouges (GR) et de la fixation. Le choix des agents stimulants dépendra des voies de signalisation et de cytokines qui sont ciblés pour évaluat...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry at JoVE.com

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Nous décrivons ici une approche protéomique unicellulaires Evaluer immunitaire phénotypique et fonctionnelle (induction de cytokines intracellulaires) des altérations dans les échantillons de sang périphérique, analysés par cytométrie en masse.

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Recherche

Immunologie et infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Énumération des principales populations de leucocytes périphériques sanguins pour essais cliniques multicentriques en utilisant un test de sang total Phénotypage

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l&#39;acide périodique Schiff coloration

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps Cocktails pour immunophénotypique Analyse de sang périphérique humain

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

L&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...