Name: single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry at JoVE.com

Wir möchten Aimee Pugh-Bernard für ihre geistigen Input und hilfreichen Kommentare danken. Diese Arbeit war die Boettcher Stiftung Webb Waring Biomedical Research Award und Award K23-1K23AR070897 von der NIH, Elena W.Y. Hsieh unterstützt. Sie wurde auch von prämiennummer K12-HD000850 von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development and Lucile Packard Foundation für Kinder Gesundheit, Stanford CTSA UL1 TR001085 und Child Health Research unterstützt. Institut der Stanford University.

Alle hier beschriebene Methoden sind durch die Colorado mehrere institutionelle Review Board (COMIRB) von der University of Colorado genehmigt worden. Alle unten beschriebene Verfahren sollte in einem sterilen Gewebekultur Abzug durchgeführt werden, sofern nichts anderes mit gefilterten Pipettenspitzen und alle Reagenzien gefiltert.
1. Vorbereitung der Reagenzien für die peripheren Vollblut Verarbeitung
<ol><li>Bereiten Sie Ruxolitinib Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) ...

<ol>
	<li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+diseases:+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States.">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li><li>Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus:+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s.">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li><li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).</li><li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+effector+CD4++T+cells.">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 11 (6), 257 (2009).</li><li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function:+the+T+helper+type+17+example.">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li><li>Basso, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations.">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li><li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li><li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation.">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li><li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li><li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference.">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li></ol>

Hier beschreiben wir eine neuartige, einzellige, Proteomic Ansatz für mehrere Immunzelle Arten gleichzeitig zu beurteilen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Diese Methode setzt peripheren Vollblut sowie die analytische Fahrzeug Masse zytometrie als Instrument für die Bewertung der immunologischen zellulären phänotypische und funktionelle Veränderungen. Die Methode ist leicht anwendbar auf Menschen und M?...

Autoimmunerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität 3-8 % der Bevölkerung betroffen. In den Vereinigten Staaten, autoimmune-Erkrankungen gehören zu den führenden Todesursachen bei junge und Mittelalte Frauen (Alter < 65 Jahre)1,2. Autoimmune-Erkrankungen zeichnen sich durch heterogene klinische Präsentation und unterschiedlichen zugrunde liegenden immunologische Prozesse. Das Spektrum der Heterogenität ist über verschiedene Störungen, wie gemeinsame Beteiligung bei der rheumatoiden Arthritis (RA) und neurologische Erkrankung bei multipler Sklerose (MS) vertreten. Dieses Maß an Heterogenität zeigt jedoch auch innerhalb einer einzelnen Störung, wie systemischer Lupus erythematodes (SLE): bei einigen Patienten können mit renal Pathologie präsentieren, während andere leiden an hämatologischen oder gemeinsame Beteiligung3.
Die zugrunde liegenden immunpathogenese in Autoimmun-Erkrankungen spiegelt die klinische Heterogenität, mit Auto - und hyper-Aktivierung von angeborenen und der adaptiven Immunzelle Teilmengen und damit einhergehende Dysregulated Produktion von Zytokinen. Während Zytokine eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten spielen, nachweislich verstehen ihre besondere Rolle in den Mechanismus der Krankheit eine Herausforderung sein. Zytokine sind geprägt von Pleiotropie (ein Zytokin kann mehrere Effekte auf verschiedene Zelltypen haben), Redundanz (mehrere Zytokine können die gleiche Wirkung haben), Dualität (ein Zytokin kann pro- und antiinflammatorische Effekte unter verschiedenen Bedingungen haben), und Plastizität (Zytokine können in eine Rolle unterscheidet sich von der "original", je nach Umgebung geformt werden)4,5,6. Folglich können nicht Populationsebene Methoden heterogene zelluläre Reaktionen auf die gleichen "Zytokin-Milieu" unterscheiden. In ähnlicher Weise bieten Studiendesigns, die sich auf einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (eine einzelne Zellentyp oder Cytokine), keine Gesamtbewertung aller Elemente in komplexen Autoimmunkrankheit beteiligt. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt.
Vor kurzem haben wir einen einzelligen Proteomic Ansatz zur Bewertung gleichzeitig mehrere Arten von Immunzellen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Die hier beschriebene Workflow zeichnet sich durch die Verwendung von intakten peripheren Vollblut-Proben, im Gegensatz zu isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Peripheren Blut stellt die meisten physiologisch relevante Fahrzeug immun-vermittelte systemerkrankung, einschließlich 1) nicht-mononukleären Blutzellen oft eingebunden in Autoimmunerkrankung (d.h., Neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten) und Plasma (2) studieren zirkulierenden Faktoren wie Nukleinsäuren, Immunkomplexe und Zytokine, haben die immun aktivierende Rollen. Erfassen der "inneren pathogenen" Dysregulated Produktion von Zytokinen, peripherem Blut Proben unmittelbar nach der Blutentnahme (T0, Stunde Null), und nach 6 h Inkubation bei 37 ° C (physiologische Körpertemperatur) mit einem Protein-Transport erfolgt Inhibitor bei fehlender exogene anregende Zustand (T6, Zeit 6 h), Produktion von Zytokinen (Akkumulation, T6-T0) erkennen, die die "intrinsische" Krankheitszustandes (Abbildung 1) widerspiegeln würde. Dysregulated Prozesse, die über widerspiegeln oder unter Aktivierung der Signalwege in Immunreaktionen relevant für die Krankheit, periphere Blutproben sind zu studieren (6 h Inkubation bei 37 ° C mit einem Protein-Transport-Inhibitor) mit einer exogenen behandelt Bedingung, die Pathogenese der Krankheit, wie Toll-Like-Rezeptor (TLR) Agonisten bei SLE (T6 + R848, mal 6 h mit 1 µg/mL R848), um die Produktion von Zytokinen zu erkennen, die eine Reaktion auf Nukleinsäuren widerspiegeln würde reflektiert anregend (Vergleich T0 vs. T6 vs. T6 + R848, Abbildung 1). Um immunmodulatorische Effekte von verfügbaren Therapeutika ex Vivo, studieren, wie sie die präzise immun Dysregulated Prozesse für bestimmte Patienten betreffen, werden mit einem JAK Inhibitor bei den relevanten therapeutischen peripherem Blutproben behandelt. Konzentration (hier 5 Umm Ruxolitinib; T6 + 5R, mal 6 h mit 5 Umm Ruxolitinib), zum Erkennen von Änderungen in "intrinsische" Krankheit Staat als Reaktion auf das Medikament (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Abbildung 1). Ein JAK Inhibitor wurde für diese Studie ausgewählt, weil JAK-Hemmer nachweislich erfolgreich bei der Behandlung von Autoimmun-Krankheiten wie RA
Um gleichzeitig in mehreren Immunzelle Teilmengen, periphere Blutproben von SLE beschriebenen Dysregulated-Prozesse bewerten wurden Patienten und gesunden Kontrollpersonen verarbeitet, wie oben beschrieben und analysiert durch Masse zytometrie. Masse zytometrie, auch bekannt als Zytometrie-Time-Of-Flight, bietet einzellige Analyse von über 40 Parametern ohne Probleme der spektralen7,8,9überlappen. Diese Technik nutzt seltene Erden Metall-Isotope in Form von löslichen Metall-Ionen als Tags an Antikörpern, statt Fluorophore10gebunden. Zusätzliche Details bezüglich der Masse zytometrie technological Platform (d.h., tuning und Kalibrierung, Probe Erwerb) finden Sie im Leipold Et Al. und McCarthy Et al. 11 , 12 High-Dimensionalität der Masse zytometrie ermöglicht gleichzeitige Messung mehrerer Zytokine in angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen mit einzelligen Granularität (Table of Materials).
Aktuelle konventionellen klinischen und Labor-Parameter sind oft nicht empfindlich oder spezifisch genug, zur Erkennung von laufenden Krankheitsaktivität oder die Reaktion auf bestimmte Immunmodulatoren13, reflektieren die Notwendigkeit, das zugrunde liegende Immunsystem besser abzugrenzen Änderungen, die Schübe zu fahren. Angesichts die Allgegenwart der Cytokine Dysregulation bei Autoimmunerkrankung, haben eine Vielzahl von Behandlungsansätzen, die Antikörper oder kleine Molekulare Inhibitoren targeting Zytokine oder signalproteinen beteiligt bei der Regulierung der Produktion von Zytokinen verwenden vor kurzem entstanden. In ihrer grundlegenden Form bietet der hier beschriebene peripherem Blut analytische Ansatz eine Plattform um patientenspezifische Dysregulated Zelle Teilmengen und ihre abnorme Zytokin-Produktion in Autoimmunerkrankung mit systemischen Manifestationen zu identifizieren. Diese Methodik ermöglicht die Personalisierung von therapeutischen Möglichkeiten wie spezifische Dysregulated Zytokine identifiziert werden können, und eine spezifische Behandlung, die Optionen Ex Vivo getestet zu ihrer Fähigkeit, Immunomodulate zu beurteilen Patienten spezifische Krankheit Prozesses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ruxolitinib</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-364729A</td>
			<td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R848</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-r848-5</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EK</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix Buffer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>558049</td>
			<td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD Phosflow perm/wash buffer I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>557885</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Stock Conc: &#62;99.9%; Final Conc: 0.0002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>00-4980-93</td>
			<td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Intercalator</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192B</td>
			<td>Stock Conc: 500 &#956;M; Final Conc: 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Media (CSM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201057</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-plex Pd Barcode Set</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>S0014</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ TM Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% MeOH-free Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28908</td>
			<td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-496</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-9001</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios CyTOF instrument</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Helios</td>
			<td>All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 M&#937;.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies used for Mass Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L161</td>
			<td>Mass: 161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>Mass: 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK3</td>
			<td>Mass: 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD7</td>
			<td>BD</td>
			<td>M-T701</td>
			<td>Mass: 149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Mass: 142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>ICRF44</td>
			<td>Mass: 209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-ly6</td>
			<td>Mass: 152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15</td>
			<td>BD</td>
			<td>HI98</td>
			<td>Mass: 115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Mass: 154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>B73.1</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SJ25C1</td>
			<td>Mass: 163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Bu32</td>
			<td>Mass: 141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>L128</td>
			<td>Mass: 155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>HIT2</td>
			<td>Mass: 172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 total</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI30</td>
			<td>Mass: 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI100</td>
			<td>Mass: 153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>REA196</td>
			<td>Mass: 168</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66</td>
			<td>BD</td>
			<td>B1.1/CD66</td>
			<td>Mass: 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>IT2.2</td>
			<td>Mass: 150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>6H6</td>
			<td>Mass: 143</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD278/ICOS</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>C398.4A</td>
			<td>Mass: 156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179/PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>EH12.2H7</td>
			<td>Mass: 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>IA6-2</td>
			<td>Mass: 146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MHM-88</td>
			<td>Mass: 151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR5</td>
			<td>BD</td>
			<td>RF8B2</td>
			<td>Mass: 173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLADR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L243</td>
			<td>Mass: 167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>364-3B3-14</td>
			<td>Mass: 147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>H1b-98</td>
			<td>Mass: 169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1RA</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>AS17</td>
			<td>Mass: 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MQ2-13A5</td>
			<td>Mass: 164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>BD</td>
			<td>E8N1</td>
			<td>Mass: 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12/IL-23p40</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>C8.6</td>
			<td>Mass: 171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>BL168</td>
			<td>Mass: 148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL23p19</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>23dcdp</td>
			<td>Mass: 176</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP1&#946;</td>
			<td>BD</td>
			<td>D21-1351</td>
			<td>Mass: 158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP1</td>
			<td>BD</td>
			<td>5D3-F7</td>
			<td>Mass: 170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#945;</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>LT27:295</td>
			<td>Mass: 175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>4S.B3</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>BD</td>
			<td>A2B1</td>
			<td>Mass: 159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Mab11</td>
			<td>Mass: 166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling&#160; Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry

Zytokine spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten. Daher wurde die Messung der Zytokin Ebenen der Schwerpunkt von mehreren Studien in einem Versuch, die genauen Mechanismen zu verstehen, die zum Zusammenbruch der Selbsttoleranz und anschließende Autoimmunität führen. Ansätze bisher basieren auf der Studie einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (Single oder paar Zelltypen oder Zytokine) und bieten keine umfassende Beurteilung der komplexen Autoimmunerkrankung. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt. Eine einzellige Gesamtkonzept für die Produktion von Zytokinen in mehreren Immunzelle Teilmengen im Rahmen des "intrinsische" Patienten-spezifischen Plasma zirkulierenden Faktoren zu bewerten ist hier beschrieben. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung des Patienten-spezifischen immun Phänotyps (oberflächenmarker) und Funktion (Zytokine), entweder in seiner Heimat "inneren pathogenen" Krankheit Staat, oder in der Gegenwart von Therapeutika (in Vivo und ex Vivo).

Abbildung 1 zeigt den Workflow für die Stimulation und Verarbeitung der peripheren Blutproben, einschließlich Zuweisung von Blut Probe Aliquote, Timing der Zusatz von Stimulation, Protein Inhibitor cocktail, und Inkubation Zeiten bis zur Lyse der Erythrozyten (RBC) und Fixierung. Die Wahl der anregenden Agenten hängt von der Signal- und Cytokine Bahnen, die für die Bewertung ausgerichtet sind. Beispielsweise werden in dem hier beschriebenen Protokoll TLR-...

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Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Hier beschreiben wir einen Einzellige Proteomic Ansatz um Immune phänotypische und funktionelle (intrazelluläre Zytokin Induktion) bewerten Veränderungen in peripheren Vollblut Proben, über Masse zytometrie analysiert.

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...