Name: induction and validation of cellular senescence in primary human cells
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells at JoVE.com

אנו מודים חברי המעבדה Demaria דיונים פוריים, ואת Thijmen van Vliet לשיתוף נתונים, פרוטוקול על הזדקנות ביולוגית UV-induced.

1. כללי הכנה
<ol><li>להכין D10 בינוני. תוספת DMEM בינוני-Glutamax עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוז הסופי: 100 U/mL).</li>
	<li>להכין PBS סטרילי. להמיס את הטבליות במים על פי הוראות היצרן. לחטא על ידי תא לחץ.</li>
	<li>להכין טריפסין x 1. לדלל 5 מ של טריפסין-Versene EDTA/10 x 10:1 ב- 45 מ של PBS סטרילי. הערה: לאורך כל הפרוטוקול, אנ...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Mu&#241;oz-Esp&#237;n, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.+Nature+reviews.">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li><li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence.">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li><li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype.">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).</li><li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+tumor+promotion:+Is+aging+the+key?.">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li><li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+p16(Ink4a)-positive+cells+shorten+healthy+lifespan.">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age.">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997 (2015).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders.">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li><li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment.">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li><li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse.">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li><li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li><li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+interventions+for+aging:+the+case+of+cellular+senescence.">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li><li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+cells:+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing.">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li><li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence.">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34 (2016).</li><li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq.">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).</li><li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells.">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li><li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status.">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li><li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBPalpha+regulates+CRL4(Cdt2)-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1/S+checkpoint.">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li><li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy.">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li><li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression.">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li><li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2'-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells.">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li><li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability.">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+&#946;-galactosidase+is+lysosomal+&#946;-galactosidase.">Senescence-associated &#946;-galactosidase is lysosomal &#946;-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li><li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall.">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Sherr, C. J., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RB+and+p53+pathways+in+cancer.">The RB and p53 pathways in cancer.</a> Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).</li><li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage.">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li><li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li><li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells.">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li><li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose-induced+replicative+senescence:+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase.">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li><li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence.">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li><li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta.">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).</li><li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTOR+and+autophagy:+converging+on+senescence+or+quiescence.">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li><li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro:+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen.">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li><li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen.">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).</li><li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+senescent+cells+in+ageing.">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence.">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li></ol>

הפרוטוקולים המוסברת אופטימציה להצגה fibroblasts העיקרי אנושית, במיוחד BJ ותאי WI-38. הפרוטוקולים עבור הזדקנות ביולוגית replicative, קרינה מייננת, דוקסורוביצין, הוחלו בהצלחה על סוגים אחרים של fibroblasts (HCA2 ו- IMR90), סוגי תאים אחרים (כלומר neonatal מלנוציטים ו keratinocytes או cardiomyocytes נגזר iPSC) במעבדה שלנו. עם זאת, ניתן למט?...

ב-1961, Hayflick ולמורהד דיווחו כי ראשי fibroblasts בתרבות לאבד את הפוטנציאל המקדימות שלהם לאחר מעברים רצופים1. תהליך זה נגרמת על ידי לקיצור רציפים של טלומרים לאחר כל חלוקת התא. כאשר טלומרים מגיעים באורך ביקורתי קצר, הם מזוהים התגובה נזק לדנ א (DDR) שמפעיל מעצר בלתי הפיך של התפשטות — כהגדרתו גם הזדקנות ביולוגית replicative. הזדקנות ביולוגית replicative נחשב כיום לאחד גירויים רבים ידועים כדי לגרום למצב של קבע מחזור מעצר התא שמעבדת תאים חסרי רגישות mitogens וגם אפופטוטיים להיפגע אותות2,3. התוכנית הזדקנות ביולוגית מאופיין בדרך כלל על-ידי תכונות נוספות כולל פעילות lysosomal גבוהה, תפקוד מיטוכונדריאלי, שינויים גרעינית, rearrangements כרומטין, רשתית תוך-פלזמית מתח, נזק לדנ א, הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ (SASP)3,4. תאים senescent יש תפקידים רבים בגוף: פיתוח, פצע ריפוי ו הגידול דיכוי2. באותה מידה, הם ידועים לשחק תפקיד חשוב הזדקנות ו, באופן פרדוקסלי, ב התקדמות הגידול5. לעיתים קרובות מיוחסות השפעות שליליות, סותרים באופן חלקי, הזדקנות ביולוגית SASP6.
. לאחרונה, זה הוצג כי חיסול של תאים senescent מן העכברים מוביל להארכת תוחלת החיים וכדי חיסול של רבים של הזדקנות תכונות7,8,9,10,11, 12. באותה דרך, בסמים מרובים פותחו לחסל גם את תאי senescent (senolytics) או למקד SASP13,14. הפוטנציאל הטיפולי של אנטי אייג'ינג משכה לאחרונה יותר תשומת לב השדה.
חקר מנגנוני משויך הזדקנות ביולוגית הסלולר, ההקרנות עבור התערבויות תרופתי בכבדות להסתמך על דגמי ex-vivo , במיוחד על אנושי fibroblasts העיקרי. אמנם יש כמה תכונות נפוצות מופעל על ידי inducers הזדקנות ביולוגית מגוונים, השתנות גדולה בפנוטיפ הזדקנות ביולוגית היא נצפתה ותלויים בגורמים שונים, כולל תא סוג, גירוי וזמן נקודה3,15, 16,17. זה הכרחי כדי לשקול את הטרוגניות עבור הלומדים והיעדים תאים senescent. לכן, פרוטוקול זה שואפת לספק סדרה של שיטות השתמשו כדי לגרום הזדקנות ביולוגית ב fibroblasts הראשי באמצעות טיפולים שונים. כמו זה תהיה מנומקת, השיטות בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים.
מלבד הזדקנות ביולוגית replicative, נתאר חמישה טיפולים בתדר הזדקנות ביולוגית אחרים: מייננת קרינה, קרינה אולטרה סגולה (UV), דוקסורוביצין, סטרס חמצוני, שינויים epigenetic (כלומר קידום של היסטון acetylation או דנ א demethylation) . גם, קרינה מייננת וגם קרינת UV לגרום נזק לדנ א ישיר ויפעיל, במינון המתאים, הזדקנות ביולוגית18,19. דוקסורוביצין גם גורם הזדקנות ביולוגית בעיקר באמצעות נזק לדנ א מאת intercalating לתוך ה-DNA, שיבוש טופואיזומראז II פונקציה, ובכך עצירת DNA תיקון מנגנונים20. הביטוי של גנים חיוניים עבור הזדקנות ביולוגית נשלטת בדרך כלל על-ידי acetylation היסטון מתילציה DNA. כתוצאה מכך, מעכבי deacetylase היסטון (למשל, butyrate נתרן, סאהה) וסוכני דנ א demethylating (למשל, 5-עזה) לעורר הזדקנות ביולוגית תאים נורמליים אחרת21,22.
בסופו של דבר, ארבעה סמנים הנפוצים ביותר קשורים לתאים senescent תהיה מנומקת: הפעילות של הזדקנות ביולוגית הקשורים-β-galactosidase (SA-β-גל), שיעור לסינתזת DNA על ידי עידו התאגדות assay, ביטוי של הרגולטורים מחזור התא, p16 מעכבי קינאז תלוי-cyclin p21, ואת ביטוי, הפרשת חברי SASP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM Media - GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SC-202581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13mm round coverslips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1840.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip</td>
			<td>Merck Chemicals</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium137-source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>IBL 637 Cesium-137&#947;-ray machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV radiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Opsytec, Dr. G&#246;bel BS-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin dihydrochloride&#160;</td>
			<td>BioAustralis Fine Chemicals</td>
			<td>BIA-D1202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aza-2&#8217;-deoxycytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7240-90-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dibasic phosphate</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>7782-85-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13746-66-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>111-30-8,7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde (w/v)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>D1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>209198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 480 sealing foil&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sensifast Probe Lo-ROX kit&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-84020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPL Probe Library</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad TC20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry incubator</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>Heratherm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.10983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#39;M&#39; laboratory film</td>
			<td>Bemis&#160;</td>
			<td>#PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and validation of cellular senescence in primary human cells

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא מצב של מחזור התא קבוע מעצר מופעלת בתגובה לגירויים מזיקים שונים. הפעלה של הזדקנות ביולוגית הסלולר מהווה סימן היכר של תנאים pathophysiological שונים, כולל הגידול דיכוי, רקמות שיפוץ והתיישנות. Inducers של הזדקנות ביולוגית הסלולר ויוו מאופיינים עדיין לקוי. עם זאת, מספר של גירויים יכול לשמש כדי לקדם את הזדקנות ביולוגית הסלולר ex-vivo. ביניהם, הזדקנות ביולוגית-inducers הנפוצים ביותר הם תשישות replicative, מייננת ולא מייננת, genotoxic סמים, סטרס חמצוני, demethylating, acetylating סוכנים. כאן, אנו נספק הוראות מפורטות על איך להשתמש גירוי לזירוז fibroblasts לתוך הזדקנות ביולוגית. פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים עבור סוגים שונים של תאים ראשי שורות תאים, כולל תאים סרטניים. אנו מתארים גם שיטות שונות עבור האימות של הזדקנות ביולוגית אינדוקציה. בפרט, אנו מתמקדים מדידת הפעילות של האנזים lysosomal הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל), הקצב לסינתזת DNA באמצעות 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) התאגדות assay, רמות הביטוי של מחזור התא p16 מעכבי p21, ואת הביטוי ואת הפרשת חברים פנוטיפ הפרשה Senescence-Associated (SASP). לבסוף, אנו מספקים תוצאות דוגמה, לדון בהמשך יישומים של פרוטוקולים אלה.

העשרה של SA-β-גל מכתים ב senescent fibroblasts
Β-galactosidase (β-גל) הוא אנזים lysosomal זה מתבטא כל התאים וזה של ה-pH האופטימלי של25,4.026. עם זאת, במהלך הזדקנות ביולוגית, lysosomes להגביר את גודל ולצבור, כתוצאה מכך, תאי senescent β-גל. הכמויות מו?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells at JoVE.com

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

כאן, אנו נדון סדרה של פרוטוקולים עבור אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית התאית בתאים בתרבית. אנחנו מתמקדים גירויים שונים בתדר הזדקנות ביולוגית. ומתארות כימות של סמנים משותפים הקשורים הזדקנות ביולוגית. אנו מספקים פרטים טכניים באמצעות fibroblasts כמודל, אך ניתן להתאים את הפרוטוקולים השונים דגמי הסלולר.

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation להגדיר גירעונות בעצביים הגירה במודלים מהונדסים

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...