Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

نود أن نشكر "خدمة نسيجية" لمساعدتها التقنية في كارديوفاسكولاريس المركز الوطني للبحوث (المحوسبة بطاقة الهوية الوطني). كما نشكر الدكتور Motoharu سيكي للفئران Mt4-mmpلاكز توفير يرجى، والدكتورة أليسيا زاي أرويو لدعم مشروعنا ولها قراءة نقدية من المخطوطة. ونود أن نشكر بيتر بوني لتصحيح هذه المقالة. وأيده هذا العمل الأوروبي جامعة مدريد عن طريق منحة (# 2017UEM01) منحت إلى C.S.C.

وافق جميع الإجراءات التجريبية اللجنة المعنية "أخلاقيات التجارب الحيوانية" المحوسبة بطاقة الهوية الوطني (المركز الوطني للبحوث كارديوفاسكولاريس) وفي مدريد الدولية المستقلة لضمان الحد الأدنى الحيوان المعاناة.
1-جمع الأجنة من الفئران الحوامل (من E8.5 إلى E12.5)
<ol><li>التضحية الفئر...

الجين لاكز كولاي قد استخدمت على نطاق واسع من كمراسل في الدراسات المتعلقة بأنماط التعبير الجيني بسبب حساسية عالية وسهولة الاكتشاف. هذا البروتوكول وصف أسلوب كلاسيكي للكشف عن التعبير β-غال استناداً إلى فعل الانزيمية التي من السهل والسريع لأداء وغير مكلفة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب أيضا دو...

من أجل وصف أنماط التعبير الجيني محددة، تم استخدام الجينات مراسل كعلامات قصوى من المورفولوجية للثدييات. في التجارب التي تنطوي على الحيوانات المحورة وراثيا والضربة القاضية، الجين البكتيري β-جالاكتوسيداسي (لاكز) من الإشريكيّة القولونية (كولاي) واحدة من الأكثر استخداماً1،2،3، 4-β-جالاكتوسيداسي (β-غال) يحفز على أن التحلل من β-جالاكتوسيديس (مثل اللاكتوز) إلى السكريات الأحادية (الجلوكوز واللبن)5. الركيزة الأكثر استخداماً هو العاشر-غال (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)، غليكوزيد الذي هو تحلل من β-جالاكتوسيداسي نشأ عنه 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole واللبن. الأول هو تتأكسد في ديمر، عندما تستخدم جنبا إلى جنب مع البوتاسيوم فيري-وتنتج فيرو-السيانيد، مميزة غير قابلة للذوبان، ويعجل باللون الأزرق (الشكل 1)6.
بدأت الجينات لاكز لاستخدامها كأحد جينات مراسل منذ أكثر من ثلاثين عاماً7،8. عادة، يتم إدراج لاكز المتلقين للمعلومات من المروجين الذاتية مكان الإطار القراءة المفتوحة، حيث يمكن استخدامه في الثقافة البكتيريا والخلية لتصور الخلايا التي تحتوي على إدراج خاصة، وكذلك في الحيوانات المحورة وراثيا كتتبع من الذاتية أنماط التعبير الجيني أثناء التنمية9. وفي هذا الصدد، التصور من β-جالاكتوسيداسي النشاط على نطاق واسع استخدمت في المورفولوجية لفهم العمليات الإنمائية والخلوية من خلايا مفردة لكل الأنسجة. الوراثة المورفولوجية لصالح توليد خطوط مستقرة فيه بناء عنصر ف معدلة تحتوي على الجينات مراسل لاكز إدراج المواقع في الجينوم عشوائياً. وهكذا، عندما وضعت تحت تأثير عناصر محسن قد محرك التعبير عن بطريقة محددة أنسجة، مما سمح إجراء تحليل منهجي لأنماط التعبير العديد من الجينات خلال العقدين الماضيين الماضية10. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام الفئران المعدلة وراثيا لرصد التعبير الجيني لاكز أيضا الكشف عن المورثات جزئ الأحداث حسب لوكسب لجنة المساواة العرقية بوساطة جزئ، والترجمة من المشتقات متحولة الخلايا الجذعية الجنينية في تحليلات تشيميريك 11، مما يسهل التحكم في التعبير لاكز في أنسجة محددة، وكذلك وقتيا. أيضا، في الأجنة كله، الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي قد تنتج أنماط المصبوغة التفاضلية في كثافات مختلفة التي يمكن ملاحظتها مريح عبر مراحل تنموية مختلفة لتحليل التغيرات الزمنية في التعبير الجيني 8،12.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكولا لتصور التعبير الجيني عن طريق X-غال تلطيخ في الأنسجة جبل كله في مراحل النمو المبكر للأجنة الماوس. أننا نقدم هذا الأسلوب histochemical كتقنية حساسة للغاية وغير مكلفة التي تفضل كشف دقيق للخلايا المسماة في العينات جبل كله أو على المستوى الخلوي بعد البارافين مضمن الأنسجة أو الأجنة. الأسلوب يسمح للتصور مباشرة من تلطيخ في الأنسجة الماوس مع خلفية الحد الأدنى عند مقارنتها مع أساليب أخرى13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

ويستخدم الجين الإشريكيّة القولونية لاكز ، ترميز β-جالاكتوسيداسي، إلى حد كبير كمراسل للتعبير الجيني وتتبع في الخلية النسب الدراسات. رد فعل histochemical الكلاسيكي يرتكز على التحلل المائي للركيزة X-غال في تركيبة مع أيونات الحديديك والحديدية، التي تنتج ترسبات زرقاء غير قابلة للذوبان من السهل تصور. ولذلك، β-جالاكتوسيداسي النشاط بمثابة كعلامة لنمط التعبير للجينات لمصلحة التنمية العائدات. هنا يصف لنا بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج لاحقاً. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها من إجراء لتوضيح الأجنة كله تصور أفضل X-غال تلطيخ في مناطق أكثر عمقاً للجنين. يتم الحصول على نتائج متسقة قبل تنفيذ هذا الإجراء، رغم الحاجة إلى تحسين ظروف رد فعل لتقليل النشاط الخلفية. ينبغي أيضا النظر قصور التحليل، لا سيما فيما يتعلق بحجم الجنين في جبل كله تلطيخ. وينص البروتوكول لدينا حساسة وطريقة موثوقة لكشف β-جالاكتوسيداسي أثناء وضع الماوس التي يمكن تطبيقها كذلك على أبواب كريوستات، فضلا عن أجهزة كاملة. وهكذا، يمكن تحليل أنماط تعبير الجينات الحيوية في جميع أنحاء التنمية بسهولة باستخدام هذا البروتوكول في الأجنة كلها، ولكن كما يمكن تقييم التعبير مفصلة على المستوى الخلوي بعد تقطيع البارافين.

هنا نعرض النتائج من تطبيق البروتوكول القياسي لرد فعل histochemical β-جالاكتوسيداسي باستخدام X-غال كالركيزة في الأجنة كله الماوس (الشكل 1 و الشكل 2). باستخدام هذا البروتوكول، علينا أن ندرس نوع الغشاء أية 4-مصفوفة (Mt4-mmp) التعبير في مختلف مراحل النمو ا...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

تتبع التعبير الجيني من خلال الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة كله الماوس

هنا يمكننا وصف بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج. هذا هو إجراء سهل وسريع لرصد الجينات أثناء التطوير التي يمكن أن تطبق أيضا على أقسام الأنسجة، الأجهزة أو الخلايا المستزرعة.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

التتبع الوراثي الكلونال باستخدام الماوس الحلويات لدراسة الانسجه المعدنية

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

الليزر التقاط ميكروتشريح الغضروف الجنيني الماوس والعظام لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...