Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Vi vil gerne takke den histopatologiske Service for deres tekniske bistand på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for venligt giver Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo, for at støtte vores projekt og for hendes kritiske læsning af manuskriptet. Vi vil gerne takke Peter Bonney til korrekturlæsning af denne artikel. Dette arbejde blev støttet af Universidad Europea de Madrid ved hjælp af tilskud (# 2017UEM01) til C.S.C.

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Udvalget om etik af dyr eksperimenter af CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) og Comunidad Autónoma de Madrid for at sikre minimal dyrelidelser.
1. samling af embryoner fra gravide mus (fra E8.5 til E12.5)
<ol><li>Ofre gravide mus enten cervikal dislokation eller CO2 indånding. Først dag observeret vaginal plug blev betragtet som embryonale dag 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Lå dyret i den liggende stilling på abso...

E. coli LacZ gen har været meget anvendt som reporter i undersøgelser af gen expression mønstre på grund af sin høje følsomhed og lethed af påvisning. Denne protokol beskriver en klassisk metode til påvisning af β-gal udtryk baseret på en enzymatisk reaktion, der er let og hurtig at udføre og billig. Denne metode kan også anvendes uden større ændringer i hele mount embryoner, intakt organer, væv frysemikrotomsnit eller dyrkede celler.
Korrekt anvendelse af denne metode ...

For at beskrive bestemte gen expression mønstre, har brug af reporter gener som markører været altafgørende fra Drosophila til pattedyr. Forsøg med transgene og knockout dyr, er den bakterielle β-galactosidase gen (LacZ) af Escherichia coli (E. coli) en af de mest udbredte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyserer hydrolyse af β-galactosides (såsom lactose) i sin monosakkarider (glucose og galactose)5. Dens mest almindeligt anvendte substrat er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycosid, der er hydrolyseret af β-galactosidase giver anledning til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galactose. Først oxideres i en dimer, når de anvendes kombineret med kalium ferri- og ferro-cyanid, producerer en karakteristisk uopløseligt, blå farve bundfald (figur 1)6.
LacZ gen begyndt at blive brugt som en reporter gen over tredive år siden7,8. Normalt, LacZ er indsat neden for en endogen promotor stedet åbne læsning rammen, så det kan bruges i bakteriel og celle kultur at visualisere celler, der indeholder en bestemt indsætte samt i transgene dyr som røbestof af endogene gen expression mønstre under udvikling9. I denne henseende har visualisering af β-galactosidase aktivitet været flittigt brugt i Drosophila for at forstå de udviklingsmæssige og cellulære processer fra enkelt celler til hele væv. Drosophila genetik favorisere generation af stabil linjer som en modificeret P-element konstruktion indeholdende reporter gen LacZ er indsat på tilfældige steder i genomet. Således, når de placeres under indflydelse af enhancer elementer kan det køre sit udtryk på en bestemt måde, væv, der har tilladt en systematisk analyse af udtryk mønstre af mange gener i løbet af de sidste to årtier10. Desuden giver brug af Transgene mus til at overvåge LacZ genekspression også påvisning af gen rekombination begivenheder af Cre-loxP medieret rekombination og lokalisering af mutant embryonale stamceller derivater i kimære analyser 11, som muliggør kontrol af LacZ udtryk i specifikke væv såvel som tidsmæssigt. Også, i hele embryoner, påvisning af β-galactosidase aktivitet kan producere differential farvning mønstre på forskellige intensiteter, der bekvemt kan iagttages på tværs af forskellige udviklingsstadier analysere tidsmæssige ændringer i genekspression 8,12.
I denne artikel præsenterer vi en protokol for at visualisere genekspression gennem X-gal farvning i hele mount væv på tidlige udviklingsstadier af musen embryoner. Vi præsenterer denne histokemiske metode som en yderst følsom og billig teknik, der favoriserer nøjagtig registrering af mærket celler i hele mount prøver eller på cellulært niveau efter paraffin indlejret væv eller embryoner. Metoden giver mulighed for direkte visualisering af farvning i mus væv med minimum baggrunden sammenlignet med andre metoder13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

Escherichia coli LacZ gen, kodning β-galactosidase, er i vid udstrækning brugt som reporter for genekspression og som røbestof i celle lineage undersøgelser. Den klassiske histokemiske reaktion er baseret på hydrolyse af substrat X-gal i kombination med jern og jern ioner, som producerer en uopløselig blå bundfald, der er let at visualisere. Derfor, β-galactosidase aktivitet fungerer som en markør for gen af interesse udtryk mønster efterhånden som udviklingen skrider frem. Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og den efterfølgende metode til paraffin skæring og counterstaining. Derudover fastsættes en procedure for afklaring hele embryoner til bedre visualisere X-gal farvning i dybere områder af embryoet. Ensartede resultater er opnået ved at udføre denne procedure, selv om optimering af reaktionsbetingelser er nødvendig for at minimere baggrund aktivitet. Begrænsninger i analysen bør overvejes også, især med hensyn til størrelsen af embryo i hele mount farvning. Vores protokol giver en følsom og en pålidelig metode til registrering af β-galactosidase under musen udvikling, der kan anvendes yderligere frysemikrotomsnit samt hele organer. Således dynamisk gen expression mønstre i hele udvikling kan let analyseres ved hjælp af denne protokol i hele embryoner, men også detaljeret udtryk på cellulært niveau kan vurderes efter paraffin skæring.

Her viser vi resultaterne fra at anvende standard-protokol til β-galactosidase histokemiske reaktion ved hjælp af X-gal som substrat i hele musen embryoner (figur 1 og figur 2). Ved hjælp af denne protokol, vi undersøger membran type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp) udtryk på forskellige embryonale udviklingsstadier (E9.5, E11.5 og E12.5) ved hjælp af Mt4-mmp mutant-mus, der udtrykker LacZ reporter under kontrol af den ...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og metoden til paraffin skæring og counterstaining. Dette er en nem og hurtig procedure til overvågning af genekspression under udvikling, som også kan anvendes til væv dele, organer eller dyrkede celler.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til sammenligning genekspression domæner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Labeling Påvisning af endogene receptorer fra zebrafisk embryoer

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk sporing ved hjælp af Confetti-musen til at studere mineraliseret væv

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser opsamling Microdissection af mus embryonale brusk og knogle for genekspression analyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...