Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

We bedank de histopathologische Service voor hun technische bijstand bij het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Wij danken ook Dr. Motoharu Seiki voor vriendelijk bieden Mt4-mmpLacZ muizen, en Dr. Alicia G. Arroyo om ons project te steunen en voor haar kritische lezing van het manuscript. Wij wensen Peter Bonney dank voor dit artikel proeflezen. Dit werk werd gesteund door Universidad Europea de Madrid door middel van een subsidie uit (# 2017UEM01) aan CSC

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) en de Comunidad Autónoma de Madrid om minimale dierenleed.
1. verzamelen van embryo's van zwangere muizen (van E8.5 naar E12.5)
<ol><li>Offeren zwangere muizen door cervicale dislocatie of CO2 inademing. De dag van de eerste waargenomen vaginale plug werd beschouwd als embryonale dag 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Leg het d...

Het LacZ-gen van E. coli is wijd verbeid gebruikt als verslaggever in studies van gen-expressiepatronen vanwege de hoge gevoeligheid en gebruiksgemak detectie. Dit protocol beschrijft een klassieke methode voor het opsporen van β-gal expressie gebaseerd op een enzymatische reactie die is eenvoudig en snel uit te voeren en goedkoop. Deze methode kan ook worden toegepast zonder belangrijke wijzigingen in de hele berg embryo's, intact organen, cryostaat weefselsecties of gekweekte cellen.
<p class="jove_conten...

Om specifiek gen expressiepatronen beschrijven, is het gebruik van verslaggever genen als markeringen primordiaal van Drosophila tot zoogdieren geweest. In proeven met dieren van transgene en knockout, is het bacteriële β-galactosidase-gen (LacZ) van Escherichia coli (E. coli) één van de wijdst gebruikte1,,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyseert de hydrolyse van β-galactosides (zoals lactose) in haar monosacchariden (glucose en galactose)5. Zijn meest gebruikte substraat is X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), een glycoside dat is gehydrolyseerd door β-galactosidase schadeveroorzakende in 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole en galactose. De eerste wordt geoxideerd tot een dimeer omgezet die, wanneer gebruikt in combinatie met kalium ferri- en ferro-cyanide, produceert een karakteristieke onoplosbare, blauwe kleur neerslag (Figuur 1)6.
Het LacZ -gen begon te worden gebruikt als een verslaggever gen meer dan dertig jaar geleden7,8. Meestal, LacZ is ingebracht stroomafwaarts van een endogene promotor in de plaats van de open leesraam, zodat het kan worden gebruikt in bacteriële en cel cultuur te visualiseren van cellen met een bepaalde invoegen, evenals in transgene dieren als een tracer van endogene Genetische expressiepatronen tijdens ontwikkeling9. In dit verband is de visualisatie van β-galactosidase-activiteit uitgebreid gebruikt in Drosophila te begrijpen van de ontwikkelings- en cellulaire processen van afzonderlijke cellen tot hele weefsels. Drosophila genetica gunst de generatie van stabiele lijnen waarin een gemodificeerde constructie van de P-element met het gen van de verslaggever dat lacz is ingevoegd op willekeurige locaties in het genoom. Dus, wanneer geplaatst onder invloed van enhancer elementen kan hij haar expressie rijden op een specifieke wijze van weefsel, waardoor een systematische analyse van de expressiepatronen van veel genen tijdens de afgelopen twee decennia10. Verder staat het gebruik van transgene muizen LacZ genuitdrukking controleren ook detectie van gene recombinatie gebeurtenissen door Cre-loxP gemedieerde recombinatie en lokalisatie van de mutant embryonale stamcellen derivaten in chimeer analyses 11, die de controle van LacZ expressie in specifieke weefsels zo goed als stoffelijk vergemakkelijkt. Ook in hele embryo's, kan detectie van de β-galactosidase-activiteit produceren differentiële kleuring patronen bij verschillende intensiteiten die gemakkelijk kunnen worden waargenomen in de verschillende ontwikkelingsstadia te analyseren van tijdelijke wijzigingen in genexpressie 8,12.
In dit artikel presenteren we een protocol om te visualiseren van genexpressie via X-gal vlekken in het weefsel van de hele berg op vroege ontwikkelingsstadia van muis embryo's. Wij presenteren deze histochemische methode als een zeer gevoelige en goedkope techniek die nauwkeurige detectie van de gelabelde cellen in de hele berg specimens of op cellulair niveau gunsten nadat paraffine-weefsels of embryo's ingebedde. De methode geschikt is voor de directe visualisatie van vlekken in het weefsel van de muis met de minimale achtergrond in vergelijking met andere methoden13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

De Escherichia coli LacZ gen, codering van β-galactosidase, wordt grotendeels gebruikt als verslaggever voor de expressie van genen en als een tracer in cel lineage studies. De klassieke histochemische reactie is gebaseerd op de hydrolyse van het substraat X-gal in combinatie met ijzer(III) en ferro ionen, die een onoplosbare blauwe neerslag die gemakkelijk produceert te visualiseren. Daarom, β-galactosidase-activiteit dient als een marker voor het patroon van de uitdrukking van het gen van belang aangezien de ontwikkeling te werk gaat. Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo's en de latere methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Bovendien is voorzien in een procedure voor de verduidelijking van de hele embryo's aan X-gal kleuring dieper de regio, van de embryo beter te visualiseren. Consistente resultaten worden verkregen door het uitvoeren van deze procedure, hoewel optimalisatie van omstandigheden nodig is om te minimaliseren van achtergrond activiteit. Beperkingen in de bepaling moeten ook worden overwogen, met name met betrekking tot de grootte van het embryo in het hele mount kleuring. Onze protocol biedt een gevoelige en een betrouwbare methode voor de detectie van de β-galactosidase tijdens de ontwikkeling van de muis die verder kan worden toegepast op de cryostaat secties, evenals de hele organen. Dus de dynamische gen expressiepatronen in de gehele ontwikkeling kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van dit protocol in hele embryo's, maar ook gedetailleerde expressie op het cellulaire niveau kan worden beoordeeld na paraffine segmenteren.

Hier tonen we de resultaten van de toepassing van het standaardprotocol voor de β-galactosidase histochemische reactie met behulp van X-gal als het substraat in hele muis embryo's (Figuur 1 en Figuur 2). Met behulp van dit protocol, onderzoeken we membraan type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp) expressie op verschillende embryonale ontwikkelingsstadia (E9.5, E11.5 en E12.5) met behulp van Mt4-mmp mutant muizen die uitdrukking...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo's en de methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Dit is een gemakkelijke en snelle procedure om te controleren van genexpressie tijdens de ontwikkeling die ook kan worden toegepast op weefselsecties, organen of gekweekte cellen.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo&#39;s

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...