Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

ברצוננו להודות השירות Histopathological לסיוע טכני שלהם ב- Cardiovasculares סנטרו נאסיונאל דה Investigaciones (CNIC). אנו מודים גם ד ר Seiki מוטוהארא עבור עכברים Mt4-mmpLacZ מתן בחביבות, ד ר אליסיה ג'י ארויו עבור תמיכה הפרויקט שלנו ועבור שלה קריאה ביקורתית של כתב היד. אנחנו רוצים להודות פיטר בוני להגהת מאמר זה. עבודה זו נתמך על ידי אוניברסיטת Europea דה מדריד באמצעות מענק (# 2017UEM01) הוענק C.S.C.

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares), את Autónoma קומונידד דה מדריד כדי להבטיח סבלם מינימלי של בעלי החיים.
1. אוסף של העוברים מן העכברים בהריון (מ E8.5 ל E12.5)
<ol><li>להקריב עכברים בהריון מאת נקע בצוואר הרחם או שאיפת2 C...

הגן LacZ e. coli כבר בשימוש נרחב בשל רגישות גבוהה קלות לזיהוי ככתב במחקרים דפוסי ביטוי גנים. בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה קלאסית לגילוי β-גל ביטוי בהתאם לתגובה אנזימטי זה קל ומהיר לביצוע כמו גם זול. בשיטה זו ניתן ליישם גם בלי שינויים הר כל העוברים, איברים שלמים, מקטעי רקמת cryostat או תאים בתרבית.<...

כדי לתאר דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, השימוש של הכתב גנים כסמני כבר ביותר מדרוזופילה . יונקים. בניסויים המערבים הטרנסגניים ובעלי נוקאאוט, הגן β-galactosidase חיידקי (LacZ) של Escherichia coli (e. coli) הוא אחד בשימוש נרחב ביותר1,2,3, 4. β-galactosidase (β-גל) ה מזרז הידרוליזה של β-galactosides (כגון לקטוז) לתוך שלו monosaccharides (גלוקוז, גלקטוז)5. המצע הנפוץ ביותר שלה הוא X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), גליקוזיד זה hydrolyzed מאת β-galactosidase והוליד 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole וגלקטוז. הראשון הוא מחומצן לתוך דיימר, בעת שימוש בשילוב עם אשלגן פרי-פרו-ציאניד, מייצרת של מאפיין לא מסיס, צבע כחול לזרז (איור 1)6.
הגן LacZ התחיל לשמש גן כתב לפני למעלה משלושים שנה7,8. בדרך כלל, מוכנס LacZ במורד הזרם של יזם אנדוגני במקום מסגרת קריאה פתוחה, אז זה יכול לשמש בתרבות בקטריאלי ותא להמחיש תאים המכילים של הוספה מסוים, כמו גם בבעלי חיים הטרנסגניים מכשיר מעקב של אנדוגני ג'ין תבניות ביטוי במהלך פיתוח9. בהקשר זה, החזיית β-galactosidase פעילות יש נעשה שימוש נרחב דרוזופילה להבין את התהליכים התפתחותית וסלולריות של תאים בודדים כל רקמות. דרוזופילה גנטיקה טובה הדור של קווים יציב שבו בונה P-אלמנט שונה המכיל את גן מדווח ש-lacz הוא מוכנס באופן אקראי מיקומים הגנום. לכן, כאשר מניחים תחת השפעת משפר אלמנטים זה ייתכן להסיע הביטוי שלה בצורה רקמות ספציפיות, אשר איפשר ניתוח שיטתי של דפוסי ביטוי של גנים רבים במהלך שני העשורים האחרונים10. בנוסף, השימוש של העכברים הטרנסגניים כדי לפקח על ביטוי גנים LacZ גם מאפשר זיהוי של גן אירועים רקומבינציה לפי Cre-loxP מתווכת רקומבינציה, לוקליזציה של נגזרות מוטציה בתאי גזע עובריים בניתוח chimeric 11, אשר מקלה על השליטה של LacZ ביטוי ברקמות ספציפיות כמו גם חנותם. כמו כן, בתוך כל העוברים, זיהוי של הפעילות β-galactosidase עשויה לייצר דיפרנציאלית מוכתמים דפוסי בעוצמות שונות, זה יכול להיות שנצפו בנוחות על פני שלבים התפתחותיים שונים כדי לנתח טמפורלית שינויים בביטוי הגנים 8,12.
במאמר זה, נציג פרוטוקול להמחיש ביטוי גנים דרך X-גל מכתים ברקמה הר שלם בשלבים התפתחותיים מוקדם של העכבר עוברי. אנו מציגים בשיטה זו פתולוגיה כמו טכניקה מאוד רגיש וזולה טובות איתור מדויק של התאים עם תוויות דגימות הר שלם או ברמה התאית לאחר פרפין מוטבע רקמות או עוברי. השיטה מאפשרת פריט חזותי ישיר מכתים ברקמה עכבר עם הרקע המינימלי כאשר לעומת שיטות אחרות13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

הגן Escherichia coli LacZ , קידוד β-galactosidase, משמש בעיקר כתב של ביטוי גנים וכן מכשיר מעקב במחקרים שושלת היוחסין התא. התגובה פתולוגיה הקלאסית מבוססת על הידרוליזה של המצע X-גל בשילוב עם יונים ferrous ו ferric, המייצרת לא מסיסים התמיסה כחול קל לדמיין. לכן, β-galactosidase פעילות משמשת כסמן את דפוס ביטוי של הגן עניין בפיתוח מתקדם. כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת עוקבות עבור פרפין חלוקתה ולא counterstaining. בנוסף, הליך שהבהרת כל העוברים מסופק משופרת של X-גל צביעת אזורים עמוקים יותר של העובר. תוצאות עקביות מתקבלים על ידי ביצוע הליך זה, למרות אופטימיזציה של תנאי ריאקציה יש צורך למזער את פעילות ברקע. מגבלות וזמינותו גם להתייחס, במיוחד לגבי הגודל של העובר מכתים כל הר. פרוטוקול שלנו מספק רגיש, שיטה אמינה לגילוי β-galactosidase במהלך פיתוח העכבר שניתן להחיל עוד סעיפים cryostat, כמו גם כל האיברים. לפיכך, דפוסי ביטוי גנים דינמי במהלך הפיתוח ניתן לנתח בקלות על-ידי שימוש בפרוטוקול זה כל העוברים, אך גם ביטוי מפורט ברמה התאית יכול להידרש לאחר חלוקתה פרפין.

הנה אנחנו מראים תוצאות החלת הפרוטוקול הסטנדרטי עבור התגובה פתולוגיה β-galactosidase באמצעות X-גל כמו המצע ב עכבר כל העוברים (איור 1 ואיור 2). באמצעות פרוטוקול זה, נבחן ממברנה סוג 4-מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (Mt4-mmp) ביטוי שלבים התפתחותיים עובריים שונים (E...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת העבודה פרפין חלוקתה ולא counterstaining. . זה הליך קלה ומהירה כדי לפקח על ביטוי גנים במהלך פיתוח שניתן להחילם גם על מקטעים של רקמות, איברים או תאים בתרבית.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...