Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

हम Centro Nacional de Investigaciones हृदयों (CNIC) में उनकी तकनीकी सहायता के लिए Histopathological सेवा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी कृपया Mt4-एमएमपीLacZ चूहों प्रदान करने के लिए dr. Motoharu Seiki धन्यवाद, और हमारी परियोजना के समर्थन के लिए और पांडुलिपि के उसे महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ एलिसिया जी अर्रोयो. हम इस लेख को ठीक करने के लिए पीटर Bonney शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । यह काम एक अनुदान के माध्यम से Universidad Europea de मैड्रिड द्वारा समर्थित किया गया था (# 2017UEM01) C.S.C. को संमानित किया

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं CNIC (Centro Nacional de Investigaciones हृदय) और कोमुनिदाद Autónoma de मैड्रिड के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ंयूनतम पशु दुख सुनिश्चित करने के लिए ।
1. गर्भवती चूहों ...

ई. कोलाई LacZ जीन व्यापक रूप से अपनी उच्च संवेदनशीलता और पता लगाने में आसानी की वजह से जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन में एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक एंजाइमी प्र...

आदेश में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए, मार्करों के रूप में रिपोर्टर जीन का उपयोग Drosophila से स्तनधारियों के लिए सर्वोपरि है । ट्रांसजेनिक और नॉकआउट जानवरों को शामिल प्रयोगों में, बैक्टीरियल β-galactosidase जीन (LacZ) ई कोलाई (ई. कोलाई) में से एक है सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalyzes के hydrolysis में β-galactosides (जैसे लैक्टोज) को अपनी monosaccharides (ग्लूकोज और गैलेक्टोज)5. इसके सबसे अधिक इस्तेमाल किया सब्सट्रेट एक्स-लड़की है (5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), एक ग्लाइकोसाइड है कि β-hydrolyzed दे वृद्धि करने के लिए 5-galactosidase-4-ब्रोमो-3-क्लोरोफ्लूरोकार्बन और hydroxyindole के द्वारा गैलेक्टोज है । पहले एक डिमर में ऑक्सीकरण हो जाता है कि, जब पोटेशियम फेरी के साथ संयुक्त इस्तेमाल किया-और लोह-साइनाइड, एक विशेषता अघुलनशील पैदा करता है, नीला रंग हाला (चित्रा 1)6.
LacZ जीन तीस साल पहले7,8पर एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया जाना शुरू कर दिया । आमतौर पर, LacZ खुले पढ़ने के फ्रेम के स्थान पर एक अंतर्जात प्रमोटर के बहाव डाला है, तो यह बैक्टीरियल और कोशिका संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है एक विशेष डालने वाले कोशिकाओं कल्पना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंतर्जात के एक अनुरेखक के रूप में ट्रांसजेनिक जानवरों में विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न9. इस संबंध में, β-galactosidase गतिविधि के दृश्य बड़े पैमाने पर पूरे ऊतकों के लिए एकल कोशिकाओं से विकास और सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए Drosophila में इस्तेमाल किया गया है. Drosophila आनुवंशिकी स्थिर लाइनों में एक संशोधित पी-तत्व रिपोर्टर जीन LacZ युक्त का निर्माण करने के जीनोम में यादृच्छिक स्थानों पर डाला जाता है की पीढ़ी एहसान । इस प्रकार, जब बढ़ाने के तत्वों के प्रभाव के तहत रखा यह एक ऊतक विशिष्ट तरीके से अपनी अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं, जो पिछले दो दशकों के दौरान10कई जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के व्यवस्थित विश्लेषण की अनुमति दी है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने के लिए LacZ जीन अभिव्यक्ति की निगरानी भी Cre-loxP मध्यस्थता पुनर्संयोजन द्वारा जीन पुनर्संयोजन की घटनाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, और उत्परिवर्ती भ्रूण स्टेम सेल डेरिवेटिव के स्थानीयकरण chimeric विश्लेषण में 11, जो विशिष्ट ऊतकों में LacZ अभिव्यक्ति के नियंत्रण के साथ ही लौकिक की सुविधा । इसके अलावा, पूरे भ्रूण में, β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने विभिंन तीव्रता है कि आसानी से विभिंन विकास चरणों में मनाया जा सकता है जीन अभिव्यक्ति में लौकिक परिवर्तन का विश्लेषण में धुंधला पैटर्न का उत्पादन कर सकते है 8,12.
इस अनुच्छेद में, हम एक के लिए एक्स के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति कल्पना प्रोटोकॉल वर्तमान माउस भ्रूण के प्रारंभिक विकास चरणों में पूरे पर्वत ऊतक में धुंधला लड़की । हम एक अति संवेदनशील और सस्ती तकनीक है कि या तो पूरे माउंट नमूनों में या तेल एंबेडेड ऊतकों या भ्रूण के बाद सेलुलर स्तर पर लेबल कोशिकाओं का सही पता लगाने के पक्ष के रूप में इस histochemical विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि ंयूनतम पृष्ठभूमि के साथ माउस के ऊतकों में धुंधला के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है जब अंय13तरीकों के साथ तुलना में ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

ई कोलाई LacZ जीन, β-galactosidase, मोटे तौर पर जीन अभिव्यक्ति के लिए एक रिपोर्टर के रूप में प्रयोग किया जाता है और कोशिका वंश अध्ययन में एक अनुरेखक के रूप में. शास्त्रीय histochemical प्रतिक्रिया सब्सट्रेट एक्स के hydrolysis पर आधारित है, घाट और लौह आयनों के साथ संयोजन में लड़की है, जो एक अघुलनशील नीले वेग है कि कल्पना करने के लिए आसान है पैदा करता है । इसलिए, β-galactosidase गतिविधि विकास आय के रूप में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है । यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल खोदी और counterstaining के लिए बाद में विधि. इसके अतिरिक्त, पूरे भ्रूण स्पष्ट करने के लिए एक प्रक्रिया को बेहतर एक्स-भ्रूण के गहरे क्षेत्रों में लड़की धुंधला कल्पना प्रदान की जाती है । इस कार्यविधि को निष्पादित करने से सुसंगत परिणाम प्राप्त होते हैं, हालांकि पृष्ठभूमि गतिविधि को कम करने के लिए प्रतिक्रिया शर्तों का अनुकूलन आवश्यक है । परख में सीमाएं भी विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से पूरे माउंट धुंधला में भ्रूण के आकार के बारे में । हमारा प्रोटोकॉल माउस के विकास के दौरान β-galactosidase डिटेक्शन के लिए एक संवेदनशील और एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है जिसे आगे cryostat वर्गों के साथ-साथ पूरे अंगों पर लागू किया जा सकता है । इस प्रकार, गतिशील जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विकास में आसानी से पूरे भ्रूण में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन यह भी सेलुलर स्तर पर विस्तृत अभिव्यक्ति तेल खोदी के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है ।

यहाँ हम β-galactosidase histochemical प्रतिक्रिया एक्स का उपयोग कर के लिए मानक प्रोटोकॉल लागू करने से परिणाम दिखाने के पूरे माउस भ्रूण में सब्सट्रेट के रूप में लड़की (चित्रा 1 और चित्रा 2</stro...

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Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति अनुरेखण

यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल अनुभागिंग और counterstaining के लिए विधि. यह एक आसान और त्वरित प्रक्रिया है कि विकास के दौरान जीन की अभिव्यक्ति पर नजर रखने के लिए भी ऊतक वर्गों, अंगों या प्रसंस्कृत कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

माउस Preimplantation भ्रूण में वंश विशिष्टता का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक विश्लेषण

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय साबुत माउंट<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण में जीन एक्सप्रेशन डोमेन की तुलना के लिए<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Zebrafish भ्रूण से अंतर्जात रिसेप्टर्स की आत्मीयता लेबल जांच

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Chimeric zebrafish भ्रूण में अलग-अलग रेटिना प्रोजेनिटर्स में ट्रांसजेनिक जीन एक्सप्रेशन के vivo इमेजिंग में सेल Nonautonomous प्रभावों का अध्ययन करने के लिए

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish जल्दी भ्रूण और ट्यूमर में सेलुलर विद्युत गतिविधि के दृश्य

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

एवियन भ्रूण में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

खनिजीकृत ऊतकों का अध्ययन करने के लिए Confetti माउस का उपयोग कर क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माउस भ्रूणीय उपास्थि और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए हड्डी

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...