Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares (CNIC) でその技術支援の病理組織学的サービスに感謝したいと思います。我々 はまた私たちのプロジェクトを支援するためと原稿の彼女の重要な読書の親切の提供する Mt4 mmpLacZマウスの清木元治博士と博士アリシア G. アロヨを感謝します。我々 はこの記事を校正のピーター ・ ボニーを感謝したいと思います。この作品は、C.S.C. に与えられる助成金 (# 2017UEM01) によるエウロペア デ マドリッドによって支えられました。

すべての実験手順は、CNIC (セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares) と、マドリード ・ アウトノマ コムニダード最小限動物の苦しみを確保するための動物実験の倫理委員会によって承認されました。
1. (E12.5 に E8.5) から妊娠のマウス胚のコレクション
<ol><li>頚部転位または CO2吸入のいずれかによって妊娠マウスを犠牲に。最初の日は、膣にプラグは胚と考え?...

エシェリヒア属大腸菌の LacZ の遺伝子は、その高い感度と検出の容易さのため記者として遺伝子発現パターンの研究に広く使用されています。この議定書では、簡単かつ迅速に安価なだけでなく、実行する酵素反応に基づく β gal 式を検出するための古典的な方法について説明します。このメソッドは、全台紙胚、そのまま臓器、組織切片や培養細胞での大幅な変更なしも適用できま?...

特定の遺伝子発現パターンを記述するためにレポーター遺伝子マーカーとしての使用は、ショウジョウバエから哺乳類を最優先されています。トランスジェニック、ノックアウト動物を含む実験でエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 遺伝子細菌の β-ガラクトシダーゼ (LacZ) は最も広く使用されている1,2,3,のいずれか4. β-ガラクトシダーゼ (β gal) 単糖類 (ブドウ糖そしてガラクトース)5に β-ラクトースリプレッサー (乳糖) などの加水分解を触媒します。その最も一般的に使用される基質は X-ガロン (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)、β-ガラクトシダーゼを生み出してラクトースオペロンとガラクトースで加水分解する配糖体です。最初は逆に酸化二量体で使用するとカリウム フェリと組み合わせる-鉄シアン化物の生成特性不溶性、青色沈殿 (図 1)6。
LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として 30 年以上前に使用される開始7,8。LacZの挿入、通常使用できるようにされるトランスジェニック動物、特定の挿入を含む細胞を可視化する細菌および細胞培養の内因性のトレーサーとして開いたリーディング ・ フレームの代わりに内因性プロモーターの下流開発9中遺伝子発現パターン。この点では、β-ガラクトシダーゼ活性の可視化使用されています広範囲ショウジョウバエの全体の組織を単一セルから発達と細胞のプロセスを理解します。ショウジョウバエの遺伝学はゲノム内の場所ランダムには、 LacZレポーター遺伝子を含んでいる変更された P 要素構造を挿入する安定したラインを生成を支持します。したがって、エンハンサー要素の影響下に置かれるときそれは過去二十年10の間に多くの遺伝子の発現パターンの体系的な分析を許可している組織の特定方法でその表現を駆動があります。また、 LacZ遺伝子の発現を監視するトランスジェニック マウスも使用するタゲネーシスによる遺伝子組換えイベントの検出を介した交叉およびキメラ解析の突然変異体の胚性幹細胞誘導体の局在11、一時的同様にある特定の臓器のLacZ発現の制御を容易にします。また、全胚で、β-ガラクトシダーゼ活性の検出可能性があります便利なの遺伝子発現の変化を解析するさまざまな発達段階にわたって観察できる強度の異なる差分の染色パターンを生産8,12。
この記事でマウス胚の初期の発達段階で全台紙組織染色 X gal 遺伝子発現を可視化するためのプロトコルを提案する.パラフィン埋組織や胚後標識細胞全載標本または細胞レベルでの正確な検出を支持する高感度・安価な手法としてこの組織化学的手法を提案する.メソッドは、13他の方法と比較すると最低限の背景を持つマウス組織染色の直接可視化できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

遺伝子発現のレポーター、細胞系譜研究におけるトレーサーとして、大腸菌の LacZ遺伝子、β-ガラクトシダーゼは主として使用されます。古典的な化学反応は基質 X gal が見やすい不溶性の青い沈殿物を生成する鉄と鉄イオンとの組み合わせでの加水分解に基づいています。したがって、開発が進むにつれて、β-ガラクトシダーゼ活性は興味の遺伝子の発現パターンのためのマーカーとして機能します。ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片と counterstaining の後続のメソッドについて述べる。さらに、X gal 胚の深い地域で染色を見やすくします全体の胚を明らかにするための手順が提供されます。一貫性のある結果は、反応条件の最適化がバック グラウンド アクティビティを最小限に抑える必要がこの手順を実行することによって得られます。試金の制限もに配慮すべき、特に全台紙の染色で, 胚の大きさ。我々 のプロトコルは、敏感な切片として全臓器にさらに適用できるマウス開発中に β-ガラクトシダーゼ検出のための信頼性の高い方法を提供します。したがって、開発全体を通して動的な遺伝子発現パターンを全胚で、このプロトコルを使用して、簡単に分析できますが、パラフィン切片後も細胞レベルで詳細な式を評価できます。

(図 1および図 2) 全体のマウス胚における基板として X gal を使用して β-ガラクトシダーゼの組織化学的反応の標準的なプロトコルを適用した結果を示す.このプロトコルを使用して、我々 は胚発達段階 (E9.5、E11.5、E12.5) を別に膜型マトリックスメタロプロテアーゼ 4 (Mt4 mmp) 式を調べて、内因性の制御の下で LacZ レポーター?...

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Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片および counterstaining の方法について述べる。これはティッシュ セクションにも適用することができます開発における遺伝子の発現を監視する簡単かつ迅速な手続を器官または培養細胞。

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...