Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

우리는 그들의 기술 지원에 대 한 Histopathological 서비스 센트 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)에 감사 하 고 싶습니다. 지원 우리의 프로젝트 및 원고 그녀의 중요 한 독서에 대 한 우리는 또한 친절 하 게 제공 Mt4 mmpLacZ 마우스, 박사 전 部와 박사 엘리샤 G. 아로요를 감사. 피터 Bonney이이 문서를 교정 하는 것을 감사 하 길. 이 이는 그랜트 (# 2017UEM01) C.S.C.에 게 수 여에 의하여 대학 Europea 마드리드에 의해 지원 되었다

모든 실험 절차는 최소한의 동물의 고통을 CNIC (센트로 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares)과 지방의 Autónoma 드 마드리드의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. (E12.5에 E8.5)에서 임신 쥐에서 배아의 수집
<ol><li>자 궁 경관 탈 구 또는 CO2 흡입에 의해 임신 쥐를 희생. 첫 번째의 하루 질 플러그 배아 여겨졌다 관찰 하루 0.5 (E0.5).</li>
	<li>흡수 성 패드에 부정?...

대장균 LacZ 유전자 널리 사용 되었습니다 유전자 표현 패턴의 연구에 기자로 서의 높은 감도 및 검출의 용이성. 현재 프로토콜은 간단 하 고 저렴 한 뿐만 아니라 수행 하는 효소 반응에 따라 β-gal 식 탐지 하기 위한 고전적인 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 또한 전체 마운트 배아, 그대로 장기, cryostat 조직 섹션 또는 배양된 세포에서 중요 수정 없이 적용할 수 있습니다.
<p class="jove_cont...

특정 유전자 표현 패턴을 설명 하기 위해 기자 유전자 마커로 사용 초파리 에서 포유동물에 최고 되었습니다. 유전자 변형 및 녹아웃 동물 관련 된 실험, 대장균 (대장균)의 세균 β-galactosidase 유전자 (LacZ) 가장 널리 사용 되는1,2,3, 중 하나입니다. 4. β-galactosidase (β-gal)의 단 (포도 당 그리고 갈 락 토스)5에 β-galactosides (유 당) 등의 가수분해를 catalyzes. 가장 일반적으로 사용 되는 기판은 X-여자 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galactosidase 주는 상승 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole 그리고 갈 락 토스로 분해 glycoside 했다. 첫 번째는 이합체에 산화, 사용 하는 경우 칼륨 ferri 결합-및 페로 시안 화물 생산 특성 불용 성, 파란색 침전 (그림 1)6.
LacZ 유전자 이상 30 년 전 리포터 유전자로 사용 될 시작7,8. LacZ 삽입은 일반적으로, 그것은 내 생의 추적으로 유전자 변형 동물에서 뿐만 아니라 특정 삽입, 포함 된 셀을 시각화 하기 위해 박테리아와 세포 문화에 사용 될 수 있도록 열려있는 독서 프레임 대신 생 발기인의 하류 유전자 개발9중 식 패턴입니다. 이와 관련, β-galactosidase 활동의 시각화는 광범위 하 게 사용 되었다 초파리 에서 전체 조직에 단일 셀에서 개발 및 세포 프로세스를 이해 하. 초파리 유전학 부탁 있는 LacZ 는 취재 원 유전자를 포함 하는 수정 된 P 요소 구문 삽입 위치는 게놈에 무작위로 안정적인 라인의 세대. 따라서, 증강 요소의 영향 아래에 배치 하는 경우 그것은 수 있습니다 드라이브의 식을 조직 특정 방식으로, 지난 2 년간10동안 많은 유전자의 표현 패턴의 체계적인 분석을 허용 했다. 또한, 유전자 변형 생쥐 LacZ 유전자 발현 모니터링의 사용 또한 수 있습니다 Cre loxP 유전자 재조합 이벤트의 중재 재결합, 그리고 공상 분석 돌연변이 배아 줄기 세포 유래의 지역화 11, 용이 하 게 특정 조직에 LacZ 식의 제어 뿐만 아니라 일시적으로. 전체 배아의 β-galactosidase 활동의 일시적인 유전자 발현 에서에서 분석에 다른 발달 단계에 걸쳐 편리 하 게 관찰 될 수 있다 다른 농도에서 차동 얼룩 패턴을 생성 될 수 있습니다 또한, 8,12.
이 문서에서는, 선물이 X gal 통해 유전자 발현을 시각화 하는 프로토콜 마우스 배아의 초기 발달 단계에서 전체 산 조직에 얼룩. 우리는 파라핀 조직 또는 배아를 포함 하는 후 전체 산 표본 또는 세포 수준에서 레이블이 지정 된 셀의 정확한 탐지를 호의 매우 민감하고 저렴 한 기술로이 조직화 학적인 방법 제시. 메서드를 사용 하면 다른 방법13와 비교할 때 최소 배경과 마우스 조직에 얼룩의 직접적인 시각화 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

Β-galactosidase, 인코딩 대장균 LacZ 유전자, 유전자 발현에 대 한 기자로 서 고 세포 계보 연구에서 추적 프로그램으로 크게 사용 된다. 클래식 조직화 학적인 반응은 쉽게 시각화 하는 불용 성 푸른 침전을 생성 하 고 철 제 2 철 이온, 함께에서 기판 X gal의 가수분해를 기반으로 합니다. 따라서, β-galactosidase 활동은 관심사의 유전자의 표현 패턴에 대 한 표식으로 개발 진행 있습니다. 여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 후속 방법 설명. 또한, 전체 배아를 명확히 하는 절차는 더 나은 X-여자 태아의 더 깊은 영역에 얼룩을 시각화 하 제공 됩니다. 반응 조건의 최적화 백그라운드 작업을 최소화 하는 데 필요한 있지만 일관 된 결과이 절차를 수행 하 여 얻을 수 있습니다. 분석 결과에 한계 고려 되어야 한다 또한, 특히 전체 마운트 얼룩에서 태아의 크기에 관한. 우리의 프로토콜 민감하고 cryostat 섹션 뿐만 아니라 모든 장기에 더 적용할 수 있는 마우스 개발 중 β-galactosidase 탐지에 대 한 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 따라서, 개발에 걸쳐 동적 유전자 표현 패턴 전체 태아에서이 프로토콜을 사용 하 여 쉽게 분석 될 수 있다 그러나 또한 세포 수준에서 상세한 식 파라핀 단면 후 평가 될 수 있다.

여기 우리는 X-gal을 사용 하 여 전체 마우스 배아 (그림 1 및 그림 2)에서 기판으로 β-galactosidase 조직화 학적인 반응에 대 한 표준 프로토콜을 적용 결과 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 우리는 서로 다른 배아 발달 단계 (E9.5, E11.5, 및 E12.5)에 막 유형 4 매트릭스 metalloproteinase (Mt4-mmp) 식 검사 LacZ 기자는 내 생의 통제를 표현 ...

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Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 방법을 설명 합니다. 이것은 개발 조직 단면도에 또한 적용 될 수 있는 유전자 발현을 모니터링 하는 간단 하 고 빠른 절차 기관 또는 배양된 세포.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

연구

발생학

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...