Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Histopathological tjenesten for deres kundestøtte på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for vennlige gi Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo for å støtte vårt prosjekt og hennes kritisk lesning av manuskriptet. Vi ønsker å takke Peter Bonney for korrekturlesing av denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av Universidad Europea de Madrid med stipend (# 2017UEM01) til C.S.C.

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av komité for etikk av dyr eksperimenter av CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) og Comunidad Autónoma de Madrid for å sikre minimal dyr lider.
1. innsamling av embryoer fra gravid mus (fra E8.5 til E12.5)
<ol><li>Ofre gravid mus cervical forvridning eller CO2 innånding. Dagen i først observert vaginal plug ble ansett som embryonale dag 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Lå dyr i supine posisjon på den absorberende puten...

E. coli LacZ genet har vært mye brukt som reporter i studier av genet uttrykk mønstre på grunn av dens høy følsomhet og enkel oppdagelsen. Nåværende protokollen beskriver en klassisk metode for å oppdage β-gal uttrykk basert på en enzymatisk reaksjon som er raskt og enkelt å utføre og billig. Denne metoden kan brukes også uten store endringer i hele mount embryo, intakt organer, kryostaten vev deler eller kulturperler celler.
Nøyaktig anvendelse av denne metoden resulter...

For å beskrive spesifikke genet uttrykk mønstre, er bruk av reporteren gener som markører viktig fra Drosophila for pattedyr. Eksperimenter med transgene og knockout dyr, er bakteriell β-galactosidase genet (LacZ) av Escherichia coli (E. coli) en av de mest brukte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) gir hydrolyse av β-galactosides (for eksempel laktose) i monosaccharides (glukose og galaktose)5. Det mest brukte underlaget er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycoside som er hydrolyzed av β-galactosidase gir opphav til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galaktose. Først er oksidert i således en dimer som, når kombinert med kalium ferri- og ferro-cyanid, produserer en karakteristisk uløselig, blått utløse (figur 1)6.
LacZ genet begynte å bli brukt som en reporter genet over tretti år siden7,8. Vanligvis LacZ settes nedstrøms en endogen formidler stedet åpent lesing rammen, slik at den kan brukes i bakteriell og cellen kultur visualisere cellene som inneholder en bestemt setter og transgene dyr som en tracer av endogene Gene expression mønstre under utvikling9. I denne forbindelse har visualisering av β-galactosidase aktivitet vært mye brukt i Drosophila for å forstå de utviklingsmessige og cellulære prosessene fra enkeltceller hele vev. Drosophila arvelighetsforskning favorisere generering av stabil linjer som en endret P-element konstruksjon som inneholder reporter genet LacZ er satt inn tilfeldig steder i genomet. Dermed når plassert under påvirkning av enhancer elementer kan det drive sitt uttrykk i en vev bestemt måte, som har tillatt systematisk analyse av uttrykk mønstre av mange gener i løpet av de siste to tiår10. I tillegg kan bruken av transgene mus å overvåke LacZ genuttrykk også påvisning av genet rekombinasjon hendelser etter grobunn-loxP mediert rekombinasjon, og lokalisering av mutant embryonale stamcelleforskningen derivater i chimeric analyser 11, som forenkler kontroll av LacZ uttrykk i bestemte vev også som timelig. Også i hele embryoer, kan oppdagelsen av β-galactosidase aktivitet produsere differensial flekker mønstre på forskjellige intensiteter som enkelt kan observeres over forskjellige utviklingsstadier analysere tidsmessige endringer i genuttrykk 8,12.
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å visualisere genuttrykk gjennom X-gal flekker i hele mount vev på tidlig i utviklingen etapper av mouse embryoer. Vi presenterer denne histochemical metoden som en svært følsom og billig teknikk som favoriserer nøyaktig påvisning av merket cellene i hele mount prøver eller på cellenivå etter parafin innebygd vev eller embryoer. Metoden tillater direkte visualisering av flekker i musen vevet med minimum bakgrunnen sammenlignet med andre metoder13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

Escherichia coli LacZ genet, koding β-galactosidase, brukes hovedsakelig som en reporter for genuttrykk og en tracer i celle avstamning studier. Klassisk histochemical reaksjonen er basert på hydrolyse av underlaget X-gal i kombinasjon med ferric og jern ioner, som produserer en uløselig blå bunnfall som er lett å visualisere. Derfor fungerer β-galactosidase aktivitet som en markør for uttrykket mønsteret av genet av interesse som utviklingen fortsetter. Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og påfølgende metoden for parafin snitting og counterstaining. I tillegg tilbys en prosedyre for å avklare hele embryo bedre visualisere X-gal flekker i dypere områder av fosteret. Konsekvente resultater er oppnådd ved å utføre denne prosedyren, selv om optimalisering av reaksjonen forhold er nødvendig for å minimere bakgrunn aktivitet. Begrensninger i analysen bør også vurderes, spesielt om størrelsen av embryoet i hele mount flekker. Våre protokollen gir en følsom og en pålitelig metode for påvisning av β-galactosidase under musen utvikling som kan brukes mer kryostaten deler samt hele organer. Dermed dynamisk genet uttrykk mønstre gjennom utvikling enkelt kan analyseres ved hjelp av denne protokollen i hele embryoer, men også detaljert uttrykk på cellenivå kan vurderes etter parafin snitting.

Her viser vi resultatene av å bruke standardprotokollen for av β-galactosidase histochemical reaksjon med X-gal som underlaget i hele mouse embryoer (figur 1 og figur 2). Bruker denne protokollen, vi undersøke membran type 4-matrise metalloproteinase (Mt4-mmp) uttrykk på ulike embryonale utviklingsstadier (E9.5, E11.5 og E12.5) bruker Mt4-mmp mutant mus som uttrykker LacZ reporteren under kontroll av den endogene Mt4-mmp prom...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og metoden for parafin snitting og counterstaining. Dette er en enkel og rask prosedyre å overvåke genuttrykk under utvikling som kan også brukes til vev deler, organer eller kulturperler celler.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering for Sammenligning av genekspresjon domener i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Merking Påvisning av endogene reseptorer fra Sebrafisk embryo

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av transgene genuttrykk i Individuell Netthinnestamfedre i kimære Sebrafisk embryoer å studere Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av mobilnettet elektrisk aktivitet i sebrafisk tidlig embryo og svulster

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk tracing bruke konfetti musen til å studere Mineralisert vev

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser Capture Microdissection av mus embryonale brusk og bein for Gene Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...