Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer o serviço histopatológico para sua assistência técnica com o Centro Nacional de investigações Cardiovasculares (CNIC). Também agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para fornecer gentilmente Mt4-mmpLacZ ratos e Dr. Alicia G. Arroyo para apoiar nosso projeto e para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer Peter Bonney para revisão deste artigo. Este trabalho foi apoiado pela Universidad Europea de Madrid por meio de uma subvenção (# 2017UEM01) atribuída a C.S.C

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal o CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) e da Comunidad Autónoma de Madrid, para garantir o mínimo sofrimento dos animais.
1. coleta de embriões de ratos grávidas (de 8.5 para E12.5)
<ol><li>Sacrificar os ratos grávidas por deslocamento cervical ou inalação de CO2 . O dia do primeiro observado plug vaginal foi considerada embrionária dia 0,5 (E0.5).</...

O gene LacZ Escherichia coli tem sido amplamente utilizado como um repórter em estudos de padrões de expressão de gene, devido à sua alta sensibilidade e facilidade de deteção. O presente protocolo descreve um método clássico para detectar a expressão de β-gal, baseado em uma reação enzimática que é fácil e rápido para executar, bem como o baixo custo. Esse método pode ser aplicado também sem grandes modificações em embriões de toda montagem, órgãos intactos, seções do criostato do tecid...

A fim de descrever os padrões de expressão de genes específicos, o uso de genes repórter como marcadores tem sido fundamental da drosófila para mamíferos. Em experimentos envolvendo animais transgénicos e nocaute, o gene bacteriano β-galactosidase (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) é um dos mais amplamente utilizado1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalisa a hidrólise da β-galactosidioss (por exemplo, lactose) em seus monossacarídeos (glicose e galactose)5. Seu substrato mais comumente usado é o X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), um glucosídeo que é hidrolisado por β-galactosidase fundadas 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galactose. O primeiro é oxidado em um dímero que, quando usados combinados com potássio ferri- e ferro-cianeto, produz uma característica insolúvel, o precipitado de cor azul (Figura 1)6.
O gene LacZ começou a ser usado como um gene repórter, há mais de trinta anos de7,8. Geralmente, LacZ é inserida a jusante de um promotor endógeno no lugar do frame de leitura aberto, então ele pode ser usado na cultura bacteriana e célula para visualizar células contendo um encarte especial, bem como em animais transgénicos como um traçador de endógena padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento,9. A este respeito, a visualização da atividade de β-galactosidase tem sido usada extensivamente em Drosophila para compreender os processos de desenvolvimento e celulares de células únicas para tecidos. Genética da Drosophila favorece a geração de linhas estáveis em que uma construção P-elemento modificada, contendo o gene repórter que lacZ é inserido aleatoriamente posições no genoma. Assim, quando colocado sob a influência de elementos potenciador pode dirigir sua expressão de maneira específica de tecido, que permitiu a análise sistemática dos padrões de expressão de diversos genes durante as duas décadas passadas10. Além disso, o uso de ratos transgênicos para monitorar a expressão do gene LacZ também permite a detecção de eventos de recombinação genética por Cre-loxP mediada por recombinação e localização dos derivados de células-tronco embrionárias mutante em análises quiméricoes 11, que facilita o controle da expressão de LacZ em tecidos específicos, bem como temporalmente. Além disso, em todo embriões, deteção da atividade β-galactosidase pode produzir padrões de coloração diferenciais em intensidades diferentes que podem ser convenientemente observados em diferentes estádios de desenvolvimento para analisar mudanças temporais na expressão do gene 8,12.
Neste artigo, apresentamos um protocolo para visualizar a expressão do gene através do X-gal mancha no tecido toda montagem em estágios iniciais de desenvolvimento de embriões do rato. Apresentamos este método histoquímico como uma técnica altamente sensível e de baixo custo que favorece a detecção precisa das pilhas etiquetadas em espécimes de montagem inteira ou a nível celular, depois incorporado de parafina tecidos ou embriões. O método permite a visualização directa da mancha no tecido do mouse com o plano de fundo mínimo quando comparado com outros métodos de13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

O gene de Escherichia coli LacZ , codifica a β-galactosidase, é largamente utilizado como um repórter para a expressão de gene e como um tracer em estudos de linhagem celular. A clássica reação histochemical baseia-se a hidrólise do substrato X-gal em combinação com íons férricos e ferrosos, que produz um precipitado azul insolúvel que é fácil de Visualizar. Portanto, atividade de β-galactosidase serve como um marcador para o padrão de expressão do gene de interesse como o desenvolvimento prossegue. Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método subsequente para parafina de seccionamento e counterstaining. Além disso, está previsto um procedimento para clarificar todo embriões para visualizar melhor o X-gal em regiões mais profundas do embrião. Resultados consistentes são obtidos por meio deste procedimento, apesar de otimização das condições de reação é necessária para minimizar as atividades do fundo. Limitações no ensaio devem ser também consideradas, particularmente sobre o tamanho do embrião no monte de toda mancha. Nosso protocolo fornece um sensível e um método confiável para detecção de β-galactosidase durante o desenvolvimento do mouse que pode ser mais aplicado para as seções do criostato, bem como os órgãos inteiros. Assim, os padrões de expressão de gene dinâmico durante todo o desenvolvimento podem ser facilmente analisados usando este protocolo em embriões de todo, mas também detalhada expressão a nível celular pode ser avaliada após corte de parafina.

Aqui nós mostramos os resultados da aplicação do protocolo padrão para a reação de β-galactosidase histochemical usando X-galão como substrato em embriões de rato inteiro (Figura 1 e Figura 2). Usando este protocolo, podemos examinar a membrana tipo 4-matriz de metaloproteinase (mmp-Mt4) expressão em diferentes fases do desenvolvimento embrionários (E9.5, E11.5 e E12.5) usando Mt4-mmp ratos mutantes que expressam o rep...

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Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método de parafina seccionamento e counterstaining. Este é um procedimento fácil e rápido para monitorar a expressão gênica durante o desenvolvimento, o que também pode ser aplicado às secções de tecidos, órgãos ou células cultivadas.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Biologia do Desenvolvimento

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Rastreamento genético clonal usando o mouse confetti para estudar tecidos mineralizados

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...