Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить службу гистопатологические их технической помощи в Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Мы также благодарим д-р Motoharu Seiki для любезно предоставление Mt4-ММЗLacZ мышей и д-р Алисия G. Арройо, для поддержки нашего проекта и для ее критического чтения рукописи. Мы хотим поблагодарить Питера Бонни для корректуры этой статьи. Эта работа была поддержана Europea Мадридский посредством гранта (# 2017UEM01) в ЦСК

Все экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом по этике животных эксперименты CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) и Autónoma Comunidad де Мадрид для обеспечения минимальной животное страдает.
1. сбор эмбрионов от беременных мышей (от E8.5 до E12.5)
<ol><li>Пожертвуйте беременны...

E. coli ген LacZ широко используется как репортер в исследованиях картин выражения гена из-за его высокой чувствительностью и легкости обнаружения. Настоящий Протокол описывает классический метод для обнаружения β-Гал выражение на основе ферментативные реакции, которая легко и быстр?...

Для того чтобы описать картин выражения определенного гена, использование репортер генов как маркеры был исключительно от дрозофилы до млекопитающих. В экспериментах с участием нокаут и трансгенных животных гена бактериальной β-галактозидазы (LacZ) Escherichia coli (E. coli) является одним из наиболее широко используемых в1,2,3, 4. β-галактозидазы (β-gal) катализирует гидролиз β-galactosides (например, лактоза) в моносахариды (глюкозы и галактозы)5. Его наиболее часто используемые субстрата является X-Гал (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), гликозид, гидролизуется по β-галактозидазы приведшего к 5-бромо-4-хлоро-3-гидроксииндол и галактозы. Первый окисляется в димер, когда используется в сочетании с Ферри калия- и Ферро цианид, производит характерный нерастворимые, синий цвет осадок (рис. 1)6.
Ген LacZ начал использоваться как репортер ген более тридцати лет назад7,8. Обычно, вставляется LacZ вниз по течению от эндогенных промоутер месте открытой чтении кадра, поэтому она может использоваться в культуре бактерий и клеток для визуализации ячеек, содержащих определенного Вставка, а также в трансгенных животных как трассировщик эндогенных картин выражения гена во время развития9. В этой связи визуализация активности β-галактозидазы широко применяется в дрозофилы для понимания развития и клеточных процессов от единичных клеток во всей ткани. Генетики дрозофилы пользу поколение стабильной линий, в которых изменение P-элемент конструкции, содержащие Репортер ген LacZ , вставляется наугад мест в геноме. Таким образом когда под влиянием усилитель элементы он может диск свое выражение определенным образом ткани, которая позволила систематический анализ структуры выражения многих генов в течение последних двух десятилетий10. Кроме того использование трансгенных мышей для мониторинга LacZ экспрессии генов также позволяет обнаружение событий рекомбинации генов, КРР loxP при посредничестве рекомбинации и локализации производных мутант эмбриональных стволовых клеток в химерных анализа 11, которая облегчает контроль LacZ выражения в определенных тканях также как височно. Кроме того в целом эмбрионов, обнаружение активности β-галактозидазы может производить дифференцированного окрашивания моделей на различной интенсивности, которые можно удобно наблюдать через различные этапы развития проанализировать временные изменения в экспрессии генов 8,12.
В этой статье мы представляем протокол для визуализации экспрессии генов через X-Гал пятнать в целом гора ткани на ранних этапах своего развития зародышей мыши. Мы представляем этот гистохимический метод как весьма деликатного и недорогой техники, которая выступает точное обнаружение помеченных клеток в целом гора образцов или на клеточном уровне, после того, как парафин-врезанных тканей или эмбрионов. Метод позволяет для прямого визуализации окрашивание ткани мыши с минимальное образование по сравнению с другими методами13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

Кишечная палочка LacZ гену, β-галактозидазы, в основном используется как репортер экспрессии генов и как трассировщик клеток линии исследований. Классическая гистохимические реакция основана на гидролиз субстрата X-гал в сочетании с ионами железа и черных, который производит нерастворимых синий осадок, который легко визуализировать. Таким образом активность β-галактозидазы выступает в качестве маркера для выражения гена интереса по мере развития. Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и последующий метод для парафина секционирование и counterstaining. Кроме того процедура для уточнения весь эмбрионов предоставляется лучше визуализировать X-Гал пятнать в более глубоких зонах эмбриона. Согласованные результаты получаются путем выполнения этой процедуры, хотя оптимизация условий реакции необходима для сведения к минимуму фоновой активности. Ограничения в assay должны рассматриваться также, особенно в отношении размера эмбриона окрашивания всю гору. Наш протокол обеспечивает чувствительной и надежный метод для обнаружения β-галактозидазы в процессе разработки мыши, который может применяться в криостата секций, а также целые органы. Таким образом динамический ген выражение шаблоны разработки может быть легко проанализирован с помощью этого протокола в целом эмбрионов, но также подробные выражение на клеточном уровне может оцениваться после разрезания парафин.

Здесь мы показываем результаты от применения стандартный протокол для β-галактозидазы гистохимические реакции с помощью X-Гал как субстрат в целом мыши эмбрионов (рис. 1 и рис. 2). Используя этот протокол, осматриваем мембраны типа 4-матри...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и метод для парафина секционирование и counterstaining. Это простая и быстрая процедура для мониторинга экспрессии генов в процессе разработки, которые могут также применяться для разделов ткани, органов или культивируемых клеток.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Аффинное мечение Обнаружение эндогенного Рецепторы из эмбрионов данио рерио

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Быстрое и эффективное выражение нескольких белков в птичьих эмбрионах с использованием мРНК Электропорации

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Клональная генетическая трассировка с помощью мыши Confetti для изучения минерализованных тканей

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Лазерная захват микродиссекции мыши эмбрионального хряща и кости для анализа экспрессии генов

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...