Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Vi vill tacka histopatologiska tjänsten för deras tekniskt bistånd på de Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi tackar också Dr Motoharu Seiki för vänligt ge Mt4-mmpLindholm möss och Dr Alicia G. Arroyo för att stödja vårt projekt och för hennes kritisk läsning av manuskriptet. Vi vill tacka Peter Bonney för korrekturläsning denna artikel. Detta arbete stöds av Universidad Europea de Madrid med hjälp av ett bidrag (# 2017UEM01) till C.S.C.

Alla experimentella rutiner godkändes av kommittén för etik av djur experimenten av CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) och Comunidad Autónoma de Madrid för att säkerställa minimal djurens lidande.
1. insamling av embryon från dräktiga möss (från E8.5 till E12.5)
<ol><li>Offra dräktiga möss av cervikal dislokation eller CO2 inandning. Dagen för först observerade vaginal plug ansågs embryonala dygn 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Lägga djuret i rygglä...

E. coli Lindholm genen har använts som reporter i studier av gen uttrycksmönster på grund av dess höga känslighet och underlätta identifiering. Protokolls beskriver en klassisk metod för att upptäcka β-gal uttryck baserat på en enzymatisk reaktion som är enkel och snabb att utföra samt billig. Denna metod kan användas även utan större modifieringar i hela mount embryon, intakta organ, kryostaten vävnadssnitt eller odlade celler.
Korrekt tillämpning av denna metod resu...

För att beskriva specifik gen uttrycksmönster, har användning av reporter gener som markörer varit avgörande från Drosophila till däggdjur. I experiment med genmanipulerad och knockout djur, är bakteriell β-galaktosidas genen (Lindholm) av Escherichia coli (E. coli) en av de mest använda1,2,3, 4. β-galaktosidas (β-gal) katalyserar hydrolys av β-galactosides (t.ex. laktos) till dess monosackarider (glukos och galaktos)5. Dess vanligaste substrat är X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glykosid som hydrolyseras av β-galaktosidas som ger upphov till 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole och galaktos. Först oxideras till en dimer som, när den används i kombination med kalium-ferri- och ferro-cyanid, producerar en karakteristisk olösligt, blå färg fällningen (figur 1)6.
Lindholm genen börjat användas som en reporter gen över trettio år sedan7,8. Vanligtvis, Lindholm infogas nedströms en endogen arrangören i stället för öppen läsning ramen, så den kan användas i bakteriell och cell kultur att visualisera celler som innehåller en viss insats, liksom i transgena djur som spårämne av endogen gen uttrycksmönster under utveckling9. I detta avseende har visualisering av β-galaktosidas aktivitet flitigt använts i Drosophila för att förstå de utvecklingsmässiga och cellulära processerna från enstaka celler till hela vävnader. Drosophila genetik för generering av stabila linjer där en modifierad P-element konstruktion innehållande reporter genen Lindholm är insatt på måfå platser i genomet. Således, när placeras under inflytande av enhancer element kan det driva sitt uttryck på ett särskilt sätt för vävnad, som har möjliggjort en systematisk analys av uttrycksmönster av många gener under de senaste två decennier10. Användningen av transgena möss att övervaka Lindholm genuttryck kan dessutom också upptäckt genen rekombination händelser av Cre-loxP medierad rekombination och lokalisering av muterade embryonala stamceller derivat i chimära analyser 11, som underlättar kontroll av Lindholm uttryck i specifika vävnader samt som temporally. Dessutom i hela embryon, kan upptäckt av β-galaktosidas aktiviteten producera differentiell färgning mönster vid olika intensiteter som bekvämt kan observeras över olika utvecklingsstadier att analysera tidsmässiga förändringar i genuttryck 8,12.
I denna artikel presenterar vi ett protokoll för att visualisera genuttryck genom X-gal färgning i hela mount vävnaden i tidiga utvecklingsstadier av musembryon. Vi presenterar denna histochemical metod som en mycket känslig och billig teknik som gynnar korrekt upptäckt av märkta celler i hela mount exemplar eller på cellnivå efter paraffin inbäddat vävnader eller embryon. Metoden möjliggör direkt visualisering av färgning i mus vävnaden med minsta bakgrunden jämfört med andra metoder13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

Escherichia coli Lindholm genen, kodning β-galaktosidas, används i stor utsträckning som reporter för genuttryck och som spårämne i cellstudier härstamning. Klassiskt histochemical reaktionen baseras på hydrolys av substratet X-gal i kombination med järnklorid och järn joner, som producerar en olöslig blå fällningen som är lätt att visualisera. Därför, β-galaktosidas aktivitet fungerar som en markör för uttrycksmönstret av genen av intresse som utvecklingen fortsätter. Här beskriver vi standardprotokollet för detektion av β-galaktosidas aktivitet i tidig hela musembryon och efterföljande metoden för paraffin snittning och counterstaining. Dessutom föreskrivs ett förfarande för att klargöra hela embryon att bättre visualisera X-gal färgning i djupare regioner av embryot. Konsekventa resultat erhålls genom att utföra proceduren, även om optimering av reaktion villkor behövs för att minimera bakgrund aktivitet. Begränsningar i analysen bör också övervägas, särskilt när det gäller storleken på embryot i hela mount färgning. Våra protokollet ger en känslig och en pålitlig metod för β-galaktosidas upptäckt under musen utvecklingen som ytterligare kan tillämpas på de kryostaten sektioner samt hela organ. Således de dynamiska gen uttryck mönsterna i hela utveckling kan enkelt analyseras med hjälp av detta protokoll i hela embryon, men också detaljerade uttryck på cellulär nivå kan bedömas efter paraffin snittning.

Här visar vi resultaten från att tillämpa standardprotokollet för β-galaktosidas histochemical reaktionen med X-gal som substratet i hela musembryon (figur 1 och figur 2). Med detta protokoll kan vi undersöka membran typ 4-matrix metalloproteinas (Mt4-mmp) uttryck i olika embryonala utvecklingsstadier (E9.5, E11.5 och E12.5) använder Mt4-mmp muterade möss som express Lindholm reportern under kontroll av den endogena Mt4-m...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

Här beskriver vi standardprotokollet för detektion av β-galaktosidas aktivitet i tidig hela musembryon och metoden för paraffin snittning och counterstaining. Detta är en enkel och snabb procedur för att övervaka genuttryck under utveckling som kan också tillämpas på vävnadssnitt, organ eller odlade celler.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-mål Kromogent Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering för jämförelse Gene Expression domäner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Märkning detektion av endogena receptorer från Zebrafish embryon

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av cellulära elektrisk aktivitet i zebrafiskar tidiga embryon och tumörer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonala genetiska spårning använda Confetti musen för att studera mineraliserade vävnader

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laserinfångning mikrodissektion av mus embryonala brosk och ben för gen uttrycks analys

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...