Name: tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) histopatolojik hizmet onların teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr. Motoharu SEIKI nazikçe sağlayan Mt4 mmpLacZ fareler için ve Dr. Alicia G. Arroyo projemize destek için ve el yazması onun eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Peter Bonney Bu makale redaksiyon için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Universidad Europea de Madrid tarafından C.S.C. için layık bir hibe (# 2017UEM01) aracılığıyla destek verdi

Tüm deneysel prosedürler CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ve Comunidad Autonoma de Madrid çok az hayvan acı sağlamak için hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. embriyo hamile fareler (E12.5 E8.5)'dan gelen topluluğu
<ol><li>Servikal yerinden çıkması veya CO2 inhalasyon hamile fareler kurban. İlk gün gözlenen vajinal tak olarak embriyonik kabul gün 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Fare % 70 etanol ile karın deri temiz ve emici Ped...

E. coli LacZ gene yaygın gen ifade kalıplarının çalışmalarda bir muhabir olarak kendi yüksek hassasiyet ve algılama kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır. Mevcut Protokolü β-gal ifade yanı sıra ucuz gerçekleştirmek hızlı ve kolay bir enzimatik reaksiyon dayalı tespit için klasik bir yöntem açıklanır. Bu yöntem bütün Dağı embriyolar, sağlam organları, cryostat doku bölümleri veya kültürlü hücreler büyük değişiklik yapmadan da uygulanabilir.
B...

Belirli bir gen ifade desenlerini tanımlamak için muhabir gen işaretleyici olarak kullanımı memeliler Drosophila en önemli olmuştur. Transgenik ve nakavt hayvanların deneylerde, Escherichia coli (e.coli) bakteriyel β-galaktozidaz gen (LacZ) en çok kullanılan1,2,3, biridir 4. β-galaktozidaz (β-gal) tromboksan β-galactosides (laktoz gibi) hidroliz onun bol (glikoz ve galaktoz)5. En sık kullanılan, substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galaktozidaz veren yükselmeye 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole ve galaktoz tarafından hidrolize bir parçalanma olduğunu. İlk bir dimer okside, kullanıldığında potasyum ferri ile kombine- ve ferro-siyanür, karakteristik çözünmez üretir, mavi renk çökelti (Şekil 1)6.
Otuz yıl önce bir muhabir gen kullanılacak LacZ gene başladı7,8. Genellikle, LacZ eklenen aşağı endojen bir organizatörü açık okuma çerçevesi yerine belirli bir INSERT içeren hücreler görselleştirmek için bakteri ve hücre kültür yanı sıra transjenik hayvanlar, endojen bir izleyici kullanılabilmesi için bu yüzden gen ifade desen geliştirme9sırasında. Bu bağlamda, β-galaktozidaz etkinliği görselleştirme kapsamlı Drosophila içinde tek hücrelerden gelişimsel ve hücresel süreçler tüm dokulara anlamak için kullanılmıştır. Drosophila genetik kararlı hatları içinde LacZ değil muhabiri gen içeren değiştirilmiş bir P-öğe yapısı eklenen rasgele genom yerlerde nesil lehine. Böylece, artırıcı unsurların etkisi altında yerleştirildiğinde bu ifadesini birçok genlerin ifade kalıplarının sistematik analizi sırasında son yirmi yılda10izin verdi bir doku belirli şekilde sürücü. Buna ek olarak, LacZ gen ekspresyonu izlemek için transgenik fareler de gen rekombinasyon olaylar Cre-loxP tarafından algılanmasını rekombinasyon ve yerelleştirme chimeric analizlerde mutasyona uğramış embriyonik kök hücre türevleri aracılı kullanılmasına 11, hangi geçici olarak de LacZ ifade belirli dokularda kontrolünü kolaylaştırır. Ayrıca, tüm embriyoların, algılama β-galaktozidaz faaliyetinin uygun gen ekspresyonu zamansal değişiklikleri analiz etmek için farklı gelişim dönemleri arasında gözlenen farklı yoğunluklarda, farklı boyama desenleri neden olabilir 8,12.
Bu makalede, biz bütün Dağı dokusunda fare embriyo erken gelişim aşamalarında boyama gen ekspresyonu ile X-gal görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz histochemical bu yöntem doku veya embriyo parafin gömülü sonra bütün Dağı örnekler veya hücresel düzeyde etiketli hücrelerinin doğru algılama iyilik bir son derece hassas ve ucuz teknik mevcut. Yöntemi diğer yöntemleri13ile karşılaştırıldığında en az arka plan ile fare dokusunda boyama doğrudan görüntüleme için sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>24137-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>50004/ LE3Q2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium</td>
			<td>VECTOR LABS</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic mounting media</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>20824365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Ethanol absolute</td>
			<td>SCHARLAU</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G6403-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85% Glycerol</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>63064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>542334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Fast Red counterstain</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>N3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>111609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (tablets)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049840500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1049731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10812846001 (Roche)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-GAL</td>
			<td>VENN NOVA</td>
			<td>R-0004-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>VWRC28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotatory Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>Oxford Trade</td>
			<td>OT-10-9046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN631-1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>AGAA000001#12E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>J1820AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotation Water bath</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>UDM-R35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oven</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>2000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Paraffin dispenser</td>
			<td>J.R. SELECTA</td>
			<td>4000490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>HS250 BASIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hot Plate</td>
			<td>Bibby</td>
			<td>HB502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td>IKA Labortechnik</td>
			<td>MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale</td>
			<td>GRAM</td>
			<td>FH-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ISO9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHmeter</td>
			<td>Crison</td>
			<td>Basic 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Optech</td>
			<td>PL2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing gene expression through detection of &#946;-galactosidase activity in whole mouse embryos

Escherichia coli LacZ gene, β-galaktozidaz, kodlama büyük ölçüde gen ekspresyonu için muhabirlik ve hücre lineage çalışmalarda bir izleyici olarak kullanılır. Klasik histochemical reaksiyon görselleştirmek kolay bir çözünmez mavi çökelti üreten demir ve demir iyonları, birlikte substrat X-gal hidroliz temel alır. Bu nedenle, geliştirme ilerledikçe β-galaktozidaz etkinliği ilgi gen ifade desenini avans olarak hizmet vermektedir. Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için sonraki yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, tüm embriyoların açıkladığınız için bir yordam X-gal embriyo, daha derin bölgelerinde boyama daha iyi görmek için sağlanmıştır. Reaksiyon koşulları duruma getirilmesi arka plan etkinliği en aza indirmek için gerekli, ancak tutarlı sonuçlar bu yordamı uygulanarak elde edilir. Tahlil sınırlamalar da, özellikle bütün Dağı boyama içinde embriyo boyutu ile ilgili olarak düşünülmelidir. Bizim iletişim kuralı bir duyarlı ve daha fazla cryostat bölümler hem de bütün organları uygulanabilir fare geliştirme sırasında β-galaktozidaz algılama için güvenilir bir yöntem sağlar. Böylece, dinamik gen ifade desen geliştirme boyunca tüm embriyoların bu protokolü kullanarak kolayca çözümlenebilir, ama Ayrıca hücresel düzeyde ayrıntılı ifade parafin kesit sonra tespit edilebilir.

İşte tüm fare embriyo (resim 1 ve Şekil 2) substrat olarak X-gal kullanarak β-galaktozidaz histochemical reaksiyon için standart protokol uygulanmasının sonuçları göstermektedir. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz membran tipi 4-Matriks metalloproteinaz (Mt4-mmp) ifade farklı embriyonik gelişim dönemleri (E9.5, E11.5 ve E12.5) de incelemek LacZ muhabir endojen kontrolü altında hızlı Mt4 mmp mutant fare kull...

Watch this Scientific Journal Video about Tracing Gene Expression Through Detection of ÃŽÂ²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos at JoVE.com

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Mineralize Dokuları Incelemek için Konfeti Faresini Kullanarak Klonal Genetik İzleme

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...