Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

وأيده هذا العمل جزئيا DA037779 منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (إلى جي بي)، DA024558، DA30896، DA033892، DA021471، AI22960، و MD007586 (إلى ماديرا). العمل الذي أيده أيضا ركمي منحة G12MD007586، UL1RR024975 منحة كتسا فاندربيلت، منح مركز أبحاث يشغل ميهاري (مترك) كتسا (RR026140 U54 من نكر/المعاهد الوطنية للصحة، و MD007593 منحة U54 من نيمهد/المعاهد الوطنية للصحة، ووسط ولاية تينيسي للإيدز البحوث (P30 AI110527).

1-تعداء ميرنا 3 '--بيوتينيلاتيد
ملاحظة: الخطوات التالية داخل غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة.
<ol><li>البذور 4 × 105–5 × 105 HEK 293T الخلايا كل بئر في 2 مل من إكمال تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) [دميم وتستكمل مع 10% مصل "بقرى الجنين" (FBS) و 1 × القلم-بكتيريا المضادات الحيوية]. ثقا?...

تحديد أهداف مرناً من ميرناس الخلوية مهم لفهم وظيفتها التنظيمية. وتستخدم العديد من الأدوات الحسابية للتنبؤ بأهداف تستند إلى تكامل تسلسل البذور والمحافظة على الهدف تسلسل19،20. على الرغم من أن هذه الأدوات قيمة، أنها يمكن أن تولد مستويات عالية من كاذبة إيجابيات...

ميكرورناس (ميرناس) صغيرة غير الترميز الكشف التي تنظم سلبا على بروتين التعبير1. سلائف ميرنا الموجودة في مجموعات من خلال العديد من مناطق الجينوم، معظم الأحيان داخل المناطق إينتيرجينيك وإينترونس من البروتين ترميز الجينات2،3. نشوء حيوي ميرناس تشمل النسخ من الحزب الثوري المؤسسي-ميرناس من ميرنا-ترميز الجينات4. الحزب الثوري المؤسسي-ميرناس الخضوع لمعالجة متسلسلة، أولاً في النواة، ومن ثم في السيتوبلازم لتوليد واحد الذين تقطعت بهم السبل ميرناس ناضجة4،5. بعد ذلك، أدرجت ميرناس ناضجة في المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC): مجمع بروتين-الجيش الملكي النيبالي مولتيميريك التي تضم عضوا من عائلة البروتينات لهدف الاعتراف4،5، أرجوناوتي 6،7. ميرناس ناضجة في RISC معقدة الغالب ربط 3 'UTR الهدف مرناس8،،من910 ، لكن يمكن أيضا ربط أحياناً في الترميز والمنطقة UTR 5' مرناً10،11 . ربط ميرنا مرناً تسلسل النتائج في إسكات متعدية12،،من1314 ، وفي بعض الحالات مرناً زعزعة15. حيث يمكنك استهداف ميرنا واحد مرناس كثيرة، يشاركون في العملية الخلوية تقريبا كل هذه الجزيئات التنظيمية وقد تورطت في المرض مختلف الظروف16،17،18.
فهم تفصيلي لكيفية تنظيم ميرناس المسارات الخلوية يتطلب تحديد مرناس المستهدفة. تتوفر أنظمة المعلوماتية متعددة للتنبؤ miRNA:mRNA المفترضة التفاعلات19،20. تعتمد هذه التوقعات على الكمال واتسون-كريك إقران قاعدة بين النوكليوتيدات 2 – 8 تسلسل البذور ميرنا وتسلسل تكميلية ضمن الهدف مرناً4،21. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأدوات إنشاء هيكل مزدوج miRNA:mRNA الثانوي وحساب معلمات دينامي حراري لهذا التفاعل الجزيئي وإظهار المحافظة على مواقع الربط عبر الأنواع تعزيز صلة وظيفية للهدف التنبؤ. لسوء الحظ، هذه الأدوات أيضا أن يكون الحد من التنبؤ بأهداف إيجابية كاذبة في15،معدل مرتفع جداً (~ 27-70 ٪)22. الأهم من ذلك، تفشل هذه المنصات في السيليكون الاعتراف غير المقبول تفاعلات ميرناس مع تلك الأهداف23. ولذلك، هذه التحليلات التنبؤية هي غالباً جنبا إلى جنب مع طرق تجريبية للتحقق من صحة الأهداف ذات الصلة وظيفيا.
وضعت نهوج متعددة للتحقق تجريبيا من التفاعل miRNA:mRNA. التجارب الجينية باستخدام يقلد ميرنا، والإسفنج والموانع التي تغير مستويات ميرناس في الخلية توفر القرائن لأثره التنظيمية في الهدف الجينات التعبير24،،من2526. بالإضافة إلى ذلك، مراسل على أساس فحوصات عبر تعداء المشارك لاستنساخ تحتوي على 3 ' UTR منطقة يقلد مرناً وميرنا المستهدفة أو مثبطات في خلايا تقديم الأدلة للوظيفة الرقابية ميرناس26. في حين أن هذه الأساليب حاسمة لدراسة تنظيم التعبير الجيني بوستترانسكريبشونال من ميرناس، تعداء الكفاءة وبليوتروبيك آثار التغيرات في مستويات ميرنا الخلوية هي القيود الرئيسية من هذه النهج الوراثية23، 26. ولذلك تستخدم الطرق البيوكيميائية التكميلية التي التحقيق التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها فهم أفضل لوظيفة الخلوية ميرناس.
أسلوب واحد يستخدم على نطاق واسع لدراسة التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها إيمونوبريسيبيتيشن RISC معقدة متبوعاً بكشف الهدف مرناً داخل مجمع27،،من2829،30 . في الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا طريقة مصيدة RISC محسنة لتحديد أهداف ميرنا؛ الأزواج استقرار الأهداف داخل وسيطة RISC-ميرنا-مرناً مع تنقية الأهداف مرناً. ومع ذلك، ميثودسفيس هذه التحديات الملازمة للتفاعلات غير محددة بين الجيش الملكي النيبالي والجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات التي عادة ما يتم فصل من مقصورات الهاتف الخلوي31،32. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الاختبارات التي تعتمد على وجود بروتين AGO2 إيمونوبريسيبيتيشن من مجمع RISC33. نظراً لأن AGO2 لا أرجوناوتي فقط للتوسط في التفاعلات miRNA:mRNA فعالة، يمكن أن يؤدي استبعاد الأخرى أرجوناوتيس إلى نتائج متحيزة34. ولذلك، هناك حاجة إلى استراتيجيات بديلة لدراسة الربط المباشر لميرنا مرناً.
في هذا التقرير، يمكننا وضع نهج خطوة واحدة ليحقق التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها مرناً. أولاً، يتم ترانسفيكتيد 3 ' بيوتينيلاتيد مؤمن يقلد ميرنا الحمض النووي (LNA) في خلايا الثدييات. ثم، يتم التقاطها miRNA:mRNA المعقدة في الخلوية ليستي استخدام الخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. الهدف مرناً منضم إلى ميرنا مكملة لها هو كمياً باستخدام قبكر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

ميكرورناس (ميرناس) هي فئة من الكشف فضله الصغيرة التي بوستترانسكريبتيونالي تنظيم تعبير الجينات الخلوية. ربط ميرناس إلى 3 ' غير مترجمة المنطقة (UTR) لاستهداف مرناً تحول دون ترجمة البروتين أو في بعض الحالات يتسبب في تدهور مرناً. ربط ميرنا إلى 3 'UTR الهدف هو بتسلسل بذور النوكليوتيدات 2-8 في 5' نهاية ميرنا وساطة مرناً. على الرغم من دور ميرناس كجزيئات التنظيمية الخلوية، تحديد مرناس المستهدفة ذات الصلة الوظيفية لا يزال يمثل تحديا. وقد استخدمت أدوات Bioinformatic للتنبؤ بتسلسل داخل 3 ' UTR من مرناس كأهداف محتملة لربط ميرنا. كما استخدمت هذه الأدوات لتحديد حفظ التطوري لهذه التسلسلات بين الأنواع ذات الصلة في محاولة للتنبؤ بدور وظيفي. ومع ذلك، هذه الطرق الحسابية غالباً ما توليد نتائج إيجابية زائفة وتقتصر على التنبؤ بالتفاعل المقبول بين ميرنا ومرناً. ولذلك، إجراءات تجريبية تقيس الربط المباشر لميرنا إلى هدفها مرناً ضرورية لإقامة التفاعل الوظيفي. وفي هذا التقرير، يصف لنا طريقة حساسة للتحقق من التفاعل المباشر بين ميرنا الخلوية مير-125b و 3 ' مرناً UTR نشطت-1. يمكننا وضع بروتوكول الذي تم transfected يقلد ميرنا بيوتينيلاتيد الاصطناعية في خلايا الثدييات وتهدمه المجمع ميرنا مرناً في الخلوي ليساتي مع الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين. وأخيراً، الهدف كان كمياً مرناً في سحبها إلى أسفل الحمض النووي المعقدة باستخدام استراتيجية قائمة على قبكر.

ميرناس تنظيم العمليات الخلوية بالربط إلى مرناس الهدف. ولذلك، تحديد أهداف مرناً مفتاح لفهم وظيفة ميرنا. هنا يمكننا وضع طريقة لتحديد الهدف مرناً لميرنا الخلوية. هذا البروتوكول مقتبس من أني et al. 35 مع التعديل للاستفادة من بيوتينيلاتيد يقلد ميرنا LNA المستندة...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

ويصف هذا التقرير طريقة سريعة وموثوق بها للتحقق من صحة الأهداف مرناً من ميرناس الخلوية. يستخدم أسلوب يحاكي ميرنا بيوتينيلاتيد الاصطناعية على أساس تأمين LNA "الحمض النووي" لالتقاط الهدف مرناً. بعد ذلك، تستخدم المغلفة streptavidin الخرز المغناطيسي المنسدلة الهدف مرناً للقياس الكمي ب qPCR تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الاعتداء على أساس البيوتين المنسدلة للتحقق من صحة مرناً ميرناس "الأهداف الخلوية"

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

متزامنة الفيديو-EEG-ECG الرصد لتحديد الخلل نيوروكاردياك في نماذج الماوس من الصرع

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...