Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

这项工作得到了国家卫生研究院 (NIH)、DA024558、DA30896、DA033892、DA021471、AI22960 和 MD007586 (C.D.) DA037779 的部分支持。这项工作还得到了 RCMI 赠款 G12MD007586、范德比尔特 CTSA 补助金 UL1RR024975、Meharry 翻译研究中心 MeTRC 赠款 (CTSA U54/nih、RR026140/国立卫生研究院 NCRR 补助金和田纳西州艾滋病中心) 的支持。研究 (P30 AI110527)。

1. 转染 3 '-生物素化 miRNA
注: 在无菌层流罩内执行以下步骤。
<ol><li>种子 4 x 105–5 x 105 HEK-293T 细胞每井在2毫升完全 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) [DMEM 补充10% 胎牛血清 (血清) 和1x 笔链球菌抗生素]。培养细胞在孵化器设置在37°c, 5% CO2隔夜。</li>
	<li>第二天, 检查在光显微镜下被镀细胞的健康和黏附。 注意: 确保细胞在继续下一步之前坚持并获得适当?...

细胞 miRNAs mRNA 靶点的鉴定对于了解其调控功能具有重要意义。基于种子序列互补和保护目标序列19、20, 采用了几种计算工具对目标进行预测。虽然这些工具很有价值, 但它们可以产生高级别的误报和假阴性。因此, 这些预测结合了实验方法, 如 RISC 复合体的免疫沉淀和 miRNA 的拉下: mRNA 复合体, 以确认 miRNAs 对各自目标27,<sup class=...

MicroRNAs (miRNAs) 是小的非编码 rna, 负调节蛋白表达1。miRNA 的前体通过基因组的许多区域聚集, 最频繁地在基因间区域和蛋白质编码基因的内含子2,3。合成的 miRNAs 涉及转录 miRNAs 从 miRNA 编码基因4。miRNAs 进行序贯处理, 先在细胞核内, 然后在细胞质中生成单股 miRNAs4,5。随后, 成熟的 miRNAs 被纳入到 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC): 一个 multimeric 蛋白-RNA 复合物, 其中包括 Argonaute 的蛋白质家族成员的目标识别4,5, 6,7。在 RISC 复杂的成熟 miRNAs 主要绑定到目标基因8,9,10的 3 ' UTR, 但也可以偶尔绑定在编码和 5 ' UTR 地区的 mRNA10,11.miRNA 与 mrna 序列的结合导致了平移沉默12,13,14 , 在某些情况下 mRNA 失稳15。由于单个 miRNA 可以针对许多基因, 这些调控分子参与几乎每一个细胞过程, 并有牵连在各种疾病情况下16,17,18。
详细了解 miRNAs 如何调节细胞通路需要识别目标基因。多个生物信息学平台可用于预测假定的 miRNA: mRNA 相互作用19,20。这些预测依赖于完美的沃森-克里克基配对的2–8核苷酸种子序列的 miRNA 和一个互补序列内的目标 mRNA4,21。此外, 这些工具生成 miRNA 的二级结构: mRNA 双工, 计算这种分子相互作用的热力学参数, 并显示跨物种的结合点的保护, 以提高目标的功能相关性预测。不幸的是, 这些工具也有限制预测假阳性目标在一个非常高的速度 (〜 27–70%)15,22。最重要的是, 这些在硅平台中无法识别 miRNAs 与目标23的非规范交互。因此, 这种预测分析往往与实验方法相结合, 以验证功能相关的目标。
已经开发了多种方法来实验验证 miRNA: mRNA 相互作用。使用 miRNA 模拟器、海绵和抑制剂的基因实验, 改变细胞 miRNAs 的水平, 为其对目标基因表达24、25、26的调控作用提供了线索。此外, 通过联合转染包含目标 mRNA 3 ' UTR 区域的克隆和 miRNA 模拟器或抑制剂进入细胞, 以记者为基础的化验, 提供了 miRNAs26的调节功能的证据。这些方法对于研究基因表达后转录调控的 miRNAs、转染效率和细胞 miRNA 水平变化的 pleotropic 效应是至关重要的, 这些遗传方法的主要局限性是23, 26。因此, miRNA 与靶的直接相互作用的补充生物化学方法, 可以更好地了解 miRNAs 的细胞功能。
研究 miRNA 与目标直接相互作用的一种广泛应用的方法是 RISC 复合体的免疫沉淀, 其次是复杂27、28、29、30 中的 mRNA 靶检测..最近, 还利用改进的 RISC 陷阱方法识别 miRNA 目标;它在 miRNA mrna 中间体中对目标进行稳定, 并对 mrna 靶点进行纯化。然而, 这些 methodsface 了 rna 和 rna 结合蛋白之间的非特异相互作用的内在挑战, 通常由细胞间隔31,32隔开。此外, 这些化验是依赖于存在的 AGO2 蛋白免疫沉淀的 RISC 复杂33。鉴于 AGO2 不是唯一的 argonaute 调解有效的 miRNA: mRNA 相互作用, 排除其他 argonautes 可能导致有偏见的结果34。因此, 要研究 miRNA 对 mRNA 的直接结合, 需要采取替代的策略。
在本报告中, 我们详细阐述了一个 miRNA 和它的目标 mRNA 直接相互作用的方法。首先, 3 ' 生物素化锁定核酸 (低噪声放大) miRNA 模仿者转染成哺乳动物细胞。然后, miRNA: 细胞裂解物中的 mRNA 复合体是用链亲和素包覆的磁性珠子捕获的。用 qPCR 量化了其互补 miRNA 的 mRNA 靶。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

MicroRNAs (miRNAs) 是一类小非编码 rna, 后转录调节细胞基因表达。MiRNAs 绑定到 3 ' 未翻译的区域 (UTR) 的目标 mRNA, 以抑制蛋白质的翻译或在某些情况下导致 mRNA 退化。miRNA 对目标 mRNA 的 3 ' UTR 的绑定由 miRNA 5 ' 末端的2–8核苷酸种子序列介导。虽然 miRNAs 作为细胞调控分子的作用已经建立, 但与功能相关的目标基因的识别仍然是一个挑战。生物信息学工具被用来预测 3 ' UTR 基因中的序列, 作为 miRNA 绑定的潜在目标。这些工具也被用来确定这些序列在相关物种之间的进化守恒, 以预测功能作用。然而, 这些计算方法往往产生假阳性结果, 仅限于预测 miRNA 和 mRNA 之间的典型交互作用。因此, 测量 miRNA 对其 mRNA 靶的直接约束的实验程序是建立功能交互的必要条件。在本报告中, 我们描述了一种敏感的方法来验证细胞 miRNA miR-125b 和 3 ' UTR PARP-1 mRNA 之间的直接相互作用。我们制定了一个协议, 其中合成生物素化 miRNA 模仿被转染成哺乳动物细胞和 miRNA mRNA 复合体的细胞裂解物被拉下来与链亲和素涂层磁性珠。最后, 采用 qPCR 策略对下拉核酸复合体中的靶 mRNA 进行量化。

MiRNAs 通过绑定到目标基因来调节细胞过程。因此, 识别 mRNA 目标是理解 miRNA 功能的关键。在此, 我们详细阐述了一种识别细胞 miRNA mRNA 靶的方法。这个协议是从迩那里改编的。35利用生物素化低噪声的 miRNA 模拟到下拉靶 mRNA 的改进。基于低噪声的寡核苷酸模拟提高了靶结合的特异性, 由于改性核糖环的稳定性较高, 不含毒性效应36<...

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Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

本报告描述了一种快速可靠的方法来验证细胞 miRNAs 的 mRNA 目标。该方法采用合成生物素化锁定核酸 (低噪声放大) miRNA 模拟捕获靶 mRNA。随后, 采用链亲和素包覆磁性微珠对靶 mRNA 进行 qPCR 聚合酶链反应的定量。

基于生物素的下拉法对细胞 miRNAs mRNA 靶点的验证

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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科研

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