Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud DA037779 (til JP), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 og MD007586 (til C.D.). Arbejdet blev også støttet af RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, give Meharry Translational forskning Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 fra NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 fra NIMHD/NIH og Tennessee Center for AIDS Forskning (P30 AI110527).

1. Transfektion af 3'-biotinylated miRNA
Bemærk: Udfør følgende trin inde i en steril laminar flow hætte.
<ol><li>Frø 4 x 105–5 x 105 HEK-293T celler pr. brønd i 2 mL komplet Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) [DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1 x Pen-strep antibiotikum]. Kultur celler i en inkubator, indstillet på 37 ° C, 5% CO2 natten over.</li>
	<li>Den næste dag, tjekke sundhed og overholdelse af de belagte celler und...

Identifikation af cellulære miRNAs mRNA mål er vigtigt for at forstå deres lovgivningsmæssige funktion. Flere beregningsmæssige redskaber er ansat til at forudsige mål baseret på seed sekvens komplementaritet og bevarelse af target sekvenser19,20. Selvom disse værktøjer er værdifulde, kan de genererer høje niveauer af både falske positiver og falske negativer. Derfor, disse forudsigelser er kombineret med eksperimentelle metoder såsom immunoprecipita...

MicroRNA (miRNAs) er små ikke-kodende RNA'er, der negativt regulere protein udtryk1. Forstadier til miRNA bosat i klynger gennem mange regioner i genomet, hyppigst inden for de intergenic regioner og introner protein-kodning gener2,3. Biogenese af miRNAs inddrage transskription af pri-miRNAs fra miRNA-kodning gener4. Pri-miRNAs gennemgå sekventiel behandling, først i kernen og derefter i cytoplasma til at generere enkelt strandede modne miRNAs4,5. Efterfølgende, de modne miRNAs er indarbejdet i den RNA-induceret silencing complex (RISC): en multimeriske protein-RNA kompleks, som omfatter et medlem af familien Argonaute af proteiner for target anerkendelse4,5, 6,7. Modne miRNAs i RISC komplekse overvejende binder til 3' UTR af target mRNAs8,9,10 , men kan også binde lejlighedsvis i kodning og 5' UTR region af mRNA10,11 . Bindingen af miRNA til mRNA sekvenser resultater i translationel silencing12,13,14 , og i nogle tilfælde mRNA destabilisering15. Da en enkelt miRNA kan målrette mange mRNAs, disse lovgivningsmæssige molekyler er involveret i næsten alle cellulære processer og har været impliceret i forskellige sygdom betingelser16,17,18.
Detaljeret forståelse af hvordan miRNAs regulere cellulære veje kræver identifikation af target mRNAs. Flere Bioinformatik platforme er tilgængelige til at forudsige formodede miRNA:mRNA interaktioner19,20. Disse forudsigelser er baseret på perfekte Watson-Crick base parring mellem 2 – 8 frø nucleotidsekvensen af miRNA og en supplerende sekvens i target mRNA4,21. Derudover disse værktøjer generere sekundær struktur af miRNA:mRNA duplex, beregne termodynamiske parametre i denne molekylære interaktion og Vis bevarelse af bindende websteder på tværs af arter at forbedre funktionelle relevansen af målet forudsigelse. Disse værktøjer har desværre også begrænsningen af forudsige falsk positive mål på et meget højt sats (~ 27 – 70%)15,22. Vigtigst af alt, undlader disse i siliciummangan platforme at anerkende miRNAs ikke-kanoniske interaktioner med deres mål23. Sådanne intelligent analyser kombineres derfor ofte med eksperimentelle metoder til at validere funktionelt relevante mål.
Flere metoder er blevet udviklet for at eksperimentelt validere miRNA:mRNA interaktion. Genetiske eksperimenter ved hjælp af miRNA efterligner, give svampe og hæmmere, der ændrer niveauer af miRNAs i cellen fingerpeg for sin regulerende virkning på målet gen expression24,25,26. Derudover reporter baseret assays via Co Transfektion af en klon, der indeholder 3' UTR region af target mRNA og miRNA efterligner eller hæmmere i cellerne give bevis for regulativfunktionen miRNAs26. Mens disse metoder er afgørende for at studere post-transcriptional regulering af genekspression af miRNAs, er Transfektion effektivitet og pleotropic effekter af ændringer i det cellulære miRNA niveauer væsentlige begrænsninger af disse genetiske tilgange23, 26. Derfor, supplerende biokemiske metoder, der sonden direkte interaktion mellem miRNA og dens mål er ansat til bedre at forstå miRNAs cellefunktion.
En meget udbredt metode til at studere direkte interaktion mellem miRNA og dens mål er immunoprecipitation af RISC komplekse efterfulgt af påvisning af mRNA mål inden for de komplekse27,28,29,30 . For nylig var en forbedret RISC fælde metode også udnyttes til at identificere miRNA mål; det par stabilisering af mål inden for RISC-miRNA-mRNA mellemprodukter med rensning af mRNA mål. Dog disse methodsface ikke specifikke vekselvirkninger mellem RNA og RNA-bindende proteiner, der er som regel adskilt af cellulære rum31,32iboende udfordringer. Derudover er disse assays afhængig af tilstedeværelsen af AGO2 protein for immunoprecipitation af RISC komplekse33. AGO2 er ikke den eneste argonaute at mægle effektiv miRNA:mRNA interaktioner, kan udelukkelse af andre argonautes føre til partisk resultater34. Derfor, alternative strategier er nødvendige for at studere direkte binding af miRNA til mRNA.
I denne rapport, vi udarbejder en et-trins tilgang til sondering direkte interaktion mellem en miRNA og sit mål mRNA. For det første er 3' biotinylated låst nukleinsyre (LNA) miRNA efterligner transfekteret i pattedyrsceller. Derefter, miRNA:mRNA kompleks i cellulære lysate er fanget ved hjælp af streptavidin belagt magnetiske perler. MRNA målet bundet til sin supplerende miRNA kvantificeres ved hjælp af qPCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

MicroRNA (miRNAs) er en klasse af små noncoding RNA'er, der post-transcriptionally regulerer cellulær genekspression. MiRNAs binder sig til den 3' utranslaterede region (UTR) af målrette mRNA hæmmer protein oversættelse eller i nogle tilfælde forårsage mRNA nedbrydning. Binding af miRNA til 3' UTR af mRNA er medieret af en 2-8 frø nucleotidsekvensen i 5' slutningen af miRNA-målet. Mens miRNAs rolle som cellulære regulerende molekyler er veletableret, identifikation af target mRNAs med funktionelle relevans er fortsat en udfordring. Bioinformatic værktøjer har været ansat til at forudsige sekvenser i 3' UTR af mRNAs som potentielle mål for miRNA bindende. Disse værktøjer har også været udnyttet til at bestemme den evolutionære bevarelse af sådanne sekvenser blandt beslægtede arter i et forsøg på at forudsige funktionelle rolle. Men disse beregningsmetoder ofte generere falske positive resultater og er begrænset til at forudsige kanoniske interaktion mellem miRNA og mRNA. Det er derfor nødvendigt at etablere funktionelle interaktion eksperimentelle procedurer, der måler direkte binding af miRNA sin mRNA målsætning. I denne rapport beskriver vi en følsom metode til validering af direkte interaktion mellem cellulære miRNA miR-125b og 3' UTR af PARP-1 mRNA. Vi udarbejder en protokol som syntetiske biotinylated-miRNA efterligner var transfekteret i pattedyrceller og miRNA-mRNA kompleks i cellulære lysate blev trukket med streptavidin-belagt magnetiske perler. Endelig, målet mRNA i trak-down nukleinsyre komplekse var kvantificeres ved hjælp af en qPCR-baseret strategi.

MiRNAs regulere cellulære processer ved binding til target mRNAs. Derfor er identificerer mRNA mål en nøgle til at forstå miRNA funktion. Her udarbejde vi en metode til at identificere mRNA mål af cellulære miRNA. Denne protokol er tilpasset fra Wani et al. 35 med ændringen af udnytte biotinylated LNA-baserede miRNA efterligner til pulldown målrette mRNA. Brugen af LNA-baserede oligonukleotid efterligner øger specificiteten af target bindende på ...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Denne rapport beskriver en hurtig og pålidelig metode til validering af cellulære miRNAs mRNA mål. De metode bruger syntetiske biotinylated låst nukleinsyre LNA-baserede miRNA efterligner for at fange målrette mRNA. Efterfølgende, streptavidin-belagt magnetiske perler er ansat til pulldown målet mRNA for kvantificering af qPCR polymerase kæde reaktion.

Biotin-baserede Pulldown Assay til Valider mRNA mål af cellulære miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser af Cirkulerende miRNA i irritabel tyktarm Opdagede Ved hjælp af en Multiplexed Højkapacitetsforskning Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse af Cap-bindende proteiner i Human celler udsat for Fysiologiske iltforhold

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation at studere In Vivo cellulære svar til Simple og komplekse DNA-skader

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Måling af mRNA niveauer Over tid under gær S. cerevisiae hypoksiske svar

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidige Video-EEG-EKG overvågning for at identificere Neurocardiac dysfunktion i musemodeller af epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down Procedure til identifikation af en længe ikke-kodende RNA RNA mål

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Celle baseret Assays af SINEUP ikke-kodende RNA'er, der specifikt kan forbedre mRNA Oversættelse

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...