Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies DA037779 (naar J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 en MD007586 (tot C.D.). Het werk werd ook ondersteund door de RCMI Grant G12MD007586, de Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, verlenen de Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 van NCRR/NIH, de U54 Grant MD007593 van NIMHD/NIH en de Tennessee-centrum voor AIDS Onderzoek (P30 AI110527).

1. de transfectie van 3'-biotinyleerd miRNA
Opmerking: Voer de volgende stappen binnen een steriele laminar flow hood.
<ol><li>Zaad 4 x 105–5 x 105 HEK-293T cellen per putje in 2 mL zuiver voltooien Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) [DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1 x Pen-strep antibioticum]. Cultuur van de cellen in een incubator ingesteld bij 37 ° C, 5% CO2 's nachts.</li>
	<li>De volgende dag, Controleer de gezondheid en de h...

Identificatie van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs is belangrijk voor het begrijpen van hun regulerende functie. Verschillende computerhulpmiddelen werkzaam zijn te voorspellen van doelstellingen op basis van zaad reeks complementariteit en de instandhouding van doel sequenties19,20. Hoewel deze hulpprogramma's waardevol zijn, kunnen ze genereren hoge niveaus van zowel valse positieven en valse negatieven. Deze voorspellingen zijn dus gekoppeld aan exper...

MicroRNAs (miRNAs) zijn klein niet-coderende RNAs die eiwit expressie1negatief te regelen. Precursoren van miRNA bevinden zich in clusters door vele regio's van het genoom, vaakst binnen de intergenic regio's en de introns van eiwit-codeert genen2,3. Biogenese van miRNAs betrekken transcriptie van de pri-miRNAs van miRNA-encoding genen4. De pri-miRNAs ondergaan sequentiële verwerking, eerst in de kern, en vervolgens in het cytoplasma voor het genereren van één gestrande volwassen miRNAs4,5. Daarna de volwassen miRNAs zijn opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC): een multimeric eiwit-RNA complex waarin een lid van de familie van de Argonaute van eiwitten voor de doelgroep erkenning4,5, 6,7. Volwassen miRNAs in de RISC complexe overwegend binden aan de 3-' UTR van doel mRNAs8,9,10 , maar ook af en toe kunt binden in de codering en de 5' UTR regio van de mRNA10,11 . De binding van miRNA naar het mRNA sequenties resultaten in translationeel silencing12,13,14 en in sommige gevallen mRNA destabilisatie15. Aangezien een enkele miRNA veel mRNAs richten kunt, deze regelgevende moleculen zijn betrokken bij bijna alle cellulaire processen en zijn betrokken bij verschillende ziekte voorwaarden16,17,18.
Gedetailleerd begrip van hoe miRNAs cellulaire routes reguleren vereist identificatie van de target mRNAs. Meerdere bioinformatics platforms zijn beschikbaar voor het voorspellen van de vermeende miRNA:mRNA interacties19,20. Deze voorspellingen, is afhankelijk van de perfecte Watson-Crick basis koppeling tussen de 2 – 8 nucleotide zaad opeenvolging van de miRNA en een bijkomende opeenvolging binnen de doelgroep mRNA4,21. Bovendien, deze tools genereren van de secundaire structuur van de miRNA:mRNA duplex, berekenen thermodynamische parameters van deze moleculaire interactie en Toon van instandhouding van de bandplaatsen over soorten te vergroten van functionele relevantie van het doel voorspelling. Helaas hebben deze hulpprogramma's ook de beperking van het voorspellen van valse positieve doelstellingen op een zeer hoog percentage (~ 27 – 70%)15,22. Bovenal deze platforms in silico niet herkennen van de niet-canonieke interactie van miRNAs met hun doelstellingen23. Deze voorspellende analyses zijn daarom vaak gecombineerd met experimentele methoden voor het valideren van functioneel relevante doelstellingen.
Meerdere benaderingen zijn ontwikkeld voor het proefondervindelijk valideren van miRNA:mRNA interactie. Genetische experimenten met behulp van miRNA nabootsers, bieden sponzen en remmers die veranderen van de niveaus van miRNAs in de cel aanknopingspunten voor het regulerende effect daarvan op de doelgroep gen expressie24,25,26. Bovendien, verslaggever gebaseerd testen via co transfectie van een kloon met de UTR regio 3' van de target mRNA en miRNA nabootsers of remmers in cellen bewijs te leveren van de regulerende functie van miRNAs26. Terwijl deze methoden cruciaal zijn voor het bestuderen van post-transcriptional regulering van de genexpressie door miRNAs, zijn transfectie efficiëntie en pleotropic gevolgen van wijzigingen in de cellulaire miRNA niveaus belangrijke beperkingen van deze genetische benaderingen23, 26. Daarom zijn complementaire biochemische methoden die peilen naar directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling werkzaam om beter te begrijpen de cellulaire functie van miRNAs.
Een veel gebruikte methode om te studeren van directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling is immunoprecipitation van de RISC complexe gevolgd door de detectie van mRNA doel binnen de complexe27,28,29,30 . Onlangs, een verbeterde RISC val methode werd ook gebruikt om te identificeren van miRNA doelstellingen; het paren stabilisatie van doelen binnen de RISC-miRNA-mRNA tussenproducten met de zuivering van mRNA doelen. Echter, deze methodsface de inherente uitdagingen van niet-specifieke interacties tussen RNA en RNA-bindende eiwitten, die meestal worden gescheiden door cellulaire compartimenten31,32. Bovendien, zijn deze tests afhankelijk van de aanwezigheid van AGO2 eiwitten voor immunoprecipitation van RISC complexe33. Gezien het feit dat AGO2 niet de enige argonaute te bemiddelen efficiënte miRNA:mRNA interacties, kan uitsluiting van andere argonautes leiden tot vooringenomen resultaten34. Daarom, alternatieve strategieën nodig zijn om te studeren van directe binding van miRNA aan mRNA.
In dit verslag, werken we een one-step-aanpak voor directe interactie tussen een miRNA en haar doelstelling indringende mRNA. Eerst, 3' biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur (LNA) miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen. Vervolgens is het complex in de cellulaire lysate miRNA:mRNA gevangen met behulp van magnetische kralen daar bekleed. Het doel van de mRNA gebonden aan haar complementaire miRNA is gekwantificeerd aan de hand van qPCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

MicroRNAs (miRNAs) vormen een klasse van kleine noncoding RNAs die post-transcriptionally cellulaire genexpressie regelen. MiRNAs binden aan de 3' niet-vertaalde regio (UTR) van target mRNA te remmen eiwit vertaling of in sommige gevallen leiden tot aantasting van het mRNA. De binding van de miRNA aan de 3-' UTR van het streefcijfer dat mRNA wordt gemedieerd door een 2 – 8 nucleotide zaad reeks eind 5' miRNA. Terwijl de rol van miRNAs als cellulaire regelgevende moleculen goed ingeburgerd is, blijft identificatie van de target mRNAs met functionele relevantie een uitdaging. Bioinformatic hulpmiddelen zijn tewerkgesteld te voorspellen van reeksen binnen de 3-' UTR van mRNAs als doelwit voor miRNA bindend. Deze hulpprogramma's zijn ook gebruikt om te bepalen van de evolutionaire instandhouding van dergelijke sequenties onder Verwante soorten in een poging om te voorspellen van functionele rol. Echter deze rekenmethoden vaak vals-positieve resultaten genereren en zijn beperkt tot het voorspellen van de canonieke interactie tussen miRNA en mRNA. Experimentele procedures die meten van directe binding van miRNA aan haar doelstelling van mRNA zijn daarom noodzakelijk vast te stellen functionele interactie. In dit verslag beschrijven we een gevoelige methode voor de validatie van de directe interactie tussen de cellulaire miRNA miR-125 ter en de 3' UTR van PARP-1 mRNA. Wij werken een protocol waarin synthetische biotinyleerd-miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen en de miRNA-mRNA-complex in de cellulaire lysate werd gesloopt met streptavidine beklede magnetische kralen. Tot slot, het doel dat mRNA in de trok-down nucleic acid complex werd gekwantificeerd aan de hand van een qPCR gebaseerde strategie.

MiRNAs regelen cellulaire processen door binding aan target mRNAs. Identificeren mRNA doelstellingen zijn dus een sleutel tot het begrijpen van miRNA functie. Hier werken we een methode voor het identificeren van mRNA doelwit van cellulaire miRNA. Dit protocol is aangepast van Wani et al. 35 met de wijziging van het gebruik van biotinyleerd LNA gebaseerde miRNA nabootsers aan pulldown target mRNA. Het gebruik van oligonucleotide LNA gebaseerde nabootsers v...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Gelijktijdige Video-EEG-ECG controle om te identificeren Neurocardiac dysfunctie in muismodellen van epilepsie

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cel gebaseerde analyses van SINEUP niet-coderende RNAs die specifiek mRNA vertaling kunnen verbeteren

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...