Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי הלאומית המכונים לבריאות (NIH) DA037779 מענקים (כדי ג'יי פי), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960, MD007586 (על הדיסק). העבודה גם נתמך על ידי G12MD007586 גרנט RCMI, UL1RR024975 גרנט CTSA ונדרבילט, מרכז המחקר Translational Meharry (MeTRC) CTSA הענק (RR026140 U54 NCRR/NIH, את MD007593 גרנט U54 מ NIMHD/NIH, מרכז טנסי לאיידס מחקר (P30 AI110527).

1. תרביות תאים של miRNA 3'-biotinylated
הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך תא סטרילי למינארי.
<ol><li>זרע 4 x 105–5 x 105 HEK-293T תאים לכל טוב ב- 2 מ של השלם של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) [DMEM בתוספת 10% סרום עוברית שור (FBS) ו- 1 x עט-דלקת אנטיביוטיקה]. התרבות התאים בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלז...

זיהוי של מטרות mRNA של הסלולר miRNAs חשוב להבנת תפקידם רגולטוריות. מספר כלים חישוביים מועסקים לחזות המטרות בהתבסס על זרע רצף משלימים את החסר ועל שימור היעד-רצפים-19,-20. כלים אלה אמנם יקר, הם יכולים ליצור רמות גבוהות של תוצאות false חיוביות והן שליליות כוזבות. לכן, תחז?...

מיקרו Rna (miRNAs) הם קטנים ללא קידוד RNAs המווסתים ביטוי חלבון1באופן שלילי. סימנים מקדימים של miRNA לשכון אשכולות דרך אזורים רבים של הגנום, בתדירות הגבוהה ביותר בתוך אזורים intergenic, אינטרונים של חלבונים גנים2,3. להן של miRNAs לערב שעתוק של פרי-miRNAs מ קידוד miRNA גנים4. פרי-miRNAs עוברים עיבוד סדרתי, תחילה בגרעין ואז בציטופלסמה כדי ליצור יחידה miRNAs בוגרת נטושים4,5. לאחר מכן, בוגרת miRNAs משולבים המתחם שתיקה RNA-induced (RISC): קומפלקס חלבונים-RNA multimeric הכולל חבר של משפחת Argonaute של חלבונים היעד זיהוי4,5, 6,7. בוגרת miRNAs ב- RISC מורכבות בעיקר לאגד 3' UTR של היעד mRNAs8,9,10 אבל יכול גם לאגד מדי פעם את הקוד ובאזור 5' UTR של mRNA10,11 . הכריכה של miRNA ל mRNA רצף תוצאות translational שתיקה12,13,14 וכמה תיקים mRNA הקשורה15. מאז miRNA יחיד יכול למקד mRNAs רבים, מולקולות אלה רגולטוריות מעורב כמעט בכל תהליך הסלולר, היו מעורבים שונים המחלה התנאים16,17,18.
ההבנה מפורט כיצד miRNAs להסדיר מסלולים סלולריים דורש זיהוי של mRNAs המטרה. פלטפורמות מרובות ביואינפורמטיקה זמינים לחזות miRNA:mRNA בשם אינטראקציות19,20. תחזיות אלה מסתמכים על ווטסון-קריק הבסיס זיווג מושלם בין 2-8 נוקלאוטיד זרע רצף miRNA רצף משלים בתוך ה mRNA היעד4,21. בנוסף, כלים אלה ליצור מבנה שניוני של דופלקס miRNA:mRNA, חישוב הפרמטרים התרמודינמית של אינטראקציה מולקולרית זו ולהראות שימור האתרים מחייב על פני מינים לשיפור פונקציונלי הרלוונטיות של המטרה חיזוי. למרבה הצער, כלים אלה יש גם המגבלה של חיזוי מטרות חיובי כוזב בקצב מאוד גבוה (~ 27 – 70%)15,22. והכי חשוב, פלטפורמות אלה סיליקו להיכשל לזהות את האינטראקציות קאנונית של miRNAs עם המטרות שלהם23. לכן, כזה הניתוחים חזוי משולבים לעתים קרובות עם שיטות נסיוניות כדי לאמת את המטרות באופן פונקציונלי.
גישות רבות פותחו לאימות השפעול האינטראקציה miRNA:mRNA. ניסויים גנטיים באמצעות miRNA מחקה, ספוגים, מעכבי שמשנות את רמות miRNAs בתא לספק רמזים על השפעתו הרגולציה על היעד גנים ביטוי24,25,26. בנוסף, כתב המבוסס על מבחני דרך שיתוף תרביות תאים של שיבוט המכיל 3' UTR האזור של mRNA, miRNA מחקה היעד או מעכבי לתוך תאים לספק הוכחה של פונקציית רגולציה של miRNAs26. בעוד ששיטות אלה חיוני ללמוד post-transcriptional בקרת גנים מאת miRNAs, תרביות תאים pleotropic ויעילות תופעות של שינויים ברמות miRNA הסלולר הן מגבלות הגדולות של אלה גישות גנטיות23, 26. לכן, שיטות ביוכימיות משלימים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו הם מועסקים כדי להבין טוב יותר את תפקוד miRNAs הסלולר.
אחת השיטות בשימוש נרחב כדי ללמוד את האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו היא immunoprecipitation של מורכבות RISC ואחריו את הגילוי של mRNA היעד בתוך מתחם27,28,29,30 . לאחרונה, שיטה משופרת של מלכודת RISC היה מנוצל גם לזהות מטרות miRNA; זה זוגות ייצוב של יעדים בתוך intermediates RISC-miRNA-mRNA בטהרה של mRNA מטרות. עם זאת, אלה methodsface האתגרים הכרוכים שאינם ספציפיים אינטראקציות בין חלבונים RNA ו- RNA-איגוד אשר מובדלים בדרך כלל על ידי תאים סלולריים31,32. בנוסף, מבחני אלה תלויות הנוכחות של חלבון AGO2 עבור immunoprecipitation של קומפלקס RISC33. בהתחשב בכך AGO2 אינה argonaute רק לתווך אינטראקציות miRNA:mRNA יעיל, אי-הכללה של אחרים argonautes עלול להוביל מוטה תוצאות34. לכן, אסטרטגיות אלטרנטיביות נדרשים ללמוד איגוד ישירה של miRNA ל mRNA.
בדו ח זה, אנו נרחיב על גישה חד-שלבית דורשים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA המטרה שלו mRNA. ראשית, 3' מחקה miRNA חומצת גרעין (מגבר קדם) של biotinylated נעול הם transfected בתרבית של תאים. לאחר מכן, miRNA:mRNA מתחם הסלולר lysate נתפס באמצעות beads מגנטי streptavidin מצופה. המטרה mRNA המאוגד שלו miRNA משלימים זה לכמת באמצעות qPCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של RNAs noncoding קטן המווסתים ביטוי גנים הסלולר post-transcriptionally. איגוד MiRNAs לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של יעד ה-mRNA לעכב תרגום חלבונים או במקרים מסוימים לגרום השפלה mRNA. הכריכה של miRNA 3' UTR המטרה ש-mrna מתווך על ידי רצף 2 – 8 זרעים נוקלאוטיד בקצה 5' של miRNA. בעוד תפקיד miRNAs כמו מולקולות התאית התקינה וותיקה, זיהוי של mRNAs המטרה עם רלוונטיות פונקציונלי נשאר אתגר. יש כבר מועסקים Bioinformatic כלים לחזות רצפים בטווח 3' UTR של mRNAs בתור מטרות פוטנציאליות עבור איגוד miRNA. כלים אלה יש גם מנוצל כדי לקבוע שימור כזה רצפים בין מינים קרובים אבולוציונית בניסיון לחזות את תפקיד פונקציונלי. אולם, שיטות אלה לעיתים קרובות להפיק תוצאות חיוביות שגויות, מוגבלות לחיזוי הקנוני האינטראקציה בין miRNA ל- mRNA. לכן, הטיפול. הניסיוני המודדים איגוד ישירה של miRNA למטרה mRNA שלו נחוצים ליצור אינטראקציה פונקציונלית. בדו ח זה, אנו מתארים שיטה רגיש עבור אימות באינטראקציה ישירה בין הסלולר miRNA של מיר-125b את 3' UTR של PARP-1 mRNA. אנו נרחיב על פרוטוקול שבו מחקה biotinylated סינתטי-miRNA היו transfected בתרבית של תאים, למתחם miRNA-mRNA הסלולר lysate היה משוך כלפי מטה עם מצופים streptavidin beads מגנטי. בסופו של דבר, המטרה ש-mrna של חומצות גרעין למטה הוציא מורכבים הייתה לכמת באמצעות אסטרטגיה מבוסס qPCR.

MiRNAs לווסת תהליכים תאיים על-ידי איגוד אל היעד mRNAs. לכן, זיהוי מטרות mRNA הן מפתח כדי להבין את הפונקציה miRNA. כאן אנו נרחיב על שיטה לזיהוי mRNA היעד של miRNA הסלולר. פרוטוקול זה הוא ממאמרו של Wani. et al. 35 עם השינוי של ניצול biotinylated מחקה miRNA מבוססת מגבר קדם כדי הנפתח יעד ה-mRN...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

סימולטני וידאו-EEG-אק ג ניטור כדי לזהות Neurocardiac בתפקוד במודלים של העכבר של אפילפסיה

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...