Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni DA037779 (a J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 e MD007586 (a C.D.). Il lavoro è stato anche sostenuto dal RCMI Grant G12MD007586, i Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, centro di ricerca traduzione Meharry (MeTRC) CTSA concedere (U54 RR026140 da NCRR/NIH, il Grant MD007593 U54 da NIMHD/NIH e il Tennessee Center per AIDS Ricerca (P30 AI110527).

1. la transfezione di 3'-biotinylated miRNA
Nota: Eseguire la procedura seguente all'interno di una cappa a flusso laminare sterile.
<ol><li>Cellule di seme 4 x 105– 5 x 105 HEK 293T per pozzetto in 2 mL di completano per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) [DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1 x antibiotico penna-strep]. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, controllare la...

Identificazione di mRNA target dei miRNA cellulari è importante per capire la loro funzione regolatrice. Diversi strumenti computazionali sono impiegati per prevedere obiettivi basati sulla complementarietà di sequenza di sementi e sulla conservazione di sequenze bersaglio19,20. Anche se questi strumenti sono utili, possono generare elevati livelli di falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, queste previsioni sono accoppiate con metodi sperimentali qual...

I microRNA (Mirna) sono piccoli RNA che regolano negativamente l' espressione di proteina1non codificanti. Precursori di miRNA risiedono in cluster attraverso molte regioni del genoma, più frequentemente all'interno delle regioni intergeniche e introni di proteina-codificazione geni2,3. Biogenesi dei miRNA coinvolgono trascrizione dei pri-miRNA da miRNA-codifica geni4. I pri-miRNA sono sottoposti a elaborazione sequenziale, prima nel nucleo e nel citoplasma per generare singolo incagliato Mirna maturi4,5. Successivamente, i miRNA maturi sono incorporati il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC): una proteina-RNA multimerica complessa che include un membro della famiglia di proteine per destinazione riconoscimento4,5, Argonaute 6,7. Mirna maturi nel complesso RISC prevalentemente associare al 3' UTR di destinazione mRNAs8,9,10 ma anche possono associare occasionalmente nella codificazione e la regione 5' UTR del mRNA10,11 . L'associazione di miRNA per il mRNA sequenze risultati in traslazionale silenziamento12,13,14 e in alcuni casi mRNA destabilizzazione15. Poiché un singolo miRNA puoi indirizzare molti mRNA, queste molecole regolatrici sono coinvolte in quasi ogni processo cellulare e sono state implicate in varie malattie condizioni16,17,18.
Conoscenza dettagliata di come Mirna regolano vie cellulari richiede l'identificazione degli mRNA bersaglio. Sono disponibili per predire putativi miRNA:mRNA interazioni19,20più piattaforme di bioinformatica. Queste previsioni si basano su perfetto Watson-Crick appaiamento tra la sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 del quieto e una sequenza complementare entro il4,di mRNA target21. Inoltre, questi strumenti generano la struttura secondaria del duplex miRNA:mRNA, calcolano i parametri termodinamici di questa interazione molecolare e visualizza conservazione delle sedi del legame tra le specie per migliorare la rilevanza funzionale della destinazione Pronostico. Purtroppo, questi strumenti hanno anche la limitazione della predizione falsi obiettivi positivi a un tasso molto elevato (~ 27 – 70%)15,22. La cosa più importante, queste piattaforme in silico non riescono a riconoscere le interazioni non-canonica di Mirna con loro obiettivi23. Pertanto, tali analisi predittive sono spesso combinati con metodi sperimentali per convalidare funzionalmente rilevanti obiettivi.
Diversi approcci sono stati sviluppati per convalidare sperimentalmente l'interazione miRNA:mRNA. Esperimenti genetici utilizzando miRNA mimics, spugne e inibitori che alterano i livelli di miRNA nella cella forniscono indizi per suo effetto regolatore dal bersaglio gene espressione24,25,26. Inoltre, reporter basato su analisi tramite co-transfezione di un clone contenente la regione 3' UTR di mimici di mRNA e miRNA la destinazione o inibitori in cellule forniscono la prova della funzione regolamentare di Mirna26. Mentre questi metodi sono fondamentali per studiare la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica di Mirna, effetti di efficienza e pleotropic di transfezione delle alterazioni nei livelli di miRNA cellulare sono grossi limiti di questi approcci genetici23, 26. Di conseguenza, complementari metodi biochimici che sonda l'interazione diretta tra miRNA e l'obiettivo sono impiegati per comprendere meglio la funzione cellulare dei miRNA.
Un metodo ampiamente utilizzato per studiare l'interazione diretta tra miRNA e il suo obiettivo è immunoprecipitazione del complesso RISC seguito mediante l'individuazione del target di mRNA all'interno del complesso27,28,29,30 . Recentemente, un metodo migliorato di trappola RISC è stato utilizzato anche per identificare bersagli miRNA; si accoppia stabilizzazione degli obiettivi all'interno gli intermedi di RISC-miRNA-mRNA con la purificazione del mRNA bersaglio. Tuttavia, questi methodsface le sfide inerenti delle interazioni aspecifiche tra proteine RNA e RNA-binding che solitamente sono segregate da compartimenti cellulari31,32. Inoltre, queste analisi sono dipendente dalla presenza di proteine AGO2 per immunoprecipitazione del complesso RISC33. Dato che AGO2 non è l'unico argonaute per mediare interazioni miRNA:mRNA efficiente, l'esclusione di altri argonautes potrebbe portare a risultati biased34. Pertanto, strategie alternative sono necessari per studiare il legame diretto del miRNA a mRNA.
In questo rapporto, abbiamo elaborato un approccio One-Step per sondare l'interazione diretta tra un miRNA e l'obiettivo mRNA. In primo luogo, 3' biotinilati bloccato dell'acido nucleico (LNA) miRNA imita transfected nelle cellule di mammiferi. Quindi, la miRNA:mRNA complesso nel lisato cellulare viene catturato utilizzando streptavidina biglie magnetiche. Il target di mRNA associato alla sua miRNA complementare è quantificato utilizzando qPCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

I microRNA (Mirna) sono una classe di piccoli RNA non codificanti che appaiamento regolano l'espressione genica cellulare. Mirna bind per la regione 3' non tradotta (UTR) del bersaglio mRNA per inibire la traduzione della proteina o in alcuni casi causare la degradazione di mRNA. L'associazione del quieto al 3' UTR del bersaglio che mRNA è mediato da una sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 all'estremità 5' di miRNA. Mentre il ruolo dei miRNA come molecole regolatrici cellulari è ben consolidato, identificazione degli mRNA bersaglio con rilevanza funzionale rimane una sfida. Strumenti bioinformatici sono stati impiegati per prevedere sequenze all'interno di 3' UTR degli mRNA come obiettivi potenziali per l'associazione di miRNA. Questi strumenti sono stati utilizzati anche per determinare la conservazione evolutiva di tali sequenze tra specie affini nel tentativo di prevedere il ruolo funzionale. Tuttavia, questi metodi computazionali spesso generano falsi positivi e sono limitati a predire canonica interazione tra miRNA e mRNA. Di conseguenza, le procedure sperimentali che misurano il legame diretto del miRNA al suo target di mRNA sono necessari da stabilire interazione funzionale. In questo rapporto, descriviamo un metodo sensibile per la convalida di interazione diretta tra i cellulari miRNA miR-125b e 3' UTR di PARP-1 mRNA. Elaboriamo un protocollo in cui imita sintetico biotinilato-miRNA transfected nelle cellule di mammiferi e il complesso di miRNA-mRNA nel lisato cellulare è stato tirato con biglie magnetiche rivestite con streptavidina. Infine, la destinazione del che mRNA nel complesso dell'acido nucleico spostate verso il basso è stato quantificato utilizzando una strategia basata su qPCR.

Mirna regolano processi cellulari legandosi agli mRNA bersaglio. Di conseguenza, identificazione mRNA bersaglio è la chiave per capire la funzione di miRNA. Qui abbiamo elaborato un metodo per identificare target di mRNA di miRNA cellulare. Questo protocollo è adattato da Wani et al. 35 con la modifica dell'utilizzazione biotinilati basati su LNA miRNA imita di pulldown bersaglio mRNA. L'uso di base di LNA oligonucleotidi mimici migliora la specificità ...

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Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Ricerca

Genetica

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

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Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

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Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Video-EEG-ECG simultaneo monitoraggio per identificare la disfunzione Neurocardiac in modelli murini di epilessia

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

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Procedura di RNA Pull-down per identificare gli obiettivi di RNA di un RNA lunghi Non codificanti

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

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CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

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Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

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Cell Based Assays di Non-codificazione RNAs che specificamente può migliorare la traduzione degli mRNA aumentandone

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...