Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd DA037779 (å J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 og MD007586 (å CD). Arbeidet ble også støttet av RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, gi Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 fra NIMHD/NIH og Tennessee senter for AIDS Forskning (P30 AI110527).

1. hva av 3-biotinylated miRNA
Merk: Utfører du følgende trinn i sterilt laminær strømning hette.
<ol><li>Frø 4 x 105–5 x 105 HEK-293T celler per brønn i 2 mL fullføre Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) [DMEM med 10% fosterets Bovine serum (FBS) og 1 x penn-strep antibiotika]. Kultur cellene i en inkubator satt på 37 ° C, 5% CO2 over natten.</li>
	<li>Neste dag, sjekk helse og etterlevelse av belagt cellene under et lys mikroskop. Merk: Kontro...

Identifikasjon av mRNA målene for mobilnettet miRNAs er viktig for å forstå deres regulatoriske funksjon. Flere beregningsorientert verktøy er ansatt å forutsi mål basert på frø sekvens komplementaritet og bevaring av målet sekvenser19,20. Selv om disse verktøyene er verdifulle, kan de generere høye nivåer av både falske positiver og feilaktige negativer. Derfor er disse spådommene kombinert med eksperimentelle metoder som immunoprecipitation av RIS...

MicroRNAs (miRNAs) er små ikke-koding RNAs som negativt regulerer protein uttrykk1. Forløpere for miRNA ligge i gjennom mange regioner i genomet, oftest innen intergenisk regioner og introns protein-koding gener2,3. Biogenesis av miRNAs involverer transkripsjon av pri-miRNAs fra miRNA-koding gener4. Pri-miRNAs gjennomgå sekvensiell behandling, først i kjernen og deretter i cytoplasma generere enkelt strandet moden miRNAs4,5. Senere, de eldre miRNAs er innlemmet i RNA-indusert stanse komplekset (RISC): en multimeric protein-RNA kompleks som inkluderer medlem av Argonaute proteiner målet anerkjennelse4,5, 6,7. Eldre miRNAs i RISC komplekse hovedsakelig binde til den 3-' UTR i målet mRNAs8,9,10 , men kan også binde noen ganger i koding og 5' UTR regionen av mRNA10,11 . Binding av miRNA til mRNA sekvenser resultater i translasjonsforskning stanse12,13,14 og i noen tilfeller mRNA destabilisering15. Siden en enkelt miRNA kan målrette mange mRNAs, disse regulatoriske molekylene er involvert i nesten alle mobilnettet prosessen og har vært innblandet i ulike sykdom betingelser16,17,18.
Detaljert forståelse av hvordan miRNAs regulere cellular stier krever identifikasjon av målet mRNAs. Flere bioinformatikk plattformer er tilgjengelige til å forutsi mulige miRNA:mRNA vekselsvirkningene19,20. Disse spådommene stole på perfekt Watson-Crick base sammenkoblingen mellom 2-8 nukleotid frø sekvensen av miRNA og en utfyllende sekvens i målet mRNA4,21. I tillegg disse verktøyene generere sekundære strukturen i miRNA:mRNA duplex, beregne termodynamisk parametere av dette molekylær samspillet og vise bevaring av bindende områder over arter å forbedre funksjonelle relevansen av målet prediksjon. Dessverre har disse verktøyene også begrensning av forutsi falske positive mål på et svært høy hastighet (~ 27-70%)15,22. Viktigst, mislykkes disse i sili plattformer i å gjenkjenne miRNAs ikke-kanoniske samhandling med deres mål23. Derfor er slike forutsigende analyser ofte kombinert med eksperimentelle metoder for å validere funksjonelt relevante mål.
Flere tilnærminger har blitt utviklet for å validere eksperimentelt miRNA:mRNA interaksjon. Genetiske eksperimenter med miRNA etterlikner, gir svamper og hemmere som endrer nivåer av miRNAs i cellen ledetråder for sin regulerende effekt på målet gene expression24,25,26. I tillegg reporter basert analyser via co transfection av en klone som inneholder 3 UTR regionen målet mRNA og miRNA imiterer eller hemmere i celler beviser regulatoriske funksjonen miRNAs26. Disse metodene er avgjørende for å studere post-transcriptional regulering av genuttrykk av miRNAs, er hva effektivitet og pleotropic effekter av endringer i mobilnettet miRNA nivåer store begrensninger av disse genetiske tilnærminger23, 26. Derfor er komplementære biokjemiske metoder som probe direkte samspill mellom miRNA og målet ansatt å forstå funksjonen mobilnettet i miRNAs.
En brukte metoden å studere direkte samspill mellom miRNA og målet er immunoprecipitation av RISC sammensatt fulgt av gjenkjenning av mRNA målet innen den komplekse27,28,29,30 . Nylig ble en forbedret RISC felle metode også benyttet for å identifisere miRNA mål; det par stabilisering av mål innen RISC-miRNA-mRNA intermediates med rensing av mRNA mål. Men disse methodsface uspesifisert samspillet mellom RNA og RNA-bindende proteiner som vanligvis er segregerte av mobilnettet rom31,32iboende utfordringer. I tillegg er disse analyser avhengig av tilstedeværelse av AGO2 protein for immunoprecipitation RISC komplekse33. Gitt at AGO2 ikke er den eneste argonaute å megle effektiv miRNA:mRNA vekselsvirkningene, kan utelukkelse av andre argonautes føre til forutinntatte resultater34. Derfor for alternative strategier å studere direkte binding av miRNA til mRNA.
I denne rapporten vi utdype en ett-trinns tilnærming for utprøvende direkte samspill mellom en miRNA og målet mRNA. Først 3 biotinylated låst nukleinsyre (LNA) miRNA imiterer er transfekterte i pattedyrceller. Deretter fanges miRNA:mRNA i mobilnettet lysate bruker streptavidin belagt magnetiske perler. MRNA målet bundet til sin komplementære miRNA er kvantifisert ved hjelp av qPCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

MicroRNAs (miRNAs) er en klasse av små noncoding RNAs som post-transcriptionally regulerer mobilnettet genuttrykk. MiRNAs binde til 3 uoversatt regionen (UTR) mot mRNA hemme protein oversettelse eller i noen tilfeller føre mRNA degradering. Binding av miRNA til den 3-' UTR i av målet mRNA er formidlet av en 2-8 nukleotid frø sekvens nederst 5' miRNA. MiRNAs rolle som mobilnettet regulatoriske molekyler er godt etablert, identifikasjon av målet mRNAs med funksjonell relevans er fortsatt en utfordring. Bioinformatic verktøy har vært ansatt å forutsi sekvenser fra den 3-' UTR i av mRNAs som potensielle mål for miRNA bindingen. Disse verktøyene har også blitt benyttet for å fastslå evolusjonære bevaring av slike sekvenser blant beslektede arter i et forsøk på å forutsi funksjonelle rolle. Men metodene beregningsorientert ofte generere falske positive resultater og er begrenset til forutsi kanoniske samspillet mellom miRNA og mRNA. Eksperimentell prosedyrer som måler direkte binding av miRNA til mRNA målet er derfor nødvendig å etablere funksjonell interaksjon. I denne rapporten beskriver vi en følsom metoden for validering av direkte samspill mellom mobilnettet miRNA miR-125b og de 3' UTR av PARP-1 mRNA. Vi utdype en protokoll som syntetisk biotinylated-miRNA imiterer var transfekterte i pattedyrceller og miRNA-mRNA komplekset i mobilnettet lysate ble revet med streptavidin-belagt magnetiske perler. Endelig målet mRNA i trakk ned nukleinsyre komplekse ble kvantifisert ved hjelp av en qPCR-basert strategi.

MiRNAs regulere cellular prosesser ved binding til målet mRNAs. Identifisere mRNA mål er derfor en nøkkel å forstå miRNA funksjon. Her utdype vi en metode for å identifisere mRNA målet for mobilnettet miRNA. Denne protokollen er tilpasset fra Wani et al. 35 med endring av utnytte biotinylated LNA-baserte miRNA imiterer til pulldown målrette mRNA. Bruk av LNA-baserte oligonucleotide etterlikner forbedrer spesifisitet av målet binding på grunn av h...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Denne rapporten beskriver en rask og pålitelig metode for å validere mRNA mål av mobilnettet miRNAs. Metoden bruker syntetiske biotinylated låst nukleinsyre LNA-baserte miRNA etterligner for å fange mål mRNA. Deretter streptavidin-belagt magnetiske perler er ansatt å pulldown målet mRNA for kvantifisering av qPCR polymerasekjedereaksjons.

Biotin-baserte Pulldown analysen å validere mRNA mål av mobilnettet miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser av sirkulerende mirnas i Irritabel tarm syndrom oppdages ved hjelp av en multiplekset Høy throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse av Cap-bindende proteiner i humane celler eksponert for Fysiologiske oksygenforholdene

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation å studere i Vivo mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Måle mRNA nivåer Over tid under gjær S. cerevisiae Hypoxic svaret

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidige Video-EEG-EKG overvåking for å identifisere Neurocardiac dysfunksjon i musen modeller av epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA rullegardinmenyen prosedyre å identifisere RNA mål av en lenge ikke-koding

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cellen basert analyser av SINEUP ikke-koding RNAs som spesielt kan forbedre mRNA oversettelse

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...