Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Эта работа частично поддерживается DA037779 национальных институтов здравоохранения (НИЗ) гранты (до Ю.П.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 и MD007586 (для ПД). Работа также была поддержана RCMI Грант G12MD007586, Вандербильт CTSA Грант UL1RR024975, Мехарри переводческая научно-исследовательский центр (MeTRC) CTSA Грант (U54 RR026140 от NCRR/низ, Грант MD007593 U54 от NIMHD/низ и Теннесси центр СПИДа Исследования (P30 AI110527).

1. transfection 3'-биотинилированным Мирна
Примечание: Выполните следующие действия внутри стерильной Ламинарный шкаф.
<ol><li>Семя 4 x 105– 5 x 105 ГЭС 293T клеток на скважину в 2 мл полное Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) [DMEM дополнена 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1 х перо ?...

Определение мРНК-мишеней сотовой интерферирующим имеет важное значение для понимания их функции регулирования. Несколько вычислительных средств используются для прогнозирования цели, основанные на взаимодополняемости семян последовательности и сохранения целевого объекта послед?...

МикроРНК (интерферирующим) малы некодирующих РНК, которые негативно регулируют выражение протеина1. Предшественники микроРНК проживают в кластерах через многие регионы генома, наиболее часто в intergenic регионах и интронов белка кодирование генов2,3. Биогенеза интерферирующим включают транскрипции pri адаптивной от miRNA кодирование генов4. Pri адаптивной проходят последовательной обработки, сначала в ядре и затем в цитоплазме для создания единого мель Зрелые интерферирующим4,5. Впоследствии, Зрелые интерферирующим включены в РНК-комплекс (RISC): multimeric белка РНК комплекс, который включает в себя членом семьи Argonaute белков для целевых признание4,5, 6,7. Зрелые интерферирующим в RISC комплекс преимущественно привязку к 3' УТР целевой mRNAs8,9,10 , но можно также привязать иногда кодирование и 5' УТР регионе мРНК10,11 . Связывание Мирна к мРНК последовательностей результаты в трансляционной глушителей12,13,14 и в некоторых случаях мРНК дестабилизации15. Поскольку один Мирна можно ориентировать многие мРНК, эти регуляторные молекулы участвуют в почти каждый клеточных процессов и были вовлечены в различные болезни условия16,17,18.
Глубокое понимание как интерферирующим регулировать сотовой пути требует идентификации целевого мРНК. Биоинформатика платформ доступны прогнозировать предполагаемый miRNA:mRNA взаимодействия19,20. Эти предсказания полагаются на идеальный Уотсона-крика низкопробный спаривать между 2-8 семян нуклеотидной последовательности Мирна и взаимодополняющих последовательности в рамках целевой мРНК4,21. Кроме того эти инструменты создать вторичную структуру miRNA:mRNA дуплекс, расчет термодинамических параметров этого молекулярного взаимодействия и показать сохранения привязки сайтов различных видов для повышения функциональной значимости цели предсказание. К сожалению эти средства также имеют ограничение прогнозирования ложных положительных целей очень высокий уровень (~ 27 – 70%)15,22. Самое главное эти платформы в silico не признать неканонических взаимодействия интерферирующим с их цели23. Таким образом такой интеллектуальный анализ часто комбинируются с экспериментальные методы для проверки функционально соответствующих целей.
Были разработаны несколько подходов для экспериментально проверить miRNA:mRNA взаимодействия. Генетических экспериментов с использованием Мирна мимики, губки и ингибиторов, которые изменяют уровни интерферирующим в ячейке предоставляют ключи для его регулирования воздействия на25,24,выражение гена целевой26. Кроме того репортер на основе анализов через совместное трансфекции клона, содержащий 3' УТР регионе целевой мРНК и Мирна имитирует или ингибиторов в клетки свидетельствуют о регулирующей функции интерферирующим26. Хотя эти методы имеют решающее значение для изучения post-transcriptional регуляции экспрессии генов, адаптивной, transfection эффективность и pleotropic эффекты изменений в клеточных Мирна уровнях являются основные ограничения этих генетических подходов23, 26. Таким образом взаимодополняющие биохимические методы, проверяющие прямое взаимодействие между Мирна и его цели работают лучше понять клетчатую функцию адаптивной.
Один широко используемый метод изучения прямое взаимодействие между Мирна и его целью является иммунопреципитации RISC комплекс следуют обнаружения mRNA цели в пределах комплекса27,28,29,30 . Недавно усовершенствованный метод ловушки RISC была также использована для выявления Мирна целей; Это пары стабилизации целей в рамках промежуточных RISC-miRNA мРНК с очисткой мРНК-мишеней. Однако эти methodsface присущие проблемы неспецифичные взаимодействия РНК и RNA-связывая протеинов, которые обычно разделяются на клеточном отсеков31,32. Кроме того эти анализы зависит от наличия давности2 белка для иммунопреципитации RISC комплекс33. Учитывая, что давности2 является не только argonaute для эффективного miRNA:mRNA взаимодействие, исключение других argonautes может привести к предвзятым результаты34. Таким образом альтернативные стратегии необходимы для изучения прямую привязку Мирна к мРНК.
В настоящем докладе, мы разрабатываем одноэтапный подход для проверки прямого взаимодействия между Мирна и его целевых мРНК. Во-первых 3' биотинилированным заблокирован нуклеиновой кислоты (LNA) Мирна имитирует являются transfected в mammalian клетках. Затем miRNA:mRNA комплекс в lysate сотовых фиксируются с помощью магнитной бусины стрептавидина покрытием. Целевой мРНК, обязан ее дополнительных Мирна количественно с помощью ПЦР.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

МикроРНК (интерферирующим) являются класс малых некодирующей РНК, которые post-transcriptionally регулировать экспрессию клеточных генов. Интерферирующим привязку к 3' непереведенные региона (утр) целевых мРНК ингибировать белков перевод или в некоторых случаях привести к деградации мРНК. Связывание Мирна с 3' УТР цели, которую мРНК при посредничестве 2 – 8 нуклеотидной последовательности семян к 5' концу Мирна. Хотя роль адаптивной как сотовой регуляторных молекул является хорошо организованной, идентификация целевого мРНК с функциональной значимости остается проблемой. Инструменты bioinformatic использовались для прогнозирования последовательностей в течение 3' УТР мРНК как потенциальных объектов для привязки Мирна. Эти средства использовались также определить эволюционной сохранения таких последовательностей среди родственных видов в попытке предсказать функциональную роль. Однако эти вычислительные методы часто создавать ложных положительных результатов и ограничиваются прогнозирования канонические взаимодействие между Мирна и мРНК. Таким образом экспериментальные методы, измеряющих прямую привязку Мирна mRNA цели необходимы для создания функционального взаимодействия. В настоящем докладе мы описываем чувствительный метод для проверки прямого взаимодействия между сотовой микроРНК miR-125b и 3' УТР ППА-1 мРНК. Мы разработать протокол, в котором синтетических биотинилированным miRNA имитирует были transfected в клетки млекопитающих и Мирна мРНК комплекс в lysate сотовых был потянул вниз с покрытием стрептавидина магнитные бусы. Наконец цель, которую мРНК в потянул вниз нуклеиновой кислоты комплекс был количественно с помощью стратегию на основе ПЦР.

Интерферирующим регулировать клеточных процессов путем привязки к целевой мРНК. Таким образом определение мРНК-мишеней являются ключом к понять функции Мирна. Здесь мы подробно метод для выявления мишенью мРНК клеточных Мирна. Этот протокол является адаптирована из...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

В настоящем докладе описывается быстрый и надежный метод для проверки мРНК-мишеней клеточных адаптивной. Метод использует Мирна Locked LNA нуклеиновой кислоты на основе синтетических биотинилированным имитирует захватить цель мРНК. Впоследствии, с покрытием стрептавидина магнитные бусы используются для выпадающих целевой мРНК для количественной ПЦР полимеразной цепной реакции.

На основе биотина пулдаун Assay для проверки mRNA цели сотовой адаптивной

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Возмущения Циркулирующие микроРНК при синдроме раздраженного кишечника Обнаружен Использование Multiplexed высокой пропускной способностью экспрессии генов платформы

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Лазерная Microirradiation учиться в Vivo клеточных реакций на повреждение ДНК простых и сложных

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Измерение уровня мРНК со временем во время дрожжей S. cerevisiae гипоксических ответа

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Одновременная видео ЭЭГ-мониторинг ЭКГ для выявления Neurocardiac дисфункции в моделях мыши эпилепсии

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования чтобы сделать условное мутантов из человека малярийного паразита P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Ячейки на основе анализов SINEUP кодирования РНК, которые могут конкретно улучшить перевод мРНК

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...