Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Detta arbete var delvis stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag DA037779 (till JP), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 och MD007586 (till C.D.). Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA arbetet stöddes också av den RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, och bevilja (U54 RR026140 från NCRR/NIH, den U54 Grant MD007593 från NIMHD/NIH och Tennessee Center for AIDS Forskning (P30 AI110527).

1. transfection av 3'-biotinylerade miRNA
Obs: Utför följande steg släpper en steril LAF.
<ol><li>Utsäde 4 x 105– 5 x 105 HEK-293T celler per brunn i 2 mL komplett Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) [DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1 x penna-strep antibiotikum]. Odla cellerna i en inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2 över natten.</li>
	<li>Nästa dag, kontrollera hälsa och följsamhet av pläterad celler under ett lju...

Identifiering av mRNA mål av cellulära MicroRNA är viktigt för att förstå deras reglerande funktion. Flera beräkningsverktyg är anställda att förutsäga mål baserat på utsäde sekvens komplementaritet och bevarande av målet sekvenser19,20. Även om dessa verktyg är värdefulla, kan de generera höga nivåer av både falska positiva och falska negativa. Därför är dessa förutsägelser tillsammans med experimentella metoder såsom immunoprecipitati...

MikroRNA (Mirna) är små icke-kodande RNAs som negativt reglerar protein uttryck1. Prekursorer av miRNA bosatta i kluster genom många regioner i genomet, oftast inom intergenic regioner och introner protein-kodande gener2,3. Biogenes av MicroRNA involvera transkription av den pri-MicroRNA från miRNA-encoding gener4. De pri-MicroRNA genomgå sekventiell behandling, först i kärnan och sedan i cytoplasman att generera enda stranded mogen MicroRNA4,5. Därefter, de mogna MicroRNA är införlivade i RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC): ett multimeric protein-RNA komplex som innehåller en medlem av familjen Argonaute av proteiner för målet erkännande4,5, 6,7. Mogen MicroRNA i den komplexa RISC huvudsakligen binder till den 3' UTR av målet mRNA8,9,10 men kan också binda ibland i kodning och 5' UTR regionen av mRNA10,11 . Bindningen av miRNA till mRNA sekvenser resultat i translationell ljuddämpningssystemet12,13,14 och i vissa fall mRNA destabilisering15. Eftersom en enda miRNA kan rikta många mRNA, dessa reglerande molekyler är inblandade i nästan varje cellulär process och har varit inblandade i olika sjukdom villkor16,17,18.
Detaljerad förståelse av hur MicroRNA reglera cellulär vägar kräver identifiering av den mål-mRNA. Det finns flera bioinformatik plattformar att förutsäga förmodad miRNA:mRNA interaktioner19,20. Dessa förutsägelser lita på perfekt Watson-Crick bas parkoppling mellan den 2 – 8 nukleotidsekvensen utsäde av miRNA och en kompletterande sekvens inom de mål mRNA4,21. Dessutom dessa verktyg generera sekundärt strukturera av miRNA:mRNA duplex, beräkna termodynamiska parametrar av denna molekylär interaktion och Visa bevarande av de bindande platserna över arter att förbättra funktionella betydelse för målet prognos. Tyvärr har dessa verktyg också begränsning av förutsäga falska positiva mål på en mycket hög grad (~ 27 – 70%)15,22. Viktigast av allt, misslyckas dessa i silico -plattformar att känna igen de icke-kanoniska interaktionerna mellan MicroRNA och deras mål23. Sådana prediktiva analyser kombineras därför ofta med experimentella metoder för att validera funktionellt relevanta mål.
Flera metoder har utvecklats för att experimentellt validera miRNA:mRNA interaktion. Genetiska experiment med miRNA härmar, ge svampar och hämmare som förändrar nivåerna av MicroRNA i cellen ledtrådar för dess reglerande effekt på målet gen uttryck24,25,26. Dessutom reporter baserat analyser via samtidig transfection av en klon som innehåller regionen 3' UTR i de målet mRNA och miRNA härmar eller hämmare i celler förete bevis för regleringsverksamheten MicroRNA26. Medan dessa metoder är avgörande för att studera post-transcriptional reglering av genuttryck genom MicroRNA, är transfection effektivitet och pleotropic effekterna av förändringar i cellulära miRNA nivåer stora begränsningar av dessa genetiska metoder23, 26. Därför är kompletterande biokemiska metoder som sond direkt interaktion mellan miRNA och dess mål anställd för att bättre förstå MicroRNA cellulär funktion.
En allmänt använd metod att studera direkt interaktion mellan miRNA och dess mål är immunoprecipitation av den RISC komplexa följt av detektion av mRNA mål inom den komplexa27,28,29,30 . Nyligen, en förbättrad metod för RISC-fällan var också utnyttjas för att identifiera miRNA mål; det par stabilisering av mål inom de RISC-miRNA-mRNA intermediärer med rening av mRNA mål. Dock dessa methodsface de inneboende utmaningarna av icke-specifika samspelet mellan RNA och RNA-bindande proteiner som är vanligtvis åtskilda av cellulära fack31,32. Dessa analyser är dessutom beroende av förekomsten av AGO2 protein för immunoprecipitation RISC komplexa33. Med tanke på att AGO2 inte är den enda argonaute att medla effektiv miRNA:mRNA interaktioner, kan uteslutandet av andra argonautes leda till partisk resultat34. Därför behövs alternativa strategier för att studera riktaband av miRNA till mRNA.
I betänkandet vi utarbeta en one-step metod för avsökning direkt interaktion mellan en miRNA och dess mål mRNA. Det första är 3' biotinylerade låst nukleinsyra (LNA) miRNA härmar transfekterade i däggdjursceller. Sedan fångas miRNA:mRNA komplex i cellulära lysate med streptividin belagda magnetiska pärlor. MRNA målet bunden till dess kompletterande miRNA kvantifieras med hjälp av qPCR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

MikroRNA (Mirna) är en klass av små icke-kodande RNAs som post-transcriptionally reglerar cellulära genuttryck. MicroRNA binda till 3' oöversatta regionen (UTR) rikta mRNA hämmar protein översättning eller i vissa fall orsaka mRNA nedbrytning. Bindningen av miRNA till den 3' UTR målet mRNA medieras av en 2-8 frö nukleotidsekvensen i 5' slutet av miRNA. MicroRNA roll som cellulära reglerande molekyler är väl etablerad, fortfarande identifiering av den mål mRNA funktionell betydelse en utmaning. Bioinformatiska verktyg har använts för att förutsäga sekvenser inom den 3' UTR av mRNA som potentiella mål för miRNA bindande. Dessa verktyg har också använts för att bestämma evolutionära bevarande av sådana sekvenser bland närbesläktade arter i ett försök att förutsäga funktionella roll. Men dessa beräkningsmetoder ofta genererar falska positiva resultat och är begränsade till att förutsäga canonical samverkan mellan miRNA och mRNA. Experimentella rutiner som mäter riktaband av miRNA till sitt mRNA mål är därför nödvändigt att fastställa funktionella interaktion. I den här rapporten beskriver vi en känslig metod för att validera direkt interaktion mellan den cellulära miRNA miR-125b och den 3' UTR av PARP-1 mRNA. Vi utarbeta ett protokoll där syntetiska biotinylerade-miRNA härmar var transfekterade i däggdjursceller och miRNA-mRNA anläggningen i cellulära lysate drogs med streptividin-belagda magnetiska pärlor. Slutligen, målet mRNA i de drog ner nukleinsyra komplexa kvantifierades använder en qPCR-baserad strategi.

MicroRNA reglera cellulära processer genom bindning till målet mRNA. Identifierande mRNA mål är därför en nyckel till att förstå miRNA funktion. Här utarbeta vi en metod för att identifiera mRNA målet för cellulära miRNA. Detta protokoll är anpassade från Wani o.a. 35 med ändring av utnyttja biotinylerade LNA-baserade miRNA härmar till pulldown rikta mRNA. Användningen av LNA-baserade oligonukleotiden härmar ökar specificiteten av måle...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Denna rapport beskriver en snabb och tillförlitlig metod för att validera mRNA mål av cellulära microRNA. De metoden använder syntetiska biotinylerade låst nukleinsyra LNA-baserade miRNA härmar för att fånga rikta mRNA. Därefter streptividin-belagda magnetiska pärlor är anställda att pulldown målet mRNA för kvantifiering av qPCR polymeras-kedjereaktion.

Biotin-baserade Pulldown Assay att validera mRNA mål av cellulära MicroRNA

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Störningar av cirkulerande miRNAs i Irritable Bowel Syndrome detekteras med hjälp av en Multiplex hög kapacitet Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Mäta mRNA nivåer över tid under den jäst S. cerevisiae hypoxisk svar

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidiga Video-EEG-EKG-övervakning för att identifiera Neurocardiac dysfunktion i musmodeller av epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down förfarande att identifiera RNA mål av en lång icke-kodande RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cell baserat analyser av SINEUP icke-kodande RNAs som specifikt kan förbättra mRNA Översättning

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...