Name: biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Bu eser kısmen ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe DA037779 (için J.P.), tarafından desteklenen DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 ve MD007586 (CD için). Çalışma Ayrıca RCMI Grant G12MD007586 Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975 tarafından desteklenmiştir Meharry Translational Araştırma Merkezi (MeTRC) CTSA vermek (U54 RR026140 NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 NIMHD/NIH üzerinden ve AIDS Tennessee Merkezi Araştırma (P30 AI110527).

1. 3'-biotinylated miRNA transfection
Not: bir steril laminar akış başlık içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>2 mL bir kuyu başına tohum 4 x 105–5 x 105 HEK-293T hücre Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) [DMEM % 10 Fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x kalem-strep antibiyotik ile] tamamlayın. 37 ° C, % 5 CO2 gecede ayarla bir kuluçka hücrelerde kültür.</li>
	<li>Ertesi gün, sağlık ve bağlılık hafif bir mikroskop al...

Hücresel miRNAs mRNA hedefleri tanımlaması düzenleyici işlevleri anlamak için önemlidir. Birkaç hesaplama araçları tohum sıra tamamlayıcılık ve koruma hedef sıraları19,20temel hedeflerini tahmin etmek için istihdam edilmektedir. Bu araçları değerli olmasına rağmen yüksek düzeyde yanlış pozitif ve yanlış negatifleri oluşturabilirsiniz. Bu nedenle, bu tahminler ile onların anılan sıraya göre hedefler27,<...

MikroRNA (miRNAs) küçük olumsuz protein ifade1düzenleyen RNA'ların kodlamayan. MiRNA nın kümeleri aracılığıyla intergenic bölgeler ve intron protein kodlayıcı genlerin2,3içinde en sık genom sahip pek çok bölge yer alır. MiRNAs Biyogenez dahil PRI-miRNAs miRNA kodlama, transkripsiyon genler4. PRI miRNAs sıralı işleme, ilk çekirdeği ve daha sonra tek telli olgun miRNAs4,5oluşturmak için sonra sitoplazmaya geçmesi. Daha sonra olgun miRNAs RNA-induced silencing tesisin (RISC) dahil edilmiştir: hedef tanıma4,5, proteinlerin Argonaute ailesinin bir üyesini içerir bir multimeric protein-RNA kompleksi 6,7. Olgun miRNAs karmaşık RISC ağırlıklı olarak 3' UTR hedef mRNA'ların8,9,10 bağlamak ama de zaman zaman kodlama ve mRNA10,11 5' UTR bölgesinde bağlayabilirsiniz . MiRNA mRNA için bağlama sonuçları translasyonel susturmak12,13,14 ve bazı durumlarda mRNA istikrarsızlık15diziler. Bir tek miRNA birçok mRNA'ların hedefleyebilirsiniz düzenleyici bu moleküller hemen hemen her hücresel sürecine dahil ve çeşitli hastalık koşulları da16,17,18karıştığı olmuştur.
Detaylı anlayış nasıl miRNAs hücresel yolları düzenleyen hedef mRNA'ların tanımlaması gerekir. Birden çok Biyoinformatik platform sözde miRNA:mRNA etkileşimleri19,20tahmin etmek kullanılabilir. Bu tahminler mükemmel Watson-Crick baz miRNA 2 – 8 nükleotit tohum sırasını ve hedef mRNA4,21içinde tamamlayıcı bir dizini arasında eşleşmesi üzerinde güveniyor. Buna ek olarak, bu araçlar miRNA:mRNA çift yönlü ikincil yapısını oluşturmak, bu moleküler etkileşim termodinamik parametreler hesaplamak ve bağlayıcı siteleri korunması hedef fonksiyonel alaka geliştirmek için türler arasında göstermek tahmin. Ne yazık ki, bu araçlar aynı zamanda yanlış pozitif hedeflerin çok yüksek oranda (% ~ 27 – 70)15,22tahmin sınırlaması var. En önemlisi, bu silico platformlar miRNAs kanonik olmayan etkileşimleri onların hedefleri23ile tanımak için başarısız. Bu nedenle, böyle akıllı analizleri kez işlevsel olarak ilgili hedefleri doğrulama için deneysel yöntemler ile birleştirilir.
Birden fazla yaklaşımları deneysel miRNA:mRNA etkileşim doğrulamak için geliştirilmiştir. MiRNA taklit eder kullanarak genetik deneyler sünger ve miRNAs hücre düzeyleri alter inhibitörleri hedef gen ifade24,25,26üzerindeki düzenleyici etkisi için ipuçları sağlayabilir. Ayrıca, muhabir deneyleri 3' UTR bölgesinin hedef mRNA ve miRNA taklit eder içeren bir klonu Co transfection ile alan veya hücrelere inhibitörleri miRNAs26düzenleyici fonksiyonu kanıtı sağlamak. Bu yöntemlerin çoğu, düzenleme, gen ekspresyonu miRNAs tarafından çalışma için çok önemli olmakla birlikte, transfection verimlilik ve pleotropic hücresel miRNA düzeylerindeki değişiklikler etkilerini bu genetik yaklaşımlar23önemli sınırlamaları vardır, 26. Bu nedenle, miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim sonda tamamlayıcı biyokimyasal yöntemleri miRNAs hücresel fonksiyonun daha iyi anlamak için istihdam edilmektedir.
MiRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim çalışmaya bir yaygın kullanılan RISC karmaşık ve karmaşık27,28,29,30 içinde mRNA hedef tespiti ve ardından immunoprecipitation yöntemidir . Son zamanlarda, bir Gelişmiş RISC tuzak Yöntemi ayrıca miRNA hedefleri tanımlamak için kullanılmıştır; RISC-miRNA-mRNA ara ürün içinde hedefler istikrar mRNA hedefleri arıtma ile çiftler. Ancak, bu methodsface non-spesifik etkileşim genellikle hücresel kompartmanlarda31,32tarafından ayrılmış RNA ve RNA bağlanıcı proteinler arasında içsel sorunları. Buna ek olarak, bu deneyleri için immunoprecipitation RISC karmaşık33AGO2 protein varlığını bağlıdır. Göz önüne alındığında bu AGO2 verimli miRNA:mRNA etkileşimlerin arabuluculuk sadece argonaute değil, diğer argonautes dışlanması için önyargılı sonuçları34neden olabilir. Bu nedenle, alternatif stratejileri miRNA mRNA için doğrudan bağlama çalışmaya ihtiyaç vardır.
Bu raporda, biz bir miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim problama için bir tek adımlı yaklaşım ayrıntılı mRNA. İlk olarak, 3' biotinylated kilitli nükleik asit (LNA) miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected. Sonra miRNA:mRNA cep lysate karmaşık streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanarak yakalanır. Onun tamamlayıcı miRNA bağlı mRNA hedef qPCR kullanarak sayılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line- HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) (1x)</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution (100x)</td>
			<td>Cellgro/Mediatech</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced serum media</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>3198-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liopfectamine 2000 Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen/ Thermofisher</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated hsa-miR-125b</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>339178/ID-27281622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated scrambled control</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>479997-671/ID-714884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase</td>
			<td>Ambion/Thermofisher</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse/DNAse free water</td>
			<td>GIBCO/Thermofisher</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript-Select cDNA synthesis kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-Spin Magnet</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biotin-based pulldown assay to validate mrna targets of cellular mirnas

MikroRNA (miRNAs) bir post-transcriptionally hücresel gen ekspresyonu düzenleyen küçük kodlamayan RNA'ların sınıfıdır. MiRNAs bağlama 3' çevrilmeyen bölgesi (UTR) mRNA protein çeviri inhibe veya bazı durumlarda mRNA düşmesine yol için hedef. MiRNA için 3' UTR tarafından 2 – 8 nükleotid tohum dizisi sonunda 5' miRNA aracılı mRNA hedefinin bağlama. Hücresel düzenleyici molekülleri miRNAs rolünü iyi kurulmuş olsa da, fonksiyonel alaka ile hedef mRNA tanımlaması bir meydan okuma olarak kalır. Bioinformatic Araçlar içinde 3' UTR mRNA'ların, dizileri miRNA bağlama için potansiyel hedef olarak tahmin etmek için istihdam edilmiştir. Bu araçlar aynı zamanda işlevsel rolü tahmin etmek için bir girişim böyle dizileri akraba türler arasında evrimsel korunması belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, bu hesaplama yöntemleri kez yanlış pozitif sonuçlar üretmek ve kurallı etkileşim miRNA ve mRNA arasında öngörülen biçilen için sınırlıdır. Bu nedenle, miRNA mRNA hedefine için doğrudan bağlama ölçmek deneysel fonksiyonel etkileşim kurmak için gerekli işlemlerdir. Bu raporda, hücresel miRNA miR-125b ve 3' UTR PARP-1 mRNA arasında doğrudan etkileşim doğrulamak için hassas bir yöntemi açıklanmaktadır. Sentetik biotinylated-miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected ve cep lysate da miRNA-mRNA komplekse streptavidin kaplı manyetik boncuklar ile indirilmiş bir protokol ayrıntılı. Son olarak, hedef mRNA çekti aşağı nükleik asit karmaşık bir qPCR tabanlı strateji kullanarak sayısal.

MiRNAs hedef mRNA'ların bağlama yaparak hücresel işlemleri düzenler. Bu nedenle, tanımlayıcı mRNA miRNA işlevini anlamak için bir anahtar hedefleridir. Burada hücresel miRNA mRNA hedefi tanımlamak için bir yöntem ayrıntılı. Bu iletişim kuralı Wani ve ark. adapte 35 biotinylated LNA tabanlı miRNA taklit eder için açılan kullanarak değişiklik ile mRNA hedef. LNA tabanlı oligonükleotid taklit eder özgüllük hedef bağlama değişt...

Watch this Scientific Journal Video about Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs at JoVE.com

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Eş zamanlı Video-EEG-EKG Neurocardiac disfonksiyon epilepsi fare modelleri tanımlamak için izleme

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...