Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

ونشكر الأعضاء الحالية والسابقة لدينا مجموعات بحثية، ومجموعة إيجكل واريك، على الالتزام والحماس في دراسة إيمونوجينيتيكس في CLL. ونود أيضا أن نعترف بتعاون جميع أعضاء المبادرة إيمجت/CLL-ديسيبل، وعلى الأخص، أستاذ ماري-بول ليفرانك، والدكتور فيرونيك جيوديسيلي، d'Immunogenetique موليكولايري، ليجم، جامعة من مختبر موثوق الثاني مونبلييه، مونبلييه، فرنسا، وإيمجت، نظام المعلومات إيمونوجينيتيكس الدولية، لما هائلة الدعم والمساعدة في تحليل التسلسل الجيني IG. هذا العمل كان دعما جزئيا من المنح المقدمة من ترانسكان-179 رواية سولهيم عام 2016؛ الإيطالية رابطة كل البحوث لوس أنجليس سول التحكيمية كانكرو (المحقق منحة #20246 وخاصة برنامج الجزيئية السريرية الأورام-5 كل ميل #9965)، ميلانو، إيطاليا؛ Progetti di ريليفانتي إينتيريسي Nazionale (الرتب) #2015ZMRFEA، وزارة، روما، إيطاليا؛ جمعية السرطان السويدية ومجلس البحوث السويدية، كنوت ومؤسسة والنبرغ أليس، معهد كارولينسكا، جامعة أوبسالا، مستشفى جامعة أوبسالا والأسد في مؤسسة أبحاث السرطان، أوبسالا؛ برنامج اوديسيوس، المنفذة في إطار "العمل للاستراتيجية على البحوث والتكنولوجية قطاع التنمية"، الممولة من البرنامج التشغيلي "القدرة التنافسية وتنظيم المشاريع والابتكار" (نسرف 2014-2020) وشاركت في تمويله اليونان و الاتحاد الأوروبي (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية).

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).</li><li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+where+do+we+stand+how+do+we+proceed?.">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?.</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li><li>Sutton, L. A., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+between+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+factors+driving+the+evolution+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2015).</li><li>Mina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+prognostic+models+in+CLL+to+personalize+approach+to+clinical+care:+Are+we+there+yet?.">Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?.</a> Blood Reviews. , (2017).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+genes+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+Key+to+understanding+the+disease+and+improving+risk+stratification.">Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification.</a> Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).</li><li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).</li><li>Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmutated+Ig+V(H)+genes+are+associated+with+a+more+aggressive+form+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).</li><li>Burger, J. A., Chiorazzi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).</li><li>Packham, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+proliferation+or+anergy.">The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy.</a> Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).</li><li>Messmer, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+distinct+sets+of+stereotyped+antigen+receptors+indicate+a+role+for+antigen+in+promoting+chronic+lymphocytic+leukemia.">Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).</li><li>Stamatopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+20%+of+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+carry+stereotyped+receptors:+Pathogenetic+implications+and+clinical+correlations.">Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations.</a> Blood. 109 (1), 259-270 (2007).</li><li>Agathangelidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotyped+B-cell+receptors+in+one-third+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+a+molecular+classification+with+implications+for+targeted+therapies.">Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies.</a> Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).</li><li>Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+stereotypy+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).</li><li>Baliakas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+effect+of+stereotyped+B-cell+receptor+immunoglobulins+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+A+retrospective+multicentre+study.">Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study.</a> The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).</li><li>Gounari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+antigen+reactivity+may+underlie,+the+clinical+aggressiveness+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#8.">Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8.</a> Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).</li><li>Ntoufa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+anergy+modulated+by+TLR1/2+and+the+miR-17+approximately+92+cluster+underlies+the+indolent+clinical+course+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#4.">B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4.</a> Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).</li><li>Mansouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+of+IkappaBepsilon+leads+to+NF-kappaB+deregulation+in+aggressive+chronic+lymphocytic+leukemia.">Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).</li><li>Navrkalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+mutations+in+major+stereotyped+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+enrichment+in+subset+#2+is+associated+with+markedly+short+telomeres.">ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres.</a> Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+molecular+lesions+and+specific+B-cell+receptor+subsets+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors.">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li><li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL:+Updated+results+of+the+CLL8+trial.">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li><li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fludarabine,+cyclophosphamide,+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia.">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+diagnosis,+indications+for+treatment,+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li><li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations:+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936.">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li><li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+family+specific+leader+region+primers+for+PCR+amplification+of+the+human+heavy+chain+variable+region+gene+repertoire.">Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire.</a> Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).</li><li>Rosenquist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+gene+sequence+analysis+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+updated+ERIC+recommendations.">Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations.</a> Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).</li><li>Linke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high+resolution+PCR+fragment+analysis+for+identification+of+clonally+rearranged+immunoglobulin+heavy+chain+genes.">Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes.</a> Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).</li><li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroduplex+analysis+of+VDJ+amplified+segments+from+rearranged+IgH+genes+for+clonality+assessments+in+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.+A+comparison+between+different+strategies.">Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies.</a> Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).</li><li>Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/V-QUEST:+The+highly+customized+and+integrated+system+for+IG+and+TR+standardized+V-J+and+V-D-J+sequence+analysis.">IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).</li><li>Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/JunctionAnalysis:+The+first+tool+for+the+analysis+of+the+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+complex+V-J+and+V-D-J+JUNCTIONs.">IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs.</a> Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).</li><li>Bystry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARResT/AssignSubsets:+A+novel+application+for+robust+subclassification+of+chronic+lymphocytic+leukemia+based+on+B+cell+receptor+IG+stereotypy.">ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).</li><li>Belessi, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGHV+gene+insertions+and+deletions+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+&amp;#34;CLL-biased&amp;#34;+deletions+in+a+subset+of+cases+with+stereotyped+receptors.">IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: &amp;#34;CLL-biased&amp;#34; deletions in a subset of cases with stereotyped receptors.</a> European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).</li><li>Langerak, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+sequence+analysis+and+prognostication+in+CLL:+guidelines+from+the+ERIC+review+board+for+reliable+interpretation+of+problematic+cases.">Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases.</a> Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).</li><li>Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+IGHV+DNA+gene+rearrangements+in+CLL:+Influence+of+mixed-mutated+and+-unmutated+rearrangements+on+outcomes+in+CLL.">Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).</li><li>Farooqui, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+for+previously+untreated+and+relapsed+or+refractory+chronic+lymphocytic+leukaemia+with+TP53+aberrations:+A+phase+2,+single-arm+trial.">Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial.</a> The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).</li><li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia.">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li><li>Burger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+as+initial+therapy+for+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح ذات الصلة بالكشف عن.

دراسة الجينات IG في CLL كان حيويا ليس فقط لتوفير فهم أفضل في المرض بل ولكن أيضا لتحسين التكوين الطبقي خطر المريض. ولذلك فإن من بالغ الأهمية أن يتم تنفيذ الإجراء خطوة متعددة لتحليل التسلسل الجيني IG والتفسير اللاحق لتسلسل البيانات بطريقة موحدة. توافر مواد المريض مناسبة وكافية وتوقيت أخذ العينات ينبغي إلا تؤثر على القدرة على أداء IG الجينات حيث التحليل حيث يمكن إجراء الاختبار في الجريدة الرسمية وعلى أي عينة مع عدد خلايا ورم CLL عالية. فصل خلايا الدم وحيدات النوى باستخدام أساليب الفصل التدرج تتم بشكل روتيني في مختبرات التشخيص، وكما هو الحال دائماً، ينبغي توخي الحذر عند إضافة حل الدم/ربمي للأنبوب الذي يحتوي على التدرج؛ وينبغي أن يكون القيام بهذه المهمة بطريقة بطيئة، ولطيف لتجنب الإخلال بالتدرج والحيلولة دون فقدان الخلايا.
وبعد فصل الخلية، يتم استخراج الأحماض النووية. كلا جدنا وكدنا مناسبة لتحليل SHM لإعادة ترتيب فائق كلونوتيبيك، ومع ذلك، هناك مزايا وعيوب لاستخدام أما المواد. سير عمل المختبرات عائدات أسرع عند استخدام جدنا منذ النسخ العكسي لا يكون أداؤها قبل التضخيم PCR. أن قال، استخدام جدنا الركيزة لبكر قد تؤدي التضخيم من ترتيبات جديدة على حد سواء المنتجة وغير المنتجة التي، بدورها، يمكن أن يؤدي إلى عمل المختبر العملي الإضافية، أي تنقية أو الختان جل من منتجات PCR متعددة وتسلسل الفردية لجميع ترتيبات جديدة. عند مقارنة النهج جدنا وكدنا، لهذا الأخير خطوة نسخ عكسي يجب أن يتم قبل الشروع في [بكر] تضخيم. بيد في هذا المقام، لمعظم الحالات، ترتيبات جديدة IG الإنتاجية فقط سوف يكون تضخيم والتسلسل في وقت لاحق. وهكذا، سيتم تنقية فقط منتج PCR واحد ومتتابعة، بينما يتم تفسير نتائج أكثر وضوحاً.
كفاءة التضخيم يعتمد إلى حد كبير على نوعية جدنا/كدنا، التي ينبغي تقييمها باستخدام أسلوب التقدير الكمي حساسة، والإشعال المستخدمة. الإشعال المستخدمة ذات الأهمية الحاسمة للإجراءات التحليلية بأكملها لأن يتحقق إلا تحديد دقيق لمستوى SHM بتضخيم تسلسل بأكمله من الجينات إيغف آخر أعيد ترتيبه. ويمكن تقييم إعادة ترتيب كامل طول فقط إذا استخدمت 5 ' إيغف زعيم الإشعال، مما يبرر التوصيات الأخيرة التي إريك للاستخدام لزعيم كبسولة تفجير27. استخدام الإشعال بديلة، مما يؤدي إلى التضخيم لترتيبات جديدة جين إيغف-إيغد-إيغج غير مكتملة، ليست مناسبة لتحليل حيث الجينات إيغف، ومن ثم نصح بقوة ضد. والاستثناء الوحيد يتعلق بالحالات التي تنتج نتائج سلبية مرارا وتكرارا عندما تستخدم كبسولة تفجير الزعيم إيغف وتحليل المواد المريض الجديد هو غير ممكن أو كما يفعل لم تسفر عن نتائج. في حالة استخدام عينة مريض مختلفة و/أو المواد (جدنا/كدنا) والإشعال مختلف مجموعات لا تزال تفشل لإنتاج منتج PCR، الأسباب المحتملة يمكن أن عبء خلية ورم منخفض جداً، أو أن يلاحظ ليس بسبب استنساخ CLL (في هذه الحالة إيمونوفينوتيبي ينبغي أن يكون إعادة تقييم). ينبغي أن يكون ذكر الإشعال المستخدمة في التحليل دائماً في التقرير السريرية.
كما CLL ينتج عن تراكم الخلايا ب [مونوكلونل] مع إعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج نفسه، سيكشف التقييم للغالبية العظمى من الحالات كلوناليتي ذروة [مونوكلونل] فريدة من نوعها، أي استنساخ واحدة. وفي مناسبات نادرة، ضعف ترتيبات جديدة أو حتى oligoclonal أنماط يمكن ملاحظة35. في مثل هذه الحالات، التفريد جل ليست الأسلوب المفضل لتقييم كلوناليتي وينبغي أن تطبق أساليب أكثر حساسية مثل تحليل الشظايا. متى تأكدت كلوناليتي، الخطوة النهائية قبل تسلسل يتعلق بتنقية المنتج PCR لضمان الحصول على تتابعات عالية الجودة. وأخيراً، الأداة إيمجت/V-السعي هو المورد أوصت بتحليل تسلسل IG إريك. قواعد البيانات إيمجت التي يتم تحديثها باستمرار وتقرير النتائج بطريقة مشروحة جيدا ومتسقة، هذه الأداة يضمن تحليل موحد ويسهل تحليل مقارن بين مختلف المرافق السريرية أو الأكاديمي.
تحليل إيمونوجينيتيك في CLL التنبؤات، وعلى وجه الخصوص، النمطية التنبؤية الآثار، تحليل قوية لإعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج بما في ذلك الإحالة إلى CLL الرئيسية لمجموعات فرعية، لم يعد فقط مرغوب فيه ولكن ذات أهمية رئيسية. وهذا واضح بصورة خاصة في هذه الحقبة من رواية المداواة والإمكانات التي قد IG التحليل الجيني لتوجيه العلاج المقررات5،21،،من2223،36،37 ،38، رسميا كما يتبين من التحديث الأخير للمبادئ التوجيهية التي ترعاها لجنة التحقيق الوطنية من "حلقة العمل الدولية" شأن CLL24. أن هناك ما يبرر معايير صارمة، وقال، لا سيما وأن تحديد المركز SHM كلونوتيبيك ترتيب الجينات إيغف في CLL المرضى ليس مسألة تافهة، وينطوي على عملية متعددة الخطوات. الأهم من ذلك، بعض الخطوات التجريبية، أبرزها اختيار الإشعال، تسفر عن نتائج متفوقة عند خيارات محددة و/أو النهج هي ملتزمة، جوانب فنية أخرى قابلة لدرجة ما من المرونة، مثل اختيار المواد أو أسلوب لتقييم كلوناليتي، يرجع ذلك إلى حقيقة أن تؤدي إلى الفروق الدقيقة، أن وجدت، فيما يتعلق بالنتائج النهائية.
على مدى العقد الماضي، سعت إريك للترويج لتوحيد وتنسيق مختلف أساليب ذات الصلة لتشخيص CLL ومنذرة. ويتجلى في نشر توصيات ومبادئ توجيهية لتحليل إيمونوجينيتيك27،34، نظمت العديد من حلقات العمل التعليمية والأحداث، وإنشاء شبكة للمفتش العام، فضلا عن منتدى على إنترنت لخبراء إلى مناقشة وتقديم التوجيه بشأن تفسير التسلسل الجيني IG في CLL. والهدف العام لاريك من خلال هذه الإجراءات تعزيز الإدارة السريرية المثلى والعناية بالمرضى. وعلى الرغم من الجهود المكثفة، هذه المهمة بعيدة عن الاكتمال، وأصبحت في الواقع أكثر تعقيداً نظراً لوضع التسلسل الفائق رواية تهدف إلى التنميط المناعي. ومع ذلك، على الرغم من أن التحديات ما زالت قائمة، جهودا مكثفة لتوحيد قوي لتحليل الجينات IG في CLL مواصلة وحاليا تركز الأنشطة الجارية داخل إريك.

الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، الشكل الأكثر شيوعاً لسرطان الدم لدى البالغين في البلدان الغربية، ويتسم بالتوسع في الاستنساخ ناضجة الورم خلايا ب1. من وجهة نظر سريرية، مسار المرض متغير جداً مع بعض المرضى تعاني من مرض عدوانية، التي تتطلب العلاج في وقت مبكر جداً بعد التشخيص، وغالباً ما الانتكاس أو يجري تعدينها للعلاج. وهذا في تناقض صارخ مع نسبة كبيرة من المرضى (~ 30 ٪) الذي يقدم مع مرض كسول، ابدأ يحتاجون إلى علاج، ويكون متوسط العمر المتوقع مماثلة للأشخاص الأصحاء مطابقة سن2. وينعكس هذا التغايرية السريرية في تنوع شذوذ الجزيئية التي وجدت في CLL المرضى التي تدفع في نهاية المطاف المرضية وتطور هذا المرض3.
وضع تشخيص دقيق CLL بسيط عادة، بيد أن التغايرية السريرية المذكورة آنفا قد تعوق الإدارة الفعالة للمرضى CLL ويؤكد الحاجة إلى علامات تشخيصية والتنبؤيه التي يمكن أن تساعد في العلاج صنع القرار2. وحاولت العديد من الدراسات صقل منذرة CLL، بلغت ذروتها في وفرة علامات سريرية وبيولوجية رواية يجري المقترحة4. حيث وضع الجين المتغير الثقيلة (إيغف) غلوبيولين مناعي كلونوتيبيك واحد من أقوى علامات تشخيصية في CLL، إلى حد كبير يرجع ذلك إلى حقيقة أن (ط) لا تزال مستقرة على مر الزمن، ومع تقدم المرض، و (الثاني) مستقل عن الآخر 5من المعلمات السريرية والبيولوجية. أنه على الرغم من ذلك، علامات قليلة جداً، أن وجدت، بما في ذلك حالة حيث إيغف، تطبيق حاليا في السريرية الروتينية في وقت التشخيص.
التقارير الأولية بشأن فائدة سريرية للتسلسل الجيني IG في CLL ترجع إلى عام 1999، عندما أفادت دراسات مستقلة 2 أن المرضى الذين يعانون من لا أو حمولة هايبرموتيشن جسدية الحد أدنى (SHM) (CLL أونموتاتيد، يو-CLL) يكون تشخيص أسوأ من المرضى تحمل ارتفاع عبء SHM (تحور CLL، M-CLL)6،7. وبشكل أكثر تحديداً، تالف الفريق يو-CLL الحالات التي تأوي جينات إيغف كلونوتيبيك مع SHM قليلة أو لا ومن ثم هوية النسبة مئوية مرتفعة للجينات إيغف الخط الأقرب (إيه ناين إيت %)، تكونت من الحالات مع حمولة أعلى حيث M-CLL (الهوية نسبة إلى جين إيغف الخط الأقرب < 98 ٪). منذ هذه الدراسات المبكرة، باستمرار ثبت أن حالات يو-CLL عرض أقصر وقت لأول العلاج (تفت) وبقاء الشاملة (نظام التشغيل) بالمقارنة مع M-CLL.
في وقوعه، أبرزت هذه الدراسات المنوي الدور المحوري لمستقبلات الخلية ب (المركز) المفتش العام في بل CLL، مما يمهد السبيل لبحوث مستفيضة في التفاعلات CLL-ميكرونفيرونمينتال الذي، بدوره، أدى إلى فهم أكثر شمولاً عدم تجانس البيولوجي لهذا المرض8،9. مزيد من الدراسات الأخيرة قد قدمت دعما إضافيا لأهمية تحليل إيمونوجينيتيك في CLL بالكشف عن أن حالات فردية قد الكتلة في مجموعات فرعية بسبب مشاركة (شبه) تسلسل الجين IG المركز متطابقة، ووصف ظاهرة IG بنك ستيريوتيبي10 11، ،،من1213. تتراكم الأدلة تؤيد الفكرة أن المرضى الذين تم تعيينها إلى نفس نمطية فرعية ميناء كلينيكوبيولوجيكال خصائص مشابهة بوضوح فصلها عن المرضى CLL الأخرى ضمن نفس فئة SHM ولكن مع تسلسل الجين IG مختلفة؛ وفي الواقع أبلغ أن تصنيف المرضى CLL استناداً إلى stereotypy IG المركز كذلك تهذب الفصل الجزء الأكبر من المرضى CLL في يو-CLL أو M-CLL مجموعات14،،من1516، 17 , 18 , 19 , 20.
من وجهة نظر سريرية، جدير بالذكر أن حالة SHM الجين إيغف كلونوتيبيك ويبدو أن ترتبط برد محدد على تشمويمونوثيرابي. في خاص، M-CLL المرضى تعامل مع مزيج من فلودارابيني/السيكلوفوسفاميد/rituximab (FCR)، أظهرت معاملة معيار الذهب للمرضى CLL طبيا مناسباً تفتقر إلى عيوب الجين TP53 ، لم يعد إلى حد كبير خالية من التقدم البقاء على قيد الحياة (PFS) ونظام التشغيل بالمقارنة مع يو-CLL المرضى الذين تلقوا نفس المعاملة21،،من2223. ولذلك، تحديد حالة SHM أصبحت مهمة خاصة للمساعدة في إدارة العلاجية CLL المرضى أي علامة تنبؤية، بدلاً من تقييم مسار السريرية المرض أي علامة تشخيصية. في الواقع، وفقا للتحديث الأخير للمبادئ التوجيهية التي ترعاها لجنة التحقيق الوطنية من "حلقة العمل الدولية" شأن CLL، حالة SHM الجينات إيغف آخر أعيد ترتيبه ينبغي أن تكون مصممة في جميع الحالات CLL قبل بدء العلاج في الممارسة العامة على حد سواء والسريرية 24من المحاكمات. وعلاوة على ذلك، نظراً للموافقة الأخيرة على وكلاء العلاج الرواية، والعدد المتزايد للمخدرات في المحاكمات، حالة SHM جزيء IG قد تلعب دوراً أكبر في الإدارة العلاجية للمرضى الذين يعانون من CLL في المستقبل القريب5.
يتضمن هذا التقرير تفاصيل جميع جوانب تحليل تسلسل الجين المفتش العام، بدءاً باختيار المواد المناسبة، وبلغت ذروتها مع تفسير تسلسل النتائج السريرية. من المهم إجراء تقييم متعمق لهذه الخطوات في التشخيص الروتيني لإنتاج نتائج موثوق بها وضمان دقة الطبقية المرضى في التجارب السريرية. يتم توفير بروتوكولات للمساعدة في تنسيق تحليل تسلسل الجين المفتش العام، وبالتالي ضمان أن النتائج قابلة للمقارنة بين المختبرات المختلفة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

أثناء نضج الخلية ب، يقترن عملية معقدة من الغلوبولين المناعي (IG) الجين الخامس (د) ي التثب تثير هايبرموتيشن جسدية (SHM) تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها داخل كل خلية بالفرديه. منذ الخلية بالاورام الخبيثة نتيجة للتوسع في الاستنساخ من خلية واحدة، تمثل الجينات IG توقيع فريد جزيئية مشتركة لكافة الخلايا الخبيثة داخل مريض فردية؛ وهكذا، يمكن استخدام IG الجينات ترتيبات جديدة كعلامات للاستنساخ. بالإضافة إلى خدمة كمعرّف الاستنساخ هامة، يمكن أن تعمل بالتسلسل الجيني IG زمني جزيئية نظراً لأنه يرتبط بمراحل تنموية محددة ومن ثم يعكس تاريخ الخلية بالمشاركه في التحول الورمية. وعلاوة على ذلك، لبعض الأورام الخبيثة، خاصة سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، التسلسل الجيني IG يحمل قدرات تشخيصية ويحتمل أن تكون تنبؤية. وقال أن استقراء استنتاجات ذات معنى من تحليل التسلسل الجيني IG سيكون مستحيلاً إذا أدوات وأساليب قوية لم تكن متاحة للمساعدة في التحليل. هذا المقال، استناداً إلى الخبرة الواسعة "المبادرة الأوروبية من البحوث" في CLL (إريك)، وتفاصيل الجوانب التقنية والمتطلبات الأساسية اللازمة لضمان موثوق بها واستنساخه IG تسلسل الجين التحليل في CLL، اختبار أن ينصح الآن لجميع المرضى CLL قبل المعالجة. وبشكل أكثر تحديداً، وصف مختلف مراحل تحليلية تتراوح بين تحديد إعادة ترتيب الجينات IG كلونوتيبيك وتحديد تسلسل النوكليوتيدات لتفسير البيانات التسلسل الجيني IG سريرية دقيقة.

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

وهنا، فإننا نقدم بروتوكول تفاصيل الجوانب التقنية ومتطلبات أساسية لضمان تحليل تسلسل الجين IG قوية في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، استناداً إلى الخبرة المتراكمة للمبادرة "الأوروبية للبحث" في CLL (إريك).

غلوبيولين مناعي تحليل تسلسل الجين في اللوكيميا اللمفاوية المزمنة: من المواد المريض إلى تفسير التسلسل

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال سرطان الدم الليمفاوي المزمن، مثل التشخيص الدقيق للمرضى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وسريعة ودقيقة للغاية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التكهن القوي ، وعلى الأخص شهادات المخاطر مع المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي المزمن لأن التكهن الدقيق قد يحدد لاحقًا الإدارة العلاجية للمرض.العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية، مثل تحديد منتج PCR و أنواع تحليل التسلسل الهضمي يصعب تعلمها لأنها تتطلب الدقة والخبرة. لبدء هذا الإجراء، إضافة 200 ميكرولترات من EDTA إلى أنبوب جمع معقم 50 ملليلتر. إضافة 20 ملليلتر من الدم المحيطي و 15 ملليلتر من 15 ملم من دورة في الدقيقة المتوسطة إلى أنبوب وماصة صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات لخلط.بعد ذلك، إضافة 15 ملليلتر من متوسطة التدرج كثافة إلى أنبوب جمع 50 ملليلتر جديدة. طبقة ببطء حل الدم المحيطي على متوسط التدرج الكثافة، والتأكد من أنه لا يعطل التدرج. جهاز طرد مركزي في 800 مرة G لمدة 20 دقيقة مع الفرامل الطرد المركزي قبالة.ثم استخدم ماصة باستور العقيمة لجمع حلقة الخلية أحادية النواة التي تشكلت بين طبقة الصفائح الدموية البلازما العليا وطبقة متوسطة متدرجة الكثافة ونقلها إلى أنبوب جمع جديد معقم 15 ملليلتر. إضافة متوسطة RPMI بحيث يكون حجم النهائي هو 12 ملليلتر وماصة الحل صعودا وهبوطا لخلط. جهاز طرد مركزي في 800 مرة G لمدة ثماني دقائق.تجاهل افراط وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 10 ملليلتر من متوسطة RPMI. جهاز طرد مركزي مرة أخرى في 750 مرة G لمدة ثماني دقائق. بعد هذا، تجاهل افراة وحل بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.باستخدام لوحة باور جديدة، تشكيل عدد الخلايا عن طريق خلط 20 ميكرولترات من العينة و 80 ميكرولترات من واحد إلى 10 حل الترك. وإذا لم يتم جدولة معالجة العينة في نفس اليوم، فإن الطرد المركزي العينة بمعدل 750 مرة من G لمدة ثماني دقائق. تجاهل المابير وتخزين بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية.أولاً، إعداد المزيج التمهيدي باستخدام كميات متساوية من كل التمهيدي المجموعة الفرعية لضمان تضخيم غير متحيزة. امزج الكواشف PCR كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول النص. إضافة 0.5 ميكرولتررس من البوليميراز TAP إلى أنبوب PCR تحتوي على الكواشف PCR مختلطة.ثم، إضافة إما 100 نانوغرام من gDNA أو اثنين من ميكرولترات من cDNA. تشغيل بروتوكول PCR الحرارية كما هو مفصل في الجدول الثالث من بروتوكول النص. بعد ذلك، تحقق من منتجات PCR من أزواج قاعدة 500 تقريبا عند استخدام التمهيدي لتر IGHV أو 350 أزواج قاعدة عند استخدام يمزج التمهيدي IGHPFR1.لبدء تنقية المنتج PCR، تحميل الحجم الإجمالي للمنتج PCR على هلام agarose منخفضة ذوبان ثلاثة في المئة. السماح للمنتجات PCR لتشغيل على هلام حتى أنها منفصلة عن الخلفية. استخراج عصابات PCR بارزة حادة ومن ثم تنقية و elute لهم.إذا تم الكشف عن إعادة ترتيب اثنين، يجب أن يتم استئصال كلا النطاقين وتسلسلهما بشكل منفصل. لتنفيذ تنظيف exo-sap، اتبع إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بالأحجام المحددة التي سيتم استخدامها. دوامة بلطف كل عينة لخلط واحتضان لهم على كتلة PCR في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.تعطيل الانزيمات عن طريق تسخينها إلى 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تحميل كمية صغيرة من منتجات PCR على هلام agarose ثلاثة في المئة لتقييم نقاء المنتج. آخر نقطة تفتيش قبل التسلسل هو تحديد التخفي للعينة باستخدام تحليل الشظايا.لبدء تحليل التسلسل، ابدأ تشغيل البرنامج المناسب. حدد الأنواع، مثل الإنسان العاقل، ونوع المستقبلات أو المكان. قم بتسريع التسلسلات التي سيتم تحليلها بتنسيق fasta وتضمينها المعرفات في ناحية النص على دفعات تصل إلى 50 تسلسلًا لكل تشغيل.ثم اختر أحد خيارات العرض الثلاثة التالية للنتائج. عرض مفصل: اختر هذا الخيار من أجل الحصول على النتائج لكل تسلسل على حدة. عرض توليفي:اختر هذا الخيار لتجميع جدول ملخص مرتبة بواسطة الجين IGHV واسم آليل أو حسب ترتيب إدخال التسلسل.يوفر هذا الخيار أيضًا محاذاة التسلسلات التي يتم تعيينها في أي دفعة تم إرسالها إلى نفس الجين IGHV و allele، وأخيراً، ملف Excel. اختر هذا الخيار لتوفير كافة ملفات الإخراج كجداول بيانات مدمجة في ملف واحد. فقط استخدام التمهيدي لتر IGHV تمكن من تضخيم كامل طول IGHV إعادة ترتيبها، مما يسمح بتحميل HSM الحقيقي لتحديد.المنتج PCR المتوقع هو أزواج قاعدة 500 تقريباً. في حالات نادرة حيث IGHV لتر التمهيدي لا يمكن تضخيم إعادة ترتيب IG clonotypic، يمكن استخدام التمهيديات IGHBFR1. المنتج PCR المتوقع هو أزواج قاعدة 350 تقريباً.ثم يتم تحليل التسلسلات التي تم الحصول عليها باستخدام أداة IMG TV Quest. يوضح الصف الأول في جدول النتائج وظيفة التسلسل، حيث يمكن أن يكون تسلسل IG الذي تم إعادة ترتيبه إما منتجًا أو غير منتج. إعادة ترتيب جين IGH غير منتجة هو توقف codons موجودة داخل منطقة VDJ و / أو إذا كان إعادة الترتيب خارج الإطار بسبب عمليات الإدراج / الحذف.ومن المهم ملاحظة أنه ينبغي إجراء مزيد من التحليل فقط على عمليات إعادة الترتيب الإنتاجية وبالتالي الوظيفية. عند استخدام الافتراضي IMG TV كويست المعلمات، لا يتم الكشف عن الإدراجات والحذف تلقائيا، ولكن المؤشرات القوية التي قد تحمل تسلسل هذه التعديلات يتم توفيرها من قبل الأداة، ويظهر تنبيه تحذير أسفل الجدول ملخص النتيجة. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الأرض منتجات PCR على هلام طويلة بما فيه الكفاية بحيث يمكن تمييز السندات التخفي من خلفية polyclonal.بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة المناعية لسرطان الدم الليمفاوي المزمن لاستكشاف التأثير التنبؤي لحالة التبدل الجسدي في المرضى. لا تنس أن العمل مع بروميد اليثيوم يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل العمل تحت غطاء محرك السيارة في جميع الأوقات دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لتحديد الجينات المستهدفة NFAT2 الرواية في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

إنشاء وتحليل الأرغن ثلاثيالأبعاد (3D) المستمدة من عينات الانبثاث العظام سرطان البروستاتا المريض وXenografts بهم

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

تجزئه خلايا سرطان الدم اللمفاوية المزمنة الاوليه لرصد الاتجار بالبروتين النووي/الخلوي

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

نهجين تدفق القياسات الخلوية من NKG2D ليغاند الكشف عن السطح لتمييز الخلايا الجذعية من الخلايا الفرعية السائبة في سرطان الدم النخاعي الحاد

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

إنشاء كرويات 3 الأبعاد من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

توليد وزراعة المواد العضوية عالية الجودة المشتقة من سرطان المبيض المصلي

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...