Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
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我们感谢我们的研究小组、igcll 小组和 eric 的现任和前任成员, 感谢他们在研究 cll 中的免疫遗传学方面的承诺和热情。我们还要感谢 IMGT/CLL-DB 倡议的所有成员, 特别是 Marie-Paule lefan 教授和 veronique giudicelli 博士、moleculaire、ligm、uversite 的生物。蒙彼利埃 ii, 蒙彼利埃, 法国, 和 imgt, 国际 immun-genecics 信息系统, 为他们的巨大支持和帮助 ig 基因序列分析。这项工作得到了 transcan-179 n学报2016年赠款的部分支持;意大利语协会 (调查人员赠款 #20246 和特别计划分子临床肿瘤----每英里 5 #9965), 意大利米兰;progetti di rilevante interesse nazionale (prin) #2015ZMRFEA, miur, rome, 意大利;瑞典癌症协会、瑞典研究理事会、克努特和爱丽丝·瓦伦伯格基金会、卡洛林斯卡研究所、乌普萨拉大学、乌普萨拉大学医院和狮子癌症研究基金会乌普萨拉;odysseus 方案, 在 "研究和技术部门战略发展行动" 下实施, 由 "竞争力、创业和创新" 业务方案 (nsrf 2014-2020) 供资, 由希腊和(欧洲区域发展基金)。

研究协议得到了意大利米兰圣拉斐尔科学研究所道德委员会的批准。
1. 材料选择
<ol><li>
起始材料的选择 注: 在大多数情况下, cll 的肿瘤细胞计数在诊断时很高 (& gt;80-90%)。因此, 细胞分选或白血病细胞的富集通常不是必要的。<ol>
<li>如果使用 ig 基因序列分析最常见的材料--外周血 (pb), 则使用10-20 毫升之间的血量。</li>
		<li>或者, 在 cll 细胞负担较低的情况下, 使用 pb 样本或其他组织 (如骨髓 (bm) 或淋巴结 (ln)) 的材料的细胞分类。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
采样时间
	<ol>
<li>由于 ig shm 状态稳定, 采样时间不是至关重要的;也就是说, 避免在某些时期取样, 例如在治疗后或治疗期间, 因为 cll 细胞数量少可能会使分析复杂化, 并导致不可靠的结果。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
材料收集和储存 注: 起始材料的收集和储存在很大程度上取决于材料的选择。<ol>
<li>对于 pb 或 bm 样品, 使用 edta 或 cpt (柠檬酸三吡啶磷酸酯) 收集管, 以防止抑制 pcr 扩增过程;或者, 使用肝素管。</li>
		<li>对于 ln 样本, 采集的选择是细胞悬浮液、新鲜冷冻组织的活检, 或者在极少数情况下, 福尔马林固定石蜡嵌入 (ffpe) 组织。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 密度梯度分离
注: 如果 pb 或 bm 是首选材料, 这是最常见的情况, 建议使用密度梯度分离单核细胞隔离。
<ol><li>在50毫升无菌收集管中加入 200μl edta (0.5 m edta/ph 8.0)。加入20毫升的 pb 和15毫升的 rpmi。通过移液混合 (2-3 倍就足够了)。</li>
	<li>在新的50毫升集料管中加入15毫升密度梯度介质。 注: 如果 pb 体积小于20毫升, 则应相应地修改 rpmi (上一步) 和密度梯度的体积。</li>
	<li>步骤2.1 中的解决方案中的层间较慢, 这样它就不会中断渐变。离心以 800 x 克的速度离心 20分钟, 离心机刹车关闭。</li>
	<li>利用无菌巴斯德移液器收集在上等离子体/血小板层和密度梯度介质层之间形成的单个核细胞环, 然后转移到无菌的15毫升收集管中。</li>
	<li>将 rpmi 添加到12毫升的最终卷和混合。以 750 x g 离心8分钟。放弃上清液。</li>
	<li>使用 rpmi 的10毫升和重复步骤2.5 重新填充细胞颗粒。</li>
	<li>将细胞颗粒溶解在 pbs 的1毫升中 (dpbs, 无钙, 无镁)。使用 neubauer 板进行细胞计数, 方法是混合20μl 的样品和80μl 的 1:10 türk 溶液。</li>
	<li>如果样品的下游处理没有安排在同一天, 离心样品在 750 x g 8分钟。丢弃上清液, 将细胞颗粒存放在-80°c 。</li>
</ol>3. 核酸提取
<ol><li>确定用于分析 ig 基因 shm 状态的底物。基因组 dna (gdna) 是最受欢迎的选择, 因为不需要逆转录酶的步骤;另外, 使用 rna 互补 dna (cdna) 确保了至少在转录水平上, 生产性的、功能性的克隆型 ig 重组是 "受青睐" 的靶点。</li>
	<li>使用众多商业上可获得的适用于 gdna 或总 rna 提取和 cdna 合成的试剂盒之一 (见材料表)。</li>
	<li>使用敏感的核酸定量系统评估 dna 或 rna 的完整性。如果使用 ffpe 材料进行分析, 通过 pcr 扩增已知的家养基因 (如维甲酸受体α (rara)、β-肌动蛋白等) 来评估提取的 gdna/cdna 的质量和数量。</li>
</ol>4. 高级-高线基因重排的扩增和测序
<ol><li>
高 pcr 引物的选择
	<ol>
<li>优选地, 与 hev 亚群特异性 5 ' 引物和 ahj 基因特异性 3 ' 引物 25,26进行多重 pcr。如果结果不是最佳的, 请使用单个 hev 子群特异性引物制备单独的 pcr 混合物。</li>
		<li>使用 5 ' 的引物退火, 无论是位于位于直接位于 ig 重新排列上游的引线区域, 还是在高压基因的编码区域内 (例如框架 1, fr1)。<ol>
<li>使用领先的引物, 允许放大整个重新排列的 av-o意味-h3j 基因序列, 这反过来将使准确估计 shm 水平。因此, eric 在其更新的 ig 基因序列分析指南中推荐了三五领导者引物。</li>
			<li>在引线引物未能放大克隆式 ig 重排的情况下, 请使用 hev fr1 引物。然而, 框架引物并不放大整个克隆 ig 基因重排, 这可能会导致不准确地确定 shm 的水平。对于这种情况, 在临床报告中明确指出, 使用 hnv fr1 引物可能高估了最接近的种系基因的真实百分比身份。</li>
		</ol>
</li>
		<li>对于 3 ' 端, 根据底物的不同, 使用针对 h长官基因的共识引物、强调基因特异性引物的多集合或同位素特异性引物。表1提供了引物序列, 而图 1描述了底漆退火的不同位置。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
高-高高基因重组的 pcr 扩增
	<ol>
<li>使用每个子组底漆的等摩尔量制备引物混合物, 以确保无偏放大。<ol>
<li>例如, 在使用引线引物时, 使用两种不同的引物来放大属于 h耗尽1子组的重新排列。因此, 使用这2引物 (IGHV1L 和 hev1bl) 的数量, 与 hqv4l 相比是一半, 而 hqv4l 是 hqv4 子组重新排列的唯一引物。</li>
			<li>在高级 j1-2 和 stahj4-5 引物的情况下应用相反的方法。由于这些引物针对两个不同的 aj 基因亚群, 与等级 j3 和等级 j6 引物相比, 数量增加了一倍。</li>
			<li>在准备相关的底漆混合物时, 使用表 1确定确切的底漆数量。</li>
		</ol>
</li>
		<li>混合 pcr 试剂, 如表 2所示。在 pcr 管中结合所有 pcr 试剂后, 加入0.5 升的 taq 聚合酶和100纳克的 gdna 或2μl 的 cdna (cdna 应使用1μg 的 rna 制备)。 注: 具有校对活性的 taq 酶并不是必需的, 因为扩增错误率极低, 因此不会影响 shm 的水平。</li>
		<li>运行表 3中详细说明的热 pcr 协议。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
克隆性评估 注: 关键的下一步是评估 pcr 产品的克隆模式。在评估 cll 患者的克隆时, 最常见的发现是单克隆峰带。<ol>
<li>使用灵敏度高的方法, 如片段或异质双工分析, 进行质量评估28,29。</li>
		<li>片段分析<ol>
<li>使用 5 '-标记的强回声引线或 fr1 子组特异性 pcr 引物执行多重 pcr;这将产生可通过毛细管电泳分离的 pcr 产物, 从而允许根据其高压互补度测定区域 3 (cdr3) 长度对 h此刻 pcr 产物进行克隆性评估。</li>
			<li>使用与前面提到的相同的引物、试剂和热条件 (见表 1-3)。自定义 5 ' 标签引物是荧光标记寡核苷酸与染料的选择在 5 ' 端。记者染料的例子包括6-fam、hex、ned 或 tet。因此, 需要根据每次反应使用3种不同的染料来进行2种单独的反应。</li>
		</ol>
</li>
		<li>使用 1x tbe 作为运行缓冲液, 在6% 的聚丙烯酰胺凝胶上评估 pcr 产品的大小 (此百分比可获得最佳分辨率)。在 80 v 处运行45分钟。 注: 建议 pcr 产品在凝胶上迁移足够的时间, 以便单克隆样品可以从多克隆背景中分离, dna 大小标记可以充分分离。凝胶的大小和厚度等因素会影响迁移, 因此没有单一的设置 (电压和时间) 可以保证最佳的结果也就是说, 将电压设置为 80 v 45分钟是一个很好的起点, 因为它将样品迁移的风险也降到了最低。迅速和 "运行" 的凝胶。</li>
		<li>在使用 hev fr1 引物混合物时, 在使用 hev 引线引物和350个碱基对时, 检查大约500个碱基对的 pcr 产品。 注: 在极少数情况下, cll 病例被发现携带双单克隆产品, 在更罕见的情况下, 案例可能表现为寡克隆模式。一种插层剂, 如溴化乙酯 (etbr) 或危险性较小、商业上可用的 dna 污渍更敏感, 可用于利用紫外线激发或蓝光对丙烯酰胺凝胶的 dna 进行可视化。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
pcr 产品纯化 注: pcr 产品经过纯化, 可去除 cll 样品中来自正常 b 细胞的任何多克隆背景, 以及可能导致次优测序的引物二聚体。使用任何去除未合并的 dntp 和引物进行 pcr 清理的方法, 例如酶处理,例如, sap (虾碱性磷酸酶)/re弗 (acretracex i) 或柱状纯化。<ol>
<li>将 pcr 产物的总体积加载到3% 的低熔融琼脂糖凝胶上。</li>
		<li>允许 pcr 产品在凝胶上运行, 直到它们与背景分离。</li>
		<li>消费锐利、突出的 pcr 带, 净化和洗脱。如果检测到两个重新排列, 应分别切除和排序两个波段。</li>
		<li>若要执行 sapsp. exo 清理, 请按照制造商关于要使用的特定卷的说明进行操作;然而典型的反应可能包含 1μl sap, 0。每 5-10μl pcr 反应, 5μl exo 和 2μl 5 个培养缓冲液。将每个样品轻轻涡流化, 在37°c 的 pcr 块上孵育30分钟。通过加热到 85°c 15分钟来灭活酶。</li>
		<li>在3% 琼脂糖凝胶上装入少量 pcr 产品, 以评估产品的纯度。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 桑格测序
注: 存在几种排序策略, 但是, 无论确切的方法如何, 直接测序两个方面是强制性的, 以确保可靠的结果。
<ol><li>
一般测序协议
	<ol>
<li>如果使用单个引物进行了扩增, 请使用适当的高、高或恒定区域特定引物进行排序。如果使用了多路复用荧光标记引物, 并且使用片段分析对 pcr 产品进行了评估 (不应标记测序引物), 也可以采用这种方法。</li>
		<li>如果使用了多路复用引物, 并在凝胶上进行了克隆性评估, 则在测序的第一步使用下游引物, 例如, 一个共识的 glsj 引物, 序列为 5 '-gggggggggcccccccgg-3 '。或者, 如果使用 cdna 作为底物, 则可以使用 ch 底漆。接下来, 在第二个测序步骤中使用特定于子组的捕食者领导或 fr1 引物。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
排序协议示例 注: 存在多个排序协议, 下面详细介绍了一个示例协议。<ol>
<li>将33纳克的 pcr 产物稀释, 总体积为 11.5μl,例如使用无菌水。通过加热到 95°c 5分钟, 使 pcr 产物变性。立即在冰上放置 10分钟, 以防止形成二级结构。</li>
		<li>将8μl 的主混合物与0.5 微米 (对应于 5 pmol) 的底漆一起加入每个管。</li>
		<li>作为对照, 准备一根含有8μl 主混合、0.5μl puc18 控制模板、2μl (-) 47 测序引物和9.5 μl 无菌水的试管。每个管的最终总体积应为20μl。</li>
		<li>如表 4所示, 在测序反应中使用热循环条件。</li>
		<li>通过混合2μl 醋酸钠 3m (ph 5.2)、2μl edta 100 mm (ph 值 8.0) 和1μl 糖原 (浓度为 20 mg/ml), 准备停止溶液, 然后在每个样品中加入5μl。将产品转移到新的微离心管。</li>
		<li>加入60μl 的100% 乙醇 (-20°c), 轻轻混合。以 14, 000 转/分的速度离心 15分钟 (4°c)。放弃上清液。</li>
		<li>加入100μl 的70% 乙醇 (-20°c), 然后轻轻混合。以 14, 000 转/分的速度离心 10分钟 (4°c)。放弃上清液。重复一次。</li>
		<li>在室温下将颗粒擦干90分钟。在每个样品中加入40μl 十二烷基硫酸钠 (sds) 溶液。</li>
		<li>将样品转移到测序板, 盖上带带盖或胶带密封件, 加载到机器上并执行 sanger 测序。测序板通常是一个96孔, v-底部, 全裙 pcr 板兼容的测序器。这些板可以根据测序是在内部、商业公司还是在学术测序中心/平台上进行而条形码。</li>
	</ol>
</li>
	<li>测序后, "缝合" 从单个测序步骤生成的2个读数, 形成一个完整的 hov 基因重排,即共识序列。</li>
</ol>6. 序列分析
注: 以下各节重点介绍从 imgtv-quest 工具30中获得的输出, 在分析重新排列的 ig 序列和 imgt/juncti想象31时, 这两个序列都与临床报告和研究特别相关研究。imgtv-quest 是一种对齐工具, 用于将用户提交的 ig 序列与 imgt 参考目录集 30进行比较。工具输出包括多个部分, 用户可以在其中定义某些参数。
<ol><li>指定物种,例如智人(人) 和受体类型或位点 (例如high、igk 或 igl)。</li>
	<li>将要分析的序列 (以 fasta 格式并包括标题) 粘贴到文本区域 (每次运行最多50个序列)。或者, 提供一个选项来输入包含 fasta 序列的本地文件的路径。</li>
	<li>为结果选择以下3个显示选项之一:<ol>
<li>详细视图: 选择此选项, 以便分别获取每个序列的结果。</li>
		<li>综合视图: 选择此选项可按 h五基因和等位基因名称或按序列输入顺序排列一个汇总表。此选项还提供了序列的对齐方式, 在任何提交的批次中, 这些序列都被分配给相同的 hav 基因和等位基因。</li>
		<li>excel 文件: 选择此选项可将所有输出文件作为包含在单个文件中的电子表格提供。所有查看选项都有大量基本参数和高级参数可供选择, 但下面的 "代表性结果" 部分只讨论了与 cll ig 序列分析最相关的因素。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. arrest/断言子集工具
<ol><li>若要调查 cll 中的 bcr ig 定型性 (下面的 "代表性结果" 部分提供的其他详细信息), 请将高级 afasta 序列提交给 arrest/任务子集工具 32。该工具报告分配到主要的 cll 定型子集。子集分配工具和详细说明可在 arrest/assignset 网站32和服务选项卡下的 eric 网站上找到。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).</li><li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+where+do+we+stand+how+do+we+proceed?.">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?.</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li><li>Sutton, L. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+distinct+sets+of+stereotyped+antigen+receptors+indicate+a+role+for+antigen+in+promoting+chronic+lymphocytic+leukemia.">Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).</li><li>Stamatopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+20%+of+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+carry+stereotyped+receptors:+Pathogenetic+implications+and+clinical+correlations.">Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations.</a> Blood. 109 (1), 259-270 (2007).</li><li>Agathangelidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotyped+B-cell+receptors+in+one-third+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+a+molecular+classification+with+implications+for+targeted+therapies.">Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies.</a> Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).</li><li>Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+stereotypy+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).</li><li>Baliakas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+effect+of+stereotyped+B-cell+receptor+immunoglobulins+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+A+retrospective+multicentre+study.">Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study.</a> The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).</li><li>Gounari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+antigen+reactivity+may+underlie,+the+clinical+aggressiveness+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#8.">Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8.</a> Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).</li><li>Ntoufa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+anergy+modulated+by+TLR1/2+and+the+miR-17+approximately+92+cluster+underlies+the+indolent+clinical+course+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#4.">B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4.</a> Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).</li><li>Mansouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+of+IkappaBepsilon+leads+to+NF-kappaB+deregulation+in+aggressive+chronic+lymphocytic+leukemia.">Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).</li><li>Navrkalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+mutations+in+major+stereotyped+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+enrichment+in+subset+#2+is+associated+with+markedly+short+telomeres.">ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres.</a> Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+molecular+lesions+and+specific+B-cell+receptor+subsets+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors.">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li><li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL:+Updated+results+of+the+CLL8+trial.">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li><li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fludarabine,+cyclophosphamide,+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia.">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+diagnosis,+indications+for+treatment,+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li><li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations:+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936.">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li><li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+family+specific+leader+region+primers+for+PCR+amplification+of+the+human+heavy+chain+variable+region+gene+repertoire.">Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire.</a> Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).</li><li>Rosenquist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+gene+sequence+analysis+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+updated+ERIC+recommendations.">Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations.</a> Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).</li><li>Linke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high+resolution+PCR+fragment+analysis+for+identification+of+clonally+rearranged+immunoglobulin+heavy+chain+genes.">Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes.</a> Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).</li><li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroduplex+analysis+of+VDJ+amplified+segments+from+rearranged+IgH+genes+for+clonality+assessments+in+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.+A+comparison+between+different+strategies.">Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies.</a> Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).</li><li>Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/V-QUEST:+The+highly+customized+and+integrated+system+for+IG+and+TR+standardized+V-J+and+V-D-J+sequence+analysis.">IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).</li><li>Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/JunctionAnalysis:+The+first+tool+for+the+analysis+of+the+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+complex+V-J+and+V-D-J+JUNCTIONs.">IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs.</a> Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).</li><li>Bystry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARResT/AssignSubsets:+A+novel+application+for+robust+subclassification+of+chronic+lymphocytic+leukemia+based+on+B+cell+receptor+IG+stereotypy.">ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).</li><li>Belessi, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGHV+gene+insertions+and+deletions+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+&amp;#34;CLL-biased&amp;#34;+deletions+in+a+subset+of+cases+with+stereotyped+receptors.">IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: &amp;#34;CLL-biased&amp;#34; deletions in a subset of cases with stereotyped receptors.</a> European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).</li><li>Langerak, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+sequence+analysis+and+prognostication+in+CLL:+guidelines+from+the+ERIC+review+board+for+reliable+interpretation+of+problematic+cases.">Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases.</a> Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).</li><li>Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+IGHV+DNA+gene+rearrangements+in+CLL:+Influence+of+mixed-mutated+and+-unmutated+rearrangements+on+outcomes+in+CLL.">Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).</li><li>Farooqui, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+for+previously+untreated+and+relapsed+or+refractory+chronic+lymphocytic+leukaemia+with+TP53+aberrations:+A+phase+2,+single-arm+trial.">Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial.</a> The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).</li><li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia.">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li><li>Burger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+as+initial+therapy+for+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).</li></ol>

提交人没有相关的利益冲突可供披露。

对 cll 中 ig 基因的研究不仅对更好地了解疾病病理生物学至关重要, 而且对改善患者风险分层也至关重要。因此, 以标准化的方式进行 ig 基因序列分析和序列数据的后续解释的多步骤过程是至关重要的。是否有合适和足够的病人材料和取样时间不应影响进行 ig 基因突变分析的能力, 因为测试可以在 pb 和任何 cll 肿瘤细胞计数较高的样本上进行。诊断实验室通常采用梯度分离方法分离血液单个核细胞, 在将血液/rpmi 溶液添加到含有梯度的试管时应注意;这项任务应以缓慢、温和的方式执行, 以避免干扰梯度, 防止细胞丢失。
细胞分离后, 提取核酸。gdna 和 cdna 都适用于克隆型高重排的 shm 分析, 但这两种材料的使用都有优点和缺点。当使用 gdna 时, 实验室工作流程进行得更快, 因为在 pcr 扩增之前无需进行逆转录酶链。也就是说, 使用 gdna 作为 pcr 的底物可能会导致生产性和非生产性重组的扩增, 进而导致更多的动手实验室工作,即多个 pcr 产品的纯化或凝胶切除和所有重新安排的个别顺序。在比较 gdna 和 cdna 方法时, 对于后者, 在进行 pcr 扩增之前, 必须执行逆转录酶步骤。然而, 在这种情况下, 在大多数情况下, 只有富有成效的 ig 重新安排才会被放大, 并随后排序。因此, 只有一个 pcr 产品将被纯化和测序, 而结果解释更简单。
扩增的效率在很大程度上取决于 gdna/cdna 的质量, 应使用敏感的定量方法对 gdna 的质量进行评估, 并使用引物。所使用的引物对整个分析过程至关重要, 因为只有通过放大重新排列的 hev 基因的整个序列, 才能准确地确定 shm 水平。只有在使用 5 ' 强的领导者引物的情况下, 才能评估全长重排, 从而证明 eric 最近关于使用引线引物27的建议是合理的。使用替代引物, 导致不完全的 hsv-oqj 基因重组的扩增, 不适合高压基因突变分析, 因此强烈建议不要使用。唯一的例外是在使用 hav 领导者引物和分析新的病人材料要么不可能或也没有产生结果的情况下, 反复产生负面结果的情况。如果使用不同的患者样本和/或材料 (gdna/cdna) 和各种引物集仍然不能产生 pcr 产品, 可能的原因可能是肿瘤细胞负担太低或淋巴细胞增多不是由于 cll 克隆 (在这种情况下,应重新评估免疫表型)。用于分析的引物应始终在临床报告中说明。
由于 cll 是由具有相同高-高-ahj 基因重排的单克隆 b 细胞积累而产生的, 对于绝大多数情况下, 克隆性评估将揭示一个独特的单克隆峰,即单个克隆。在罕见的情况下, 可以观察到双重重新安排, 甚至寡克隆模式35。在这种情况下, 凝胶电泳不是克隆性评估的首选技术, 应采用更敏感的方法, 如片段分析。一旦克隆性得到确认, 测序前的最后一步与 pcr 产品的纯化有关, 以确保获得高质量的序列。最后, imgtv-quest 工具是 eric 对 ig 序列分析的推荐资源。由于 imgt 数据库不断更新, 并以一致和注释良好的方式报告结果, 此工具可确保标准化分析, 并促进不同临床或学术设施之间的比较分析。
由于 cll 中的免疫遗传学分析具有预后, 特别是预测意义, 对高高高高高基因重配 (包括分配给主要 cll 定型子集) 的鲁棒分析已不再是可取的, 而且是至关重要的。这一点在这个新疗法的时代尤为明显, ig 基因分析有可能指导治疗决定5、21、22、23、36、37 38, 最近更新了国家信息通报主办的 cll24国际讲习班的准则, 正式表明了这一点。尽管如此, 严格的标准是必要的, 特别是因为确定 cll 患者的克隆型重组的 hiv 基因的 shm 状态不是一件小事, 涉及一个多步骤的过程。重要的是, 某些实验步骤, 特别是引物的选择, 在坚持特定的选择和方法时, 会产生优越的结果, 其他技术方面也有一定程度的灵活性, 例如材料选择或评估克隆性的方法, 因为它们导致了在最终结果方面的细微差异 (如果有的话)。
在过去的十年里, eric 一直致力于促进与 cll 诊断和预测相关的各种方法的标准化和统一。这反映在已公布的关于免疫遗传分析的建议和准则27、34、许多有组织的教育讲习班和活动、建立 ig 网络以及一个专家在线论坛中。讨论了 ll 中 ig 基因序列解释的问题, 并为其提供了指导。eric 通过这些行动的总体目标是促进最佳的临床管理和患者护理。尽管作出了巨大努力, 但这一任务远未完成, 事实上, 由于开发了旨在进行免疫分析的新型高通量测序, 这项任务已变得更加复杂。然而, 尽管挑战依然存在, 但在 cll 中, ig 基因分析的有力标准化工作仍在继续, 目前是 eric 内部正在进行的活动的重点。

慢性淋巴细胞白血病 (clonal) 是西方国家成人最常见的白血病形式, 其特征是成熟肿瘤b 细胞的克隆扩张1。从临床角度来看, 病情过程千差万别, 一些患者出现了攻击性疾病, 诊断后需要很早就治疗, 往往复发或难以接受治疗。这与相当一部分患有懒散病、从不需要治疗、预期寿命与健康的年龄匹配的人相似的患者(约 30%) 形成鲜明对比。这种临床异质性反映在 cll 患者的分子异常的多样性上, 这些异常最终推动了这种疾病的发病机制和进展。
建立准确的 cll 诊断通常很简单, 但是, 上述临床异质性可能会阻碍 cll 患者的有效管理, 并强调需要能够帮助的预后和预测标记。处理决策2。大量的研究试图完善 cll 的预测, 最终提出了大量的新的临床和生物标志物 4。克隆型免疫球蛋白重变量 (hv) 基因的突变状态是 cll 中最可靠的预后标志物之一, 这主要是由于 (i) 随着时间的推移和疾病的进展, 它保持稳定, (ii) 它独立于其他临床和生物参数5。尽管如此, 在诊断时, 临床常规中目前很少有标记, 包括高压突变状态。
关于 ig 基因测序在 cll 中的临床效用的初步报告, 早在 1999年, 当时有2项独立研究报告说, 没有或最小体细胞超突变 (shm) 负荷 (无突变的 cll, u-cll) 的患者的预后比携带较高的 shm 负担 (突变 cll, m-cll)6,7。更具体地说, u-cll 组由具有很少或没有 shm 的奇型高维基因的病例组成, 因此与最近的胚系 hov 基因 (≥98%) 的同一性较高, 而 m-cll 组由突变负载较高的病例 (与最接近的胚系高压基因 & lt;98%)。自这些早期研究以来, 不断证明 u-cll 病例比 m-cll 显示出更短的首次治疗时间 (ttft) 和整体生存率 (os)。
事后看来, 这些开创性的研究突出了 b 细胞受体 (bcr) ig 在 cll 病理生物学中的关键作用, 从而为广泛研究 cll-微环境相互作用铺平了道路, 进而使人们对 cll-微环境相互作用有了更全面的认识。这种疾病的生物异质性8,9。最近的研究为 rcll 中免疫遗传学分析的重要性提供了额外的支持, 揭示了单个病例可能由于共享 (准) 相同的 bcr ig 基因序列而在子集中聚集, 这种现象被称为 bcr ig 定型. ,11,12,13。越来越多的证据支持这样的观点, 即被分配到同一定型子集的患者具有相似的临床生物学特性, 这些特性清楚地将他们与同一 shm 类别中的其他 cll 患者分开, 但具有不同的 ig 基因序列;确实有报道称, 基于 bcr ig 定型观念的 cll 患者分类进一步细化了 cll 患者的批量分离到 u-cll 组 14,15,16 ,17,18,19,20岁。
从临床角度来看, 值得注意的是, 克隆型 hv 基因的 shm 状态似乎与化疗的特定反应有关。特别是, m-cll 患者结合氟地拉比/环磷磷酰胺/利妥昔单抗 (fcr) 治疗缺乏tp53基因缺陷的临床上适合的 cll 患者, 表现出明显较长的无进展时间。与接受相同治疗的 u-cll 患者 21、22、23 的存活率(pfs) 和 os 率进行比较。因此, 确定 shm 状态已变得特别重要, 特别是在协助 cll 患者的治疗管理,即预测标记, 而不是评估疾病的临床过程,即预后标志物。事实上, 根据最近更新的 nci 赞助的准则从国际研讨会的 cll, 重新安排的 hv 基因的状态应确定在所有 cll 病例之前开始治疗的一般做法和临床试验24。此外, 由于最近批准了新的治疗剂, 以及越来越多的药物在试验中, ig 分子的 shm 状态可能在附近的 cll 患者的治疗管理中发挥更大的作用 5.
本报告详细介绍了 ig 基因序列分析的所有方面, 首先选择适当的材料, 最后对测序结果进行临床解释。对这些步骤进行深入评估对于诊断常规提供可靠的结果和确保临床试验中准确的患者分层非常重要。提供了一些协议, 以帮助统一 ig 基因序列分析, 从而确保结果在不同实验室之间具有可比性。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

在 b 细胞成熟过程中, 免疫球蛋白 (ig) 基因 v (d) j 重组加上体细胞突变 (shm) 的复杂过程在每个细胞中产生了一个独特的 dna 序列。由于 b 细胞恶性肿瘤是单个细胞克隆扩张的结果, ig 基因代表了一个独特的分子特征, 这些特征是单个患者体内所有恶性细胞共有的;因此, ig 基因重排可以作为克隆标记。除了作为一个重要的克隆标识符, ig 基因序列可以作为一个 "分子时间线", 因为它与特定的发展阶段, 从而反映了参与肿瘤转化的 b 细胞的历史。此外, 对于某些恶性肿瘤, 特别是慢性淋巴细胞白血病 (cll), ig 基因序列具有预后和潜在的预测能力。尽管如此, 如果不能获得有力的方法和工具来帮助分析 ig 基因序列分析, 就不可能从 ig 基因序列分析中推断有意义的结论。本文借鉴欧洲 cll (eric) 研究计划的丰富经验, 详细介绍了确保 cll 中可靠和可重复的 ig 基因序列分析所需的技术方面和基本要求, 现在建议进行这一测试所有 cll 患者在治疗前。更具体地说, 描述了各种分析阶段, 从克隆型 ig 基因重排的鉴定和核苷酸序列的测定, 到 ig 基因序列数据的准确临床解释。

下面提供的示例说明了按照上述步骤进行 ig 基因测序分析所获得的结果。虽然 dna 和/或 rna 提取是大多数临床/研究实验室的常规程序, 但第一个关键步骤是使用分光光度计或其他高灵敏度的适当技术检查 gdna 和/或 rna 的质量。下一个关键步骤是克隆型高-高-高高基因重排的 pcr 扩增。如上所述, 只有使用 hov 引线引物才能放大重新排列的 hev 基因序列的全长, 从而能够确定真正的 shm 负载;因此, 三五领导者引物是推荐的引物选择 (图 2)。在极少数情况下, 如果 hev 引线引物不能放大克隆 ig 重排, 则可以使用 hev fr1 引物。如图 3所示, 可以观察到几个 pcr 产物带, 特别是当 gdna 是起始材料时;这些乐队应该切除和单独排序。如果三五领导者和 hev fr1 引物都不能产生结果, 则应使用新的患者样本 (如有可能) 重复分析。排序前的最后一个检查点是使用片段分析确定样本的克隆性 (图 4)。
应使用 imgt只能 v-quest 工具30对获得的序列进行分析。用户选择的参数包括物种、受体类型或位点、插入搜索和删除选项等, 并与分析的序列数一起列出。显示每个 fasta 序列, 用 imgt/v-quest 分析 v-domain 以绿色突出显示。此外, 如果输入序列处于相反的方向 (反义), 程序会自动提供互补的反向序列, 并将其声明在 fasta 序列之上。
结果摘要表直接位于 fasta 序列的正下方, 位于 "详细视图" 结果页面的顶部, 其中包含对 cll 中 ig 基因序列分析的临床报告非常重要的信息。此表的每一行解释如下。
结果摘要.结果表中的第一行说明了输入序列的功能: ig 重新排列的序列可以是高效的, 也可以是非生产性的 (图 5a & amp; 5A)。如果在 v-d-j-区域 (对于 vh) 或 v-j-区域 (对于 vl) 和/或如果重新排列是由于插入/删除而超出帧范围, 则停止密码子是无效果的。当无法确定功能时, 即无法识别高-高 -权时部, 则提供第三个输出;在这种情况下, 结果摘要将改为 "未找到重新排列" 或 "未找到连接点"。必须指出, 只有富有成效的, 因此, 才应进一步分析职能的重新安排。如果唯一扩增的 ig 重排不能起作用 (非生产性或 "未发现重排"), 则应重复 pcr 扩增过程。如果结果仍然是否定的, 则应获得新的患者样本。
v 基因和等位基因.v-gene 和等位基因行表示最接近的种系扩展子基因和等位基因及其对齐分数和百分比标识。如果几个基因和等位基因给出相同的高分, 所有的都被列出。提交序列与最近的 hev 基因和等位基因之间的百分比标识特别重要, 因为它决定了 shm 状态。此值是从 v 型区域的第一个核苷酸计算到 v-区域的 3 ' 端 (不包括 cdr3) 计算的。如果使用 hev fr1 引物, 则应始终删除与引物相对应的序列, 以确保尽可能准确的结果。应当指出, 插入或删除可能会导致低身份百分比 (& lt;85%) (下文将进一步讨论), 如果出现这种情况, "结果摘要" 行中将出现 "警告" 说明, 以提醒用户。
j 基因和等位基因.正如上面描述的 v 基因和等位基因, "j-gene 和等位基因" 行表示最接近的种系称高 j 基因和等位基因及其对齐分数和百分比标识。然而, 由于 ostj 基因相当短, 而且由于外切酶活性, 其 5 ' 端可能已被修剪, 因此该工具还根据连续相同核苷酸的最高数量搜索其他选择。
由 imgtse junic-initiciticedic-ficitedic-–分析.imgtse junction分析的 "d-gene 和等位基因" 表示最接近的种系 ighd 基因和等位基因, 该基因和等位基因具有工具在用户序列中识别的 d-区域阅读框架。imgtn junction 分析31提供了对结点的详细而准确的分析, 并已集成到 imgt/v-quest 工具界面中。该工具管理与 ighd 基因和等位基因鉴定相关的所有方面的困难,即: (一) d-区域的短长度;(ii) 使用2个甚至3个阅读架;(iii) 在基因两端的外伸切酶修剪;和 (iv) 突变的存在。
fr-imgt 长度、cdr-imgt 长度和 aa jaction.此行提供在括号内显示并由点和氨基酸 (aa) 连接点分隔的高压 frs 和 cdr 的长度。连接点的 aa 序列显示 (i) 帧内或帧外重排 (帧外位置由 "#" 符号表示)、(ii) 停止密码子的存在或不存在 (停止密码子由星号 "*" 表示) 和 (iii) 存在或不存在vh cdr3-imgt/c (2d-cys 104) 和 w (j-trp 118) 的锚点。
体细胞多突变主要由单核苷酸变化组成, 然而, 在 v 区内可以观察到少量插入和删除, 尽管频率要低得多,33。使用默认的 imgtv-quest 参数时, 不会自动检测到插入和删除;但是, 强烈的迹象表明, 一个序列可能会携带这样的改变,即低百分比的身份和/或不同的高 vcdr1-imgt 和 cdr2-imgt 长度之间提交的用户序列和最近的种线基因和等位基因, 被检测到工具和警告警报显示在结果摘要表下方 (图 5c)。
imgt 在位于 "显示结果" 部分下方的 "高级参数" 部分提供了一个名为 "搜索插入和删除" 的选项。在出现相关警告的情况下, 建议使用此功能。当检测到插入和删除时, "结果摘要" 部分提供了调查结果的全面细节, 包括 (i) 插入或删除的位置,即vh fr-imgt 或 cdr-imgt;(ii) 插入/删除的核苷酸的数目;(iii) 顺序 (仅适用于插入);(iv) 有否发生框架; 若有, 原因为何; 若否, 原因为何; 若否, 原因为何; 若否, 原因为何？(v) 插入或删除开始的 v 区域密码子项;(vi) 所提交序列中受影响的核苷酸位置 (图 5d)。对于插入, 该工具将从提交的用户序列中删除插入, 然后使用标准的 imgt/v-quest 参数重新分析该序列。如果检测到删除, 该工具将添加以点表示的间隙, 以便在重复分析之前替换已删除的核苷酸。
对于在临床实验室进行的每一次诊断或预后测试, 严格的标准和高水平的重现性至关重要。imgt/quest 输出提供了在 cll 中报告 ig 基因序列分析结果所需的许多信息,即(i) 使用的高级、ighd 和 igh 基因以及等位基因;(ii) 克隆型高-高-高高基基因重组的功能,即重组是有成效的还是非生产性的;与最接近的胚系 hov 基因和等位基因相比, 重新排列的 hov 基因和等位基因的百分比标识。有关在 cll 中的 ig 基因的临床报告的全面细节, 对有问题或技术上具有挑战性的病例的解释, 以及关于准确和稳健地确定 cll 中的强基因 shm 状态的建议, 请向读者提供指导最近更新的 eric 准则和报告27,34。
最后, 由于我们对 cll 中的 bcr ig 陈规定型观念的了解日益增加, 因此建议对 cll 中 ig 基因重组的临床报告提出的另一项建议要求涉及将病例分配给主要的陈规定型子集。现在建议在临床报告中说明分析的生产 hev 基因重排是否可以分配给一个主要的定型子集, 即 #1、#2、#4 或 #812、27。应使用 arrest/assignset 工具 (图 6) 32 执行分配给主要 cll 定型子集的任务.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>5 ' 高压 fr1 引物</td>
			<td colspan="2">底漆序列</td>
			<td>60μl 底漆混合物的数量</td>
		</tr>
<tr>
<td>高级 v1</td>
			<td colspan="2">ggggggctggcctggcgg</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>高级 v2</td>
			<td colspan="2">cggtacactacggtgctgg</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>高级 v3</td>
			<td colspan="2">ggaggggctggggtgctgcg</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>高级 v4</td>
			<td colspan="2">caggggctgggggtggggg</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>高级 v5</td>
			<td colspan="2">ggegggctgtgcctgtgc</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>高级 v6</td>
			<td colspan="2">cagtacctcagcaccagcagcagggagg</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' 特高领导引物</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hqv1l</td>
			<td colspan="2">aaatacacacacacaggactgaggagg</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>hqv1bl</td>
			<td colspan="2">aaatacacacacaggacgaccaggagag (c/a)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>高压2al</td>
			<td colspan="2">aacatccacacacacacacattct (a) ac</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGHV2bL</td>
			<td colspan="2">aaatacacacacacatgattttcac</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3v3al</td>
			<td colspan="2">aaatocacccacatgaggggtggcggaggagggggggc</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3v3bl</td>
			<td colspan="2">aaatacacccacagga (ac/t) t (g/t) (g/t) g (g/a) ct (g/t) (a/t) gc</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGHV4L</td>
			<td colspan="2">aaatacacacacacacacaccctgtgtgtct</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGHV5L</td>
			<td colspan="2">aaatacacccaggggggccagccatc</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGHV6L</td>
			<td colspan="2">aaatacacccatctctctcctctctc</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 ' 初级引物</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>等级 j1-2</td>
			<td colspan="2">tgagaggggaccagggggcc</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>等级3</td>
			<td colspan="2">tgagaggggacacttccc</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>高级 j4-5</td>
			<td colspan="2">tgagaggggacgggtcc</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>等级6</td>
			<td colspan="2">tgagaggggcgggccc</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>表1。克隆型高-高高基基因重排 pcr 扩增的引物序列和数量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>体积 (μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>rb x 10 缓冲区</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>mgcl2 (50 mm)</td>
			<td>3个</td>
		</tr>
<tr>
<td>dntp (10 m屏蔽)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>底漆高级引线/fr1 混合料 (10μm)</td>
			<td>3个</td>
		</tr>
<tr>
<td>底漆的高度混合 (10μm)</td>
			<td>3个</td>
		</tr>
<tr>
<td>h2o</td>
			<td>31。5</td>
		</tr>
<tr>
<td>总成交量</td>
			<td>47。5</td>
		</tr>
</tbody></table>表2。用于克隆型高低基因重排 pcr 扩增的试剂。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>温度</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环编号</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
<tr>
<td>94°c</td>
			<td>5分钟</td>
			<td>1</td>
			<td>聚合酶活化</td>
		</tr>
<tr>
<td>94°c</td>
			<td>1分钟</td>
			<td rowspan="3">39</td>
			<td>变性</td>
		</tr>
<tr>
<td>59°c</td>
			<td>1分钟</td>
			<td>退火</td>
		</tr>
<tr>
<td>72°c</td>
			<td>1.5 分钟</td>
			<td>扩展</td>
		</tr>
<tr>
<td>72°c</td>
			<td>10分钟</td>
			<td>1</td>
			<td>最后的延期</td>
		</tr>
<tr>
<td>18°c</td>
			<td>∞</td>
			<td>1</td>
			<td>保存</td>
		</tr>
</tbody></table>表3。克隆型高-高-高高 j 基因重排 pcr 扩增的热循环条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>温度</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环编号</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
<tr>
<td>94°c</td>
			<td>5分钟</td>
			<td>1</td>
			<td>聚合酶活化</td>
		</tr>
<tr>
<td>96°c</td>
			<td>20秒</td>
			<td rowspan="3">30</td>
			<td>变性</td>
		</tr>
<tr>
<td>50°c</td>
			<td>20秒</td>
			<td>退火</td>
		</tr>
<tr>
<td>60°c</td>
			<td>4分钟</td>
			<td>扩展</td>
		</tr>
<tr>
<td>4°c</td>
			<td>∞</td>
			<td>1</td>
			<td>保存</td>
		</tr>
</tbody></table>表4。ig 基因测序反应的热循环条件。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57787/57787fig1.jpg"> 图1。显示了具有不同引物退火位置的高-aqd-h过来基因重排的原理图.5 ' 高压引物退火到位于高压编码序列上游的引线序列。5 ' 次高压框架 (fr) 引物退火到 fr1 区域的起点, fr1 区域位于重新排列的 hev 基因内, 而 3 ' h3j 引物退火到重新排列的 h球菌基因的末端。utr: 未翻译的区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57787/57787fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57787/57787fig2.jpg"> 图2。利用 5 ' exv 引线引物对7个患者样本的强-ahd-h过来基因重排进行 pcr扩增。第八车道代表一个阳性控制, 而 pcr 的负控制被加载到第九车道。使用 hev 领导者引物时, 预期的 pcr 产品的大小约为500个碱基对。凝胶最后一列中的星号表示 100 bp dna 阶梯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57787/57787fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57787/57787fig3.jpg"> 图3。利用 hev fr1 引物对13个患者样本的高-高-ahj 基因重排进行 pcr 扩增.第十四车道包含正控制, 而负控制被加载到第15车道。如第2车道所示, dna 是其起始材料, 观察到几个 pcr 带, 应分别切除和测序。5号、7号和13号车道上的样品产生了多克隆结果 (通过凝胶中的涂片证明), 因此, pcr 步骤应该重复。如果第二次 pcr 未能扩增重新排列的 ig 基因, 则应在新样本 (如果可能) 或使用不同的引物集进行分析。使用 ev fr1 引物混合物时, 预期的 pcr 产物的大小约为350个碱基对。凝胶最后一列中的星号表示 100 bp dna 阶梯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57787/57787fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57787/57787fig4.jpg"> 图4。利用基因分析对克隆性进行评估.在基因分析中, 单克隆 pcr 产物产生相同尺寸的荧光产物 (上板) 的主要峰值, 而多克隆 pcr 产物则导致产品尺寸的更正常分布 (下面板)。红色的痕迹是荧光标记的 dna 阶梯的峰值, 该端与所分析的样本在相同的毛细血管注射中加载。尺寸标准碎片受到与样品相同的电泳力, 因此暴露在相同的注射条件下。尺寸标准碎片的均匀间距确认了精确的尺寸调用。蓝色痕迹表示样品的单克隆 (顶部面板) 或多克隆 (下面板) 性质。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57787/57787fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57787/57787fig5.jpg"> 图5。imgt/quest 提供的结果汇总表示例.(a)生产高高高高j 基因重排 (无停止密码子) 和帧内序列连接点) 的结果汇总表。在这种情况下, imgtv-quest 在用户序列中识别的 v-gene 和等位基因以及 j-gene 和等位基因是 IGHV4-34*01 和 IGHJ6*02 (根据最高的对位数评估)。由于单个体细胞突变, 身份百分比为99.65。由 imgtse juncic一下识别的 d-gene 和等位基因是阅读框架1中的 IGHD3-3*01。括号中列出了4个框架区域的长度以及确定区域的3个互补性区域。还提供了 hsv-d-j 结的氨基酸 (aa) 序列。在本例中, 该连接点由 22个 a a 组成。(b)高低高高基因重排序列的结果汇总表, 该序列因帧外连接而没有产生。cdr3-imgt 长度的 x 表示无法确定此序列的长度。在 aa 接合处序列中观察到的 "#" 符号表示框架。(c)低 v 区标识 (60.94) 的结果汇总表警告, 并指示应使用 "高级参数" 部分中的 "插入和删除" 选项。(d)使用 "搜索插入和删除" 选项重复序列分析后, 在 (c) 中显示的出现率较低的情况下的结果摘要表。正确的标识百分比显示在括号中, 并将插入视为单个突变事件进行计算。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57787/57787fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57787/57787fig6.jpg"> 图6。子集分配报告表由 arrest/分配子集工具生成.10例 cll 患者 (a1-a10) 的 fasta ig 序列被提交给 arrest/任务子集工具。病例 a4 被分配给 cll 定型子集 #2 (已知该组中的患者无论 shm 负荷如何预后较差), 并且信心满满。其他七个案例序列中有七个没有分配给一个主要的定型子集, 因此被归类为未分配。提交的两个序列 (a7 和 a8) 不能用于子集分配, 而是由于序列的问题 (即由于帧外连接点或存在停止密码子) 而被归类为 "无菌" 不健康。有关表格标题和工具的全面说明可在 arrest/assignset 网站32上找到。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57787/57787fig6large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

在此, 我们根据欧洲研究倡议积累的经验, 详细介绍了确保慢性淋巴细胞白血病 (cll) 患者进行稳健 ig 基因序列分析的技术方面和基本要求。cll (eric)。

慢性淋巴细胞白血病免疫球蛋白基因序列分析: 从患者材料到序列解释

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

该方法有助于回答慢性淋巴细胞白血病领域关键问题，如患者的准确预后。这种技术的主要优点是简单、快速、准确。该技术的影响延伸到强大的预后，尤其是对慢性淋巴细胞白血病患者的风险认证，因为准确的预测可能稍后定义该疾病的治疗管理。此方法的可视化演示至关重要，例如 PCR 产品选择和消化序列分析类型很难学习，因为它们需要精度和经验。要开始此过程，请将 200 微升 EDTA 添加到 50 毫升无菌收集管中。将20毫升外周血和15毫升RPMI介质加入管子，上下移液器上下混合2至3次。接下来，将15毫升的密度梯度介质添加到新的50毫升收集管中。缓慢地将外周血溶液分层到密度梯度介质上，确保它不会破坏梯度。在离心机制动器关闭时，以 800 倍 G 离心 20 分钟。然后使用无菌巴斯德移液器收集在上血浆血小板层和密度梯度介质层之间形成的单核细胞环，并转移到新的无菌15毫升收集管。添加 RPMI 介质，使最终体积为 12 毫升，并上下移液器混合。在800倍G下离心8分钟。丢弃上一提液，用 10 毫升 RPMI 介质重新悬浮细胞颗粒。再次以 750 倍 G 离心，8 分钟。在此之后，丢弃上经剂，将细胞颗粒溶解在一毫升PBS中。使用新的鲍尔板，通过混合20微升样品和80微升1至10土耳其溶液，形成细胞计数。如果样品的下游处理未安排在同一天，则将样品以750倍G离心8分钟。丢弃上一液，将细胞颗粒储存在零下80摄氏度。首先，使用每个子组底转的等量准备底转组合，以确保无偏放大。混合文本协议表二中列出的 PCR 试剂。将0.5微升TAP聚合酶加入含有混合PCR试剂的PCR管。然后，添加100纳米的gDNA或两微升的cDNA。运行热PCR协议，详见文本协议表三。在此之后，使用 IGHV 升底数或使用 IGHPFR1 底流混合时，检查大约 500 个基对的 PCR 产品或 350 个基对。要开始 PCR 产品纯化，请将 PCR 产品的总体积加载到 3% 的低熔化气糖凝胶上。允许 PCR 产品在凝胶上运行，直到它们与背景分离。切除尖锐的突出的PCR带，然后净化和除名它们。如果检测到两个重新排列，则应分别切除两个波段并排序。若要执行外液清理，请按照制造商关于要使用的特定卷的说明进行操作。轻轻涡流每个样品混合和孵育他们在PCR块在37摄氏度30分钟。将酶加热至85摄氏度15分钟，使酶灭活。在此之后，将少量PCR产品装载到3%的加糖凝胶上，以评估产品的纯度。测序之前的最后一个检查点是使用片段分析确定样本的克隆性。要开始分析序列，请启动相应的软件。指定物种，如智人，以及受体类型或位点。以快速格式分析的序列，并在每次运行最多 50 个序列的批次中将标识符纳入文本区域。然后，为结果选择以下三个显示选项之一。详细视图：选择此选项，以便单独获取每个序列的结果。综合视图：选择此选项可编译按IGHV基因和等位基因或序列输入顺序排序的汇总表。此选项还提供序列的对齐方式，这些序列在任何提交的批处理中都分配给相同的 IGHV 基因和等位基因，最后是 Excel 文件。选择此选项可将所有输出文件作为电子表格合并到单个文件中。只有使用 IGHV 升底片，才能放大重新排列的 IGHV 的完整长度，从而可以确定真正的 HSM 负载。预期的 PCR 产品大约为 500 个基对。在极少数情况下，IGHV 升底片无法放大克隆性 IG 重新排列，可以使用 IGHBFR1 底像。预期的 PCR 产品约为 350 个基对。然后使用 IMG 电视任务工具分析获得的序列。结果表中的第一行说明序列的功能，因为 IG 重新排列的序列可以是生产性的，也可以是非生产性的。IGH 基因重排是非生产性的，停止鳕鱼存在于 VDJ 区域和/或如果重新排列由于插入/删除而脱离帧。需要注意的是，只有生产性的、因此的功能重新排列才应进一步分析。使用默认 IMG TV Quest 参数时，不会自动检测到插入和删除，但该工具会提供序列可能进行此类更改的强烈迹象，结果汇总表下方将显示警告警报。尝试此过程时，重要的是要记住将 PCR 产品放在凝胶上足够长的时间，以便克隆键可以与多克隆背景进行区分。该技术开发后，为慢性淋巴细胞白血病免疫遗传学领域的研究人员探索体细胞表皮状态对患者体细胞表皮状态的预后影响铺平了道路。不要忘记，使用溴化硅可能极其危险，执行此程序时应始终采取预防措施，例如在发动机罩下工作。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

用触印细胞学方法快速获得临床病理标本中高质量肿瘤 DNA

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

科研

癌症研究

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

流式细胞仪估测原发性急性髓系白血病和患者源性移植中白血病干细胞的诊断和随访

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

一种检测慢性淋巴细胞白血病新 nfat2 靶基因的染色质免疫沉淀法

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

原发性白血病细胞代谢谱的评价

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

从患者前列腺癌骨转移标本及其异种移植物中提取的三维（3D）有机物的建立与分析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

原发性慢性淋巴细胞白血病细胞的细胞次细胞分段监测核/细胞质蛋白贩运

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

NKG2D 利甘德表面检测的两种流细胞学方法，以区分干细胞与急性骨髓性白血病中的散装亚群

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

从患者来源的肿瘤样本中建立三维微球并评估其对药物的敏感性

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的生成和培养

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...