Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
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Nous remercions les membres présents et passés de nos groupes de recherche, le groupe IgCLL et ERIC, pour leur engagement et leur enthousiasme dans l’étude immunogénétique de CLL. Nous tenons également à souligner la collaboration confiante de tous les membres de l’initiative IMGT/CLL-DB et, en particulier, professeur Marie-Paule Lefranc et Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, France, IMGT, le système d’information international immunogénétique pour leur énorme appui et aide à l’analyse de séquences de gènes IG. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de TRANSCAN-179 roman JTC 2016 ; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 et spécial programme moléculaire clinique oncologie à 5 pour mille #9965), Milano (Italie) ; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rome, Italie ; La société du Cancer suédois, le Conseil de recherche suédois, Knut et Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Université d’Uppsala, Uppsala University Hospital et Cancer Research Foundation du Lion, Uppsala. Programme ODYSSEUS, relevant le « Action pour le développement sur the recherche et technologique secteur stratégique », financé par le Programme opérationnel « Compétitivité, entrepreneuriat et Innovation » (CRSN 2014-2020) et cofinancé par la Grèce et l’Union européenne (Fonds européen de développement régional).

Le protocole de recherche a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Institut scientifique San Raffaele, Milan, Italie.
1. matériau sélection
<ol><li>
Choix de la matière première Remarque : Dans la plupart des cas du CLL le nombre de cellules de tumeur est élevé au moment du diagnostic (> 80 à 90 %). Ainsi, cellule de tri ou de l’enrichissement des cellules leucémiques n’est généralement pas nécessaire.<ol>
<li>Si vous utilisez du sang périphérique (PB), le plus commun matériau de choix pour l’analyse de séquences de gènes IG, utiliser un volume de sang entre 10-20 mL.</li>
		<li>Sinon, dans les cas avec une faible charge de cellule CLL, utiliser cellule Tri des échantillons de PB ou de la matière provenant d’autres tissus, comme la moelle osseuse (BM) ou les ganglions lymphatiques (LN).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Temps d’échantillonnage
	<ol>
<li>Échantillonnage temps n’est pas cruciale étant donné que le statut de SHM IG est stable heures supplémentaires ; Cela dit, éviter d’échantillonnage à certaines périodes, comme immédiatement après ou pendant le traitement, étant donné le faible nombre de cellules CLL peut compliquer l’analyse et aboutir à des résultats peu fiables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stockage et collecte de matériel NOTE : Collecte et stockage de matière première dépend fortement du choix du matériau.<ol>
<li>Pour les échantillons de PB ou BM, utiliser EDTA ou CPT des tubes pour prélèvements (citrate-tris-pyridossalphosphate) pour empêcher l’inhibition du processus d’amplification PCR ; vous pouvez également utiliser des tubes héparine.</li>
		<li>Pour les échantillons de LN, possibilités de collecte sont soit des suspensions cellulaires, des biopsies de tissus congelés frais ou, dans rares cas fixés au formol paraffine (FFIP) les tissus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. séparation de Gradient de densité
Remarque : Si PB ou BM est le produit de départ de choix, qui est le scénario le plus fréquent, il est recommandé d’isolement de cellules mononucléées à l’aide de séparation gradient de densité.
<ol><li>Ajouter 200 µL d’EDTA (EDTA 0,5 M / pH 8.0) dans un tube de prélèvement stérile de 50 mL. Ajouter 20 mL de PB et 15 mL de RPMI. Mix de pipetage (2 - 3 fois suffit).</li>
	<li>Ajouter 15 mL de milieu de gradient de densité à un nouveau tube de prélèvement de 50 mL. Remarque : dans le cas où le volume de PB est inférieure à 20 mL, les volumes de RPMI (étape précédente) et le gradient de densité doivent être modifiées en conséquence.</li>
	<li>Lentement la couche dans la solution de l’étape 2.1 afin qu’il ne perturbe pas le dégradé. Centrifuger à 800 x g pendant 20 minutes avec le frein centrifuge au large.</li>
	<li>Collecter l’anneau de cellules mononucléées qui s’est formé entre la couche de plasma/plaquettes supérieure et la couche moyenne gradient de densité à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, puis transférer dans un tube de prélèvement stérile de 15 mL.</li>
	<li>Ajouter RPMI pour un volume final de 12 mL et mélanger. Centrifuger à 750 g pendant 8 minutes. Jeter le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot de cellules à l’aide de 10 mL de milieu RPMI et répétez l’étape 2.5.</li>
	<li>Dissoudre le culot dans 1 mL de PBS (SPD, sans calcium, sans magnésium). Effectuer un nombre de cellules à l’aide d’une plaque de Neubauer en mélangeant 20 µL de l’échantillon et 80 µL de 01:10 solution de Türk.</li>
	<li>Si le traitement en aval de l’échantillon n’est pas prévue pour le même jour, centrifuger l’échantillon à 750 x g pendant 8 minutes. Jeter le surnageant et stocker le culot cellulaire à-80o C.</li>
</ol>3. acides nucléiques Extraction
<ol><li>Décider sur un substrat pour l’analyse de la situation SHM des gènes des IG. L’ADN génomique (ADNg) est le choix le plus populaire car il n’est pas nécessaire pour une étape de transcription inverse ; par ailleurs, l’utilisation de RNA/complémentaire (ADNc) l’ADN assure que, au moins au niveau transcriptionnel, le réarrangement de IG clonotypiques productives, fonctionnelle est la cible « privilégiée ».</li>
	<li>Utiliser un des nombreux kits disponibles dans le commerce appropriés pour l’extraction de l’ARN génomique ou total et la synthèse de cDNA (voir Table des matières).</li>
	<li>Évaluer l’intégrité de l’ADN ou l’ARN à l’aide de systèmes de quantification d’acides nucléiques sensibles. Si à l’aide de matériel FFIP pour l’analyse, évaluer la qualité et la quantité du cDNA/ADNg extraite par amplification par PCR d’un gène de ménage connue, par exemple retinoic acid récepteur alpha (RARa), beta-actine, etc..</li>
</ol>4. amplification et le séquençage des réarrangements génétiques IGHV-IGHD-IGHJ
<ol><li>
Sélection d’amorces PCR IGH
	<ol>
<li>De préférence, effectuer des multiplex PCR avec des amorces spécifiques de 5' sous-groupe IGHV et IGHJ gène spécifique 3' amorces25,26. Si les résultats sont moins qu’optimales, préparer distincts mélanges PCR utilisant des amorces de sous-groupes spécifiques IGHV unique.</li>
		<li>Utiliser 5' les amorces qui anneal soit la région leader située immédiatement en amont du réarrangement IG ou au sein de la région codante (p. ex. cadre 1, FR1) du gène IGHV.<ol>
<li>Utiliser les amorces de chef qui permettent l’amplification de l’ensemble réarrangés IGHV-IGHD-IGHJ séquence du gène, qui à son tour va permettre l’estimation précise des niveaux SHM. Ainsi, des amorces de chef IGHV sont recommandés par ERIC dans leurs directives actualisées pour IG gène séquence analyse27.</li>
			<li>Dans les cas où des amorces de chef ne parviennent pas à amplifier le réarrangement de IG clonotypiques, utiliser les amorces IGHV FR1. Toutefois, des amorces de cadre n’amplifient pas le réarrangement génique de toute clonotypiques IG, qui peut conduire à la détermination imprécise du niveau de la SHM. Dans ce scénario, clairement indiqué dans le rapport clinique que l’utilisation des amorces IGHV FR1 peut surestimer la véritable identité de pourcentage pour le gène plus proche de la lignée germinale.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour l’extrémité 3', utilisation consensus amorces ciblant les gènes IGHJ, multiplex définit des amorces de gène-spécifique IGHJ ou des amorces d’isotype-spécifiques, selon le substrat. Séquences d’amorces sont fournis dans le tableau 1, alors que la Figure 1 illustre les différents endroits pour apprêt recuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplification par PCR des réarrangements génétiques IGHV-IGHD-IGHJ
	<ol>
<li>Préparer le mélange d’apprêt à l’aide de quantités équimolaires de chaque sous-groupe primer(s) afin d’assurer l’amplification impartiale.<ol>
<li>Par exemple, lors de l’utilisation des amorces de chef de file, deux amorces différentes sont utilisées pour amplifier les réarrangements appartenant au sous-groupe IGHV1. Ainsi, utiliser une quantité de ces 2 amorces (IGHV1L et IGHV1bL) qui est de que moitié par rapport au IGHV4L, qui est l’amorce seule pour IGHV4 réarrangements de sous-groupe.</li>
			<li>Appliquer la démarche inverse dans le cas les amorces IGHJ1-2 et IGHJ4-5. Comme ces amorces ciblent deux sous-groupes différents du gène IGHJ, doubler la quantité par rapport aux amorces IGHJ3 et IGHJ6.</li>
			<li>Le tableau 1 permet de déterminer les quantités exactes amorce lors de la préparation d’amorce les mélanges.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Réactifs PCR Mix telles qu’énumérées dans le tableau 2. Après avoir combiné tous les réactifs PCR dans un tube PCR, ajouter 0,5 µL de la Taq polymérase et 100 ng d’ADNg ou 2 µL de cDNA (ARNC devrait être préparée à l’aide de 1 µg d’ARN). Remarque : Une enzyme Taq avec activité de relecture n’est pas essentielle, car le taux d’erreur de l’amplification est extrêmement faible et n’affectera donc pas le niveau de SHM.</li>
		<li>Exécutez le protocole ACP thermique détaillé dans le tableau 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Évaluation de clonalité NOTE : Une étape cruciale consiste à évaluer le modèle de clonalité du produit PCR. Lorsqu’on évalue la clonalité de patients atteints de LLC, la conclusion plus commune est une crête/bande unique, anticorps monoclonale.<ol>
<li>Utilisez les méthodes avec la sensibilité élevée, telles que l’analyse de fragment ou hétéroduplex, clonalité évaluation28,29.</li>
		<li>Analyse des fragments<ol>
<li>Effectuer des multiplex PCR à l’aide du chef IGHV 5'-étiqueté ou amorces de PCR FR1 sous-groupe spécifiques ; Cela donnera des produits PCR qui peuvent être séparés par électrophorèse capillaire, permettant ainsi d’évaluation de clonalité de la PCR IGH produits basé sur leur complémentarité IGHV déterminer la région 3 longueurs (CDR3).</li>
			<li>Utiliser des amorces, des réactifs et des conditions thermiques identiques à ceux mentionnés précédemment (voir tableaux 1-3). 5´ personnalisé-étiqueté amorces sont fluorescent étiquetés oligos avec un choix de colorants à l’extrémité 5'. Exemples de colorants journaliste 6-FAM, HEX, NED ou TET. 2 réactions distinctes sont donc requises basé sur l’utilisation des 3 différentes teintures par réaction.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Évaluer la taille des produits PCR sur un gel de polyacrylamide de six pour cent (6 %) (ce pourcentage entraîne une résolution optimale), à l’aide de 1 x TBE comme un tampon en cours d’exécution. Courir à 80 V pendant 45 min. Remarque : Il est recommandé que les produits PCR sont autorisés à migrer sur le gel pendant assez longtemps pour que les échantillons monoclonales peuvent être séparés de l’arrière-plan polyclonaux et le marqueur de taille d’ADN peut séparer adéquatement. Des facteurs comme la taille et l’épaisseur du gel peuvent affecter migration si aucun paramètre unique (tension et temps) peut garantir un résultat optimal qui disait, réglage de la tension à 80 V pendant 45 minutes est un bon point de départ car il minimise le risque de l’échantillon migration trop rapidement et « fonctionne » hors gel.</li>
		<li>Recherchez les amplicons d’environ 500 paires de bases lors de l’utilisation des amorces de chef IGHV et 350 paires de bases lors de l’utilisation des mélanges d’apprêt IGHV FR1. Remarque : Dans de rares cas, des cas de LLC ont été trouvés pour transporter des produits doubles, anticorps monoclonales et dans des cas encore plus rares, des cas peuvent présenter un modèle oligoclonales. Un agent intercalant comme le bromure d’éthidium (EtBr) ou moins dangereux et plus sensibles taches ADN disponibles dans le commerce peut être utilisé pour la visualisation de l’ADN sur gel d’acrylamide avec excitation UV ou lumière bleue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purification du produit PCR NOTE : Produits PCR sont purifiés pour enlever n’importe quel fond polyclonal provenant des cellules B normales au sein de l’échantillon CLL comme apprêt dimères qui peuvent conduire à séquençage sous-optimale. Utiliser toute méthode qui supprime des dNTPs non constituées en société et amorces pour la PCR nettoyage, par exemple un traitement enzymatique, par exemple, Sap (phosphatase alkaline de crevette) / Exo (exonucléase j’ai), ou basée sur les colonnes de purification.<ol>
<li>Charger le volume total du produit PCR sur un gel d’agarose bas point de fusion de 3 %.</li>
		<li>Laisser les produits PCR à courir sur le gel jusqu'à ce qu’elles se séparent de l’arrière-plan.</li>
		<li>Les bandes PCR sharp, éminents de l’accise, purifier et éluer. Si deux réarrangements sont détectées, les deux bandes devraient être excisées et séquencé séparément.</li>
		<li>Pour effectuer le nettoyage Sap/Exo, suivez les instructions du fabricant concernant les volumes spécifiques à utiliser ; Cependant, une réaction typique peut contenir 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo et incubation de 5 x 2 µL de tampon par réaction PCR de 5 à 10 µL. Mélanger au vortex doucement chaque échantillon et incuber sur un bloc PCR à 37 ° C pendant 30 minutes. Inactiver les enzymes en le chauffant à 85 ° C pendant 15 minutes.</li>
		<li>Charger une petite quantité des produits PCR sur un gel d’agarose à 3 % pour évaluer la pureté du produit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. séquençage Sanger
NOTE : Le séquençage plusieurs stratégies existent, cependant, quelle que soit la stratégie exacte, direct le séquençage de deux brins est obligatoire pour garantir un résultat fiable.
<ol><li>
Protocoles de séquencement général
	<ol>
<li>Si l’amplification a été réalisée en utilisant des amorces unique, procéder avec classement en utilisant le IGHV approprié - et IGHJ - ou des amorces spécifiques à une région constantes. Cette approche peut aussi être prise si multiplexés fluorescent étiquetées amorces ont été utilisés et le produit de la PCR a été évalué en utilisant l’analyse de fragment (amorces de séquençage ne doivent pas être étiquetés).</li>
		<li>Si multiplexés amorces ont été utilisées et clonalité a été évaluée sur un gel, utilisez un apprêt en aval lors de la première étape de séquençage par exemple un consensus apprêt IGHJ avec la séquence 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 '. Alternativement, une amorce CH peut être utilisée si l’ADNc a été utilisée comme substrat. Ensuite, utilisez le sous-groupe spécifique IGHV leader ou FR1 amorces pour la deuxième étape de séquençage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocole de séquençage exemple Remarque : Plusieurs protocoles de séquençage existent et un protocole d’exemple est détaillé ci-dessous.<ol>
<li>Diluer 33 ng du produit PCR dans un volume total de 11,5 µL en utilisant, par exemple, de l’eau stérile. Dénaturer le produit PCR par chauffage à 95 ° C pendant 5 minutes. Placer immédiatement sur la glace pendant 10 minutes pour éviter la formation de structures secondaires.</li>
		<li>Ajouter 8 µL du mélange maître dans chaque tube avec 0,5 µL (correspondant à 5 pmol) de l’apprêt.</li>
		<li>Comme contrôle, préparer un tube contenant 8 µL du mélange maître, modèle de contrôle de 0,5 µL pUC18, 2 amorce de séquençage 47 µL (-) et 9,5 µL d’eau stérile. Le dernier volume total dans chaque tube doit être de 20 µL.</li>
		<li>Utiliser des conditions thermiques de cyclisme pour la réaction de séquençage comme indiqué dans le tableau 4.</li>
		<li>Préparer la Solution d’arrêt en mélangeant 2 µL d’acétate de sodium 3M (pH 5,2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8,0) et 1 µL de glycogène (concentration de 20 mg/mL), puis ajouter 5 µL de chaque échantillon. Transférer le produit dans un nouveau tube de microcentrifuge.</li>
		<li>Ajouter 60 µL d’éthanol à 100 % (-20 ° C) et mélanger doucement. Centrifuger à 14 000 tr/min pendant 15 minutes (4 ° C). Jeter le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 100 µL d’éthanol à 70 % (-20 ° C) et mélanger doucement. Centrifuger à 14 000 tr/min pendant 10 minutes (4 ° C). Jeter le surnageant. Répéter une fois.</li>
		<li>Sécher le culot pendant 90 minutes à température ambiante. Ajouter 40 µL de sodium dodecyl sulfate solution (SDS) à chaque échantillon.</li>
		<li>Transférer l’échantillon dans une plaque de séquençage, couvrir avec les couvercles de barrette ou rubans de joint, de chargement dans la machine et effectuer Sanger séquençage. La plaque de séquençage est habituellement un 96 puits, fond v, plaque PCR de plein-jupe compatible avec le séquenceur. Les plaques peuvent être barcoded selon que le séquençage est à effectuer à l’interne, à une société commerciale ou à une plate-forme de séquençage académique/Centre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après le séquençage, « piquer » les 2 lectures générés par les étapes de séquençage individuel pour former une complète IGHV gène réarrangement c'est-à-dire la séquence consensus.</li>
</ol>6. analyse de la séquence
Remarque : Les suivantes sections centrées sur le résultat obtenu de l’IMGT/V-QUEST outil30 lors de l’analyse réarrangés séquences IG et IMGT/JunctionAnalysis31, qui sont particulièrement pertinentes pour les rapports cliniques et de recherche études. IMGT/V-QUEST est un outil d’alignement qui compare l’utilisateur soumis séquences IG avec l’annuaire de référence IMGT définit30. La sortie de l’outil comprend plusieurs sections au sein de laquelle l’utilisateur peut définir certains paramètres.
<ol><li>Spécifier les espèces, par exemple, Homo sapiens (humain) et type de récepteur ou locus (p. ex. IGH, IGK ou IGL).</li>
	<li>Coller des séquences à analyser, au format FASTA et y compris les en-têtes, dans la zone de texte (par lots de 50 séquences par course). Par ailleurs, une option d’entrer le chemin vers un fichier local contenant les séquences FASTA est fournie.</li>
	<li>Choisissez l’une des options suivantes 3 affichage pour les résultats :<ol>
<li>Vue détaillée : sélectionnez cette option afin d’obtenir les résultats pour chaque séquence individuellement.</li>
		<li>Vue de synthèse : choisissez cette option pour compiler un tableau récapitulatif, classé par nom de gène et l’allèle IGHV, ou par ordre d’entrée des séquences. Cette option fournit également un alignement de séquences qui, dans n’importe quel lot soumis, sont assignés à la même gène IGHV et l’allèle.</li>
		<li>Fichier Excel : choisissez cette option pour fournir tous les fichiers de sortie comme des feuilles de calcul incorporées à un fichier unique. Toutes les options d’affichage ont un grand choix de paramètres de base et avancés au choix, cependant seulement les facteurs plus pertinents pour l’analyse des séquences CLL IG sont discutés ci-dessous dans la section « Résultats représentant ».</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. arrêt/AssignSubsets outil
<ol><li>Pour étudier la stéréotypie BcR IG dans CLL (plus de détails ci-dessous dans la section « Résultats représentant »), présenter des séquences FASTA IGHV-IGHD-IGHJ à l’arrestation/AssignSubsets outil32. L’outil signale que l’attribution aux grand CLL stéréotypés des sous-ensembles. L’outil de sous-ensemble-affectation ainsi que des instructions détaillées sont disponibles sur le site Web d’arrestation/AssignSubset32 et aussi sur le site d’ERIC sous l’onglet services.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).</li><li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+where+do+we+stand+how+do+we+proceed?.">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?.</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li><li>Sutton, L. 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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent de communiquer.

L’étude des gènes des IG en CLL a été vital non seulement pour fournir une meilleure compréhension dans la pathologie de la maladie, mais aussi pour améliorer la stratification du risque patient. Il est donc primordial que la procédure en plusieurs étape de l’analyse de séquence de gène IG et interprétation ultérieure des séquences s’effectués de manière standardisée. La disponibilité du matériel patient approprié et suffisant et le calendrier d’échantillonnage ne devraient pas influer sur la capacité d’effectuer l’analyse mutationnelle gène IG étant donné que le test peut être effectué sur le PB et sur n’importe quel échantillon avec un nombre de cellules de tumeur CLL élevé. La séparation des cellules mononucléaires du sang à l’aide de méthodes de séparation dégradé est assurée dans les laboratoires de diagnostic, et comme toujours, il faut veiller lors de l’ajout de la solution de sang/RPMI dans le tube contenant le gradient ; cette tâche doit être effectuée d’une manière lente et douce pour ne pas perturber le gradient et prévenir la perte de cellules.
Suite à la séparation des cellules, les acides nucléiques sont extraits. Les deux ADNg et ARNC conviennent à l’analyse de la transposition de l’ISFH clonotypiques SHM, cependant, il y a des avantages et des inconvénients de l’utilisation d’un matériau. Le flux de travail de laboratoire produit plus rapidement lorsque vous utilisez ADNg puisque aucune transcription inverse ne doit être effectué avant l’amplification par PCR. Cela dit, à l’aide de gDNA comme substrat pour la PCR peut entraîner l’amplification des réarrangements productives et non productives qui, à son tour, peut conduire à des travaux de laboratoire pratique supplémentaire, c'est-à-dire, de purification ou l’excision gel de multiples produits PCR et le séquençage individuel de tous les réarrangements. Si l'on compare les approches génomique et de la cDNA, pour ce dernier une étape de transcription inverse doit être effectuée avant de procéder à l’amplification par PCR. Toutefois, en l’occurrence, pour la plupart des cas, seulement les réarrangements IG productives seront amplifiés et séquencés par la suite. Ainsi, seulement un seul produit PCR sera purifié et séquencé, tandis que l’interprétation des résultats est plus simple.
L’efficacité de l’amplification dépend largement de la qualité de l’ADNg/ADNc, qui devraient être évalué à l’aide d’une méthode de quantification sensible et les amorces utilisées. Les amorces utilisées sont essentiels à l’ensemble de la procédure analytique, parce que la détermination précise du niveau SHM n’est possible que par amplifier la séquence complète du gène réarrangé IGHV. Un réarrangement pleine longueur ne peut être apprécié que si 5' IGHV chef amorces sont utilisées, ce qui justifie les recommandations récentes par ERIC pour l’utilisation du chef amorces27. L’utilisation d’autres amorces, conduisant à l’amplification des réarrangements de gènes IGHV-IGHD-IGHJ incomplets, n’est pas appropriée pour l’analyse mutationnelle du gène IGHV et donc fortement déconseillé. La seule exception concerne les cas qui à plusieurs reprises donnent des résultats négatifs lorsqu’on utilise des amorces de chef de file IGHV et analyse d’un nouveau patient est soit pas possible ou également ne pas donner des résultats. Si utilisation d’un échantillon de patients différent et/ou matériel (ADNg/cDNA) et diverses amorces définit encore ne parviennent pas à produire un produit PCR, raisons possibles pourraient être que le fardeau de la cellule tumorale est trop faible ou cette lymphocytose n’est pas due à un clone CLL (auquel cas la IMMUNOPHENOTYPE doit être réévalué). Les amorces utilisées pour l’analyse doivent toujours être indiqués dans le rapport clinique.
Comme le CLL résulte de l’accumulation de cellules de B monoclonales portant le même réarrangement génique de IGHV-IGHD-IGHJ, pour la grande majorité de clonalité cas évaluation révélera un pic monoclonal unique, c'est-à-dire un seul clone. En de rares occasions, double réarrangements ou même oligoclonales patrons peuvent être observées35. Dans ce cas, électrophorèse de gel n’est pas la technique de choix pour l’évaluation de la clonalité et appliquer des méthodes plus sensibles telles que l’analyse de fragment. Une fois la clonalité a été confirmée, la dernière étape avant le séquençage se rapporte à la purification du produit PCR pour s’assurer que les séquences de haute qualité sont obtenues. Enfin, l’outil IMGT/V-QUEST est la ressource recommandée pour l’analyse de la séquence IG par ERIC. Comme les bases de données IMGT sont constamment mis à jour et de faire rapport des résultats bien annotée de façon cohérente et, cet outil assure analyse standardisée et facilite l’analyse comparative entre les différentes installations cliniques ou académiques.
Comme immunogénétiques analyse en CLL a pronostic et, en particulier, incidences prédictives, analyse robuste du réarrangement génique IGHV-IGHD-IGHJ y compris l’attribution de grands sous-ensembles CLL stéréotypé, n’est plus seulement souhaitable, mais d’une importance capitale. Cela est particulièrement évident dans cette ère de nouvelles thérapeutiques et le potentiel que l’analyse du gène IG a pour guider le traitement décisions5,21,22,23,36,37 ,38, officiellement indiqué par la récente mise à jour des directives de l’International Workshop on CLL24parrainé par le NCI. Que lesdites normes rigoureux sont garantis, autant de détermination du statut de la clonotypiques SHM réarrangées de gène IGHV chez les patients atteints de LLC ne sont pas une mince affaire et implique un processus en plusieurs étapes. Surtout, certaines étapes expérimentales, sont respectées, notamment le choix des amorces, des résultats supérieurs de rendement quand spécifique des options ou approches, autres aspects techniques sont prêtent à un certain degré de flexibilité, comme le choix des matériaux ou la méthode d’évaluation de clonalité, dû au fait qu’elles conduisent à des différences subtiles, le cas échéant, en ce qui concerne les résultats définitifs.
Durant la dernière décennie, ERIC s’efforce de promouvoir la normalisation et l’harmonisation des différentes méthodes pertinentes à CLL diagnostic et de pronostic. Cela se reflète dans les recommandations publiées et les lignes directrices pour l’analyse immunogénétiques27,34, nombreux ateliers pédagogiques organisés et événements, la mise en place d’un réseau de IG, ainsi qu’un forum en ligne d’experts à discuter et donner des indications sur les IG gène séquence interprétation au CLL. L’objectif global d’ERIC grâce à ces mesures est de promouvoir la prise en charge clinique optimale et des soins aux patients. Malgré des efforts intenses, cette tâche est loin d’être terminée et en fait est devenue plus complexe en raison de l’élaboration du nouveau séquençage haut débit visant à présenter le profil immunitaire. Néanmoins, même si les difficultés persistent, les efforts intensifs de la normalisation robuste d’analyse génique IG dans le CLL continuent et sont actuellement au centre des activités en cours au sein de ERIC.

Leucémie lymphoïde chronique (LLC), la forme la plus courante de la leucémie chez l’adulte dans les pays occidentaux, se caractérise par l’expansion clonale de cellules de B néoplasiques mature1. D’un point de vue clinique, l’évolution de la maladie est extrêmement variable avec certains patients touchés par une maladie agressive, nécessitant un traitement très tôt après le diagnostic et souvent récurrente ou d’être réfractaire au traitement. Ceci est en contraste frappant avec une proportion importante de patients (environ 30 %) qui présentent une maladie indolente, jamais nécessitent un traitement et ont une espérance de vie similaire aux individus de même âge en bonne santé2. Cette hétérogénéité clinique se reflète dans la diversité des anomalies moléculaires dans les patients atteints de LLC qui conduisent au bout du compte la pathogenèse et l’évolution de cette maladie3.
Établir qu'un diagnostic précis de la CLL est généralement simple, cependant, l’hétérogénéité clinique susmentionnée peut entraver la gestion efficace des patients atteints de LLC et souligne la nécessité pour les marqueurs pronostiques et prédictifs pouvant aider à traitement décisionnel2. De nombreuses études ont tenté d’affiner le pronostic de la LLC, qui a abouti à une abondance de nouveaux marqueurs cliniques et biologiques étant proposé4. Le statut mutationnel du gène clonotypiques immunoglobuline lourd variable (IGHV) est l’un des marqueurs pronostiques plus robustes en CLL, largement dû au fait que (i) elle reste stable dans le temps et que la maladie progresse, et (ii) il est indépendant des autres 5de paramètres cliniques et biologiques. Que malgré tout, des marqueurs très peu, voire aucune, y compris le statut mutationnel IGHV, sont actuellement appliquées en routine clinique au moment du diagnostic.
Des rapports initiaux sur l’utilité clinique du séquençage des gènes IG dans datent CLL dès 1999, lorsque 2 études indépendantes ont indiqué que les patients avec no ou une charge minimale hypermutation somatique (SHM) (CLL unmutated, LLC-U) ont un pronostic plus mauvais que les patients portant un charge supérieure de SHM (muté CLL, LLC-M)6,7. Plus précisément, le groupe de U-CLL comprenait des cas contenant les gènes IGHV clonotypiques avec peu ou pas de SHM et donc une forte identité pourcentage au gène IGHV de la lignée germinale plus proche (≥ 98 %), tandis que M-CLL se composait des cas avec une charge plus élevée de mutational (pourcentage identité à la gène IGHV plus proche germline < 98 %). Depuis ces premières études, on a sans cesse démontré que des cas de U-CLL affichent un court temps-à-premier traitement (TTFT) et la survie globale (OS) par rapport à M-CLL.
Avec le recul, ces études séminales a mis en évidence le rôle essentiel du récepteur des cellules B (BcR) IG en biopathologie CLL, ouvrant ainsi la voie pour des recherches approfondies sur les relations CLL-micro-environnementales qui, à son tour, conduit à une compréhension plus approfondie des l’hétérogénéité biologique de cette maladie8,9. Des études plus récentes ont fourni un appui supplémentaire de l’importance des analyses immunogénétiques en CLL en révélant que des cas individuels peuvent regrouper en sous-ensembles en raison de partage (Quasis) séquences identiques du gène BcR IG, un phénomène appelé stéréotypie BcR IG10 ,11,12,13. Accumulant la preuve appuie l’idée que les patients assignés aux même sous-ensemble stéréotypés harbor clinicobiologique des propriétés semblables qui les séparent clairement d’autres patients atteints de LLC au sein de la même catégorie SHM mais avec différentes séquences de gènes IG ; Il a en effet été signalé que la catégorisation des patients atteints de LLC basée sur la stéréotypie BcR IG plus raffine la ségrégation en vrac des patients atteints de LLC en U-CLL ou M-CLL groupes14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
D’un point de vue clinique, il convient de noter que le statut SHM du gène IGHV clonotypiques semble corréler avec une réponse spécifique à la chimio. Chez M-CLL particulier, traités avec une combinaison de fludarabine/cyclophosphamide/rituximab (FCR), le traitement de l’étalon-or pour les patients atteints de LLC médicalement apte, dépourvu de défauts de gène TP53 , exposées sans progression significativement plus survie (PFS) et OS que U-CLL chez les patients qui ont reçu le même traitement21,22,23. Par conséquent, identification de l’État SHM est devenu importante en particulier pour aider à la prise en charge thérapeutique du CLL patients c'est-à-dire un marqueur prédictif, plutôt que pour l’évaluation de l’évolution clinique de la maladie c'est-à-dire, une marqueur pronostique. En effet, selon la récente mise à jour des directives de l’International Workshop on CLL parrainé par le NCI, le statut SHM des gènes réarrangés IGHV devrait être déterminé dans tous les cas CLL avant le début du traitement dans les deux omnipraticiens et clinique essais24. En outre, en raison de la récente approbation d’agents de traitement novateur et le nombre croissant de médicaments dans les essais, le statut SHM de la molécule d’IG peut jouer un rôle encore plus dans la prise en charge thérapeutique des patients atteints de LLC dans le futur proche5.
Ce rapport détaille tous les aspects de l’analyse de séquence du gène IG, commençant par le choix du matériau approprié et culminant avec l’interprétation clinique, les résultats de séquençage. Une évaluation approfondie de ces étapes est importante dans le diagnostic de routine pour la production de résultats fiables tout en assurant précise stratification patiente dans les essais cliniques. Protocoles sont présentés afin d’aider à l’harmonisation de l’analyse de séquence du gène IG, assurant ainsi que les résultats soient comparables entre les différents laboratoires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

Durant la maturation des lymphocytes B, le complex processus de recombinaison de V (D) J immunoglobuline (IG) gène couplé avec le hypermutation somatique (SHM) donne lieu à une séquence unique d’ADN dans chaque cellule individuelle de la B. Puisque B cellules malignes résultent de l’expansion clonale d’une seule cellule, les gènes IG représentent une signature moléculaire unique commune à toutes les cellules malignes dans un patient individuel ; ainsi, les réarrangements génétiques IG peuvent être utilisés comme marqueurs clonales. En plus d’être un important identificateur clonal, la séquence du gène IG peut agir comme un « scénario moléculaire » puisqu’elle est associée à des stades de développement spécifiques et donc reflète l’histoire de la cellule B impliquée dans la transformation néoplasique. En outre, pour certaines tumeurs malignes, en particulier leucémie lymphoïde chronique (LLC), la séquence du gène IG détient des capacités pronostiques et prédictifs potentiellement. Cela dit, en extrapolant à partir des conclusions significatives de l’analyse de séquences de gènes IG serait impossible si les outils et méthodes robustes n’étaient pas disponibles pour aider à leur analyse. Cet article, s’appuyant sur la vaste expérience de l’Initiative européenne de recherche sur les CLL (ERIC), les détails les aspects techniques et les exigences essentielles nécessaires pour fiable et reproductible IG gène le séquençage en CLL, un test qui est maintenant recommandé pour tous les patients atteints de LLC avant le traitement. Plus précisément, les différentes étapes d’analyses sont décrites allant de l’identification du réarrangement génique clonotypiques IG et la détermination de la séquence nucléotidique de l’interprétation clinique précise les données de séquence de gène IG.

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Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Ici, nous présentons un protocole de détails les aspects techniques et des exigences essentielles pour assurer l’analyse de séquence génique IG robuste chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC), basé sur l’expérience accumulée de l’initiative européenne de recherche sur CLL (ERIC).

Analyse des séquences de gène immunoglobuline dans la leucémie lymphoïde chronique : Patient matériel d’interprétation de la séquence

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la leucémie lymphoïde chronique, comme le pronostic précis des patients. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, rapide et très précise. Les implications de cette technique s’étendent vers le pronostic robuste, plus particulièrement les certifications de risque avec des patients présentant la leucémie lymphocytique chronique parce que le pronostic précis peut plus tard définir la gestion thérapeutique de la maladie.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, comme la sélection des produits PCR et les types d’analyse des séquences de digestion sont difficiles à apprendre parce qu’ils nécessitent à la fois de la précision et de l’expérience. Pour commencer cette procédure, ajouter 200 microlitres d’EDTA à un tube de collecte stérile de 50 millilitres. Ajouter 20 millilitres de sang périphérique et 15 millilitres de rpmi moyen au tube et pipette de haut en bas deux à trois fois pour mélanger.Ensuite, ajoutez 15 millilitres de gradient de densité moyen à un nouveau tube de collecte de 50 millilitres. Superposez lentement la solution sanguine périphérique sur le milieu de gradient de densité, en s’assurant qu’elle ne perturbe pas le gradient. Centrifugeuse à 800 fois G pendant 20 minutes avec le frein centrifugeuse éteint.Ensuite, utilisez une pipette Pasteur stérile pour recueillir l’anneau cellulaire mononucléaire qui s’est formé entre la couche supérieure plaquette plasmatique et la couche moyenne de gradient de densité et le transférer dans un nouveau tube stérile de collecte de 15 millilitres. Ajoutez le support RPMI de telle sorte que le volume final est de 12 millilitres et pipette la solution de haut en bas pour mélanger. Centrifugeuse à 800 fois G pendant huit minutes.Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu RPMI. Centrifugeuse à nouveau à 750 fois G pendant huit minutes. Après cela, jeter le supernatant et dissoudre la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS.À l’aide d’une nouvelle plaque Bauer, former un nombre de cellules en mélangeant 20 microlitres d’échantillon et 80 microlitres d’une à 10 solution turque. Si le traitement en aval de l’échantillon n’est pas prévu pour le même jour, centrifugez l’échantillon à 750 fois G pendant huit minutes. Jetez le supernatant et rangez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius.Tout d’abord, préparer le mélange d’amorce à l’aide de quantités équimolaires de chaque amorce de sous-groupe pour assurer une amplification impartiale. Mélangez les reagents PCR comme indiqué dans le tableau deux du protocole texte. Ajouter 0,5 microlitres de polymésase TAP au tube PCR contenant les reagents PCR mélangés.Ajoutez ensuite 100 nanogrammes de gDNA ou deux microlitres d’ADNC. Exécutez le protocole PCR thermique tel que détaillé dans le tableau trois du protocole de texte. Après cela, vérifiez si les produits PCR d’environ 500 paires de base lors de l’utilisation d’amorces de litre IGHV ou 350 paires de base lors de l’utilisation des mélanges d’amorce IGHPFR1.Pour commencer la purification du produit PCR, chargez le volume total du produit PCR sur un gel d’agarose à faible fondant de trois pour cent. Laissez les produits PCR fonctionner sur le gel jusqu’à ce qu’ils se séparent de l’arrière-plan. Exciser les bandes PCR pointues, puis les purifier et les élitiser.Si deux réarrangements sont détectés, les deux bandes doivent être excisées et séquencées séparément. Pour effectuer le nettoyage exo-sève, suivez les instructions du fabricant concernant les volumes spécifiques à utiliser. Vortex doucement chaque échantillon pour les mélanger et les incuber sur un bloc PCR à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Inactivez les enzymes en les chauffant à 85 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cela, chargez une petite quantité des produits PCR sur un gel d’agarose de trois pour cent pour évaluer la pureté du produit. Le dernier point de contrôle avant le séquençage est la détermination de la clonalité de l’échantillon à l’aide de l’analyse des fragments.Pour commencer à analyser la séquence, démarrez le logiciel approprié. Spécifiez l’espèce, comme l’homo sapiens, et le type de récepteur ou le locus. Rythmez les séquences à analyser en format fasta et y compris les identificateurs dans la zone de texte en lots de jusqu’à 50 séquences par course.Ensuite, choisissez l’une des trois options d’affichage suivantes pour les résultats. Vue détaillée: choisissez cette option afin d’obtenir les résultats pour chaque séquence individuellement. Vue de synthèse : choisissez cette option pour compiler un tableau récapitulatif commandé par le gène IGHV et le nom de l’allèle ou par ordre d’entrée de séquence.Cette option fournit également un alignement des séquences qui, dans n’importe quel lot soumis, sont attribuées au même gène et allèle IGHV, et enfin au fichier Excel. Choisissez cette option pour fournir tous les fichiers de sortie sous forme de feuilles de calcul intégrées dans un seul fichier. Seule l’utilisation d’amorces de litre IGHV permet d’amplifier toute la longueur de l’IGHV réarrangé, permettant ainsi de déterminer la vraie charge HSM.Le produit PCR attendu est d’environ 500 paires de base. Dans de rares cas où les amorces de litre d’IGHV ne peuvent pas amplifier le réarrangement clonotypic d’IG, des amorces d’IGHBFR1 peuvent être employées. Le produit PCR attendu est d’environ 350 paires de base.Les séquences obtenues sont ensuite analysées à l’aide de l’outil IMG TV Quest. La première ligne du tableau des résultats indique la fonctionnalité de la séquence, car une séquence réarrangée par IG peut être productive ou improductive. Un réarrangement du gène IGH est improductif est stop codons sont présents dans la région VDJ et / ou si le réarrangement est hors cadre en raison d’insertions / suppressions.Il est important de noter que seuls les réarrangements productifs et donc fonctionnels doivent être analysés plus avant. Lors de l’utilisation des paramètres IMG TV Quest par défaut, les insertions et les suppressions ne sont pas automatiquement détectées, mais des indications fortes qu’une séquence peut effectuer de telles modifications sont fournies par l’outil et une alerte d’avertissement apparaît en dessous du tableau de résumé des résultats. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler d’atterrir les produits PCR sur le gel assez longtemps afin que le lien clonal peut être discriminé à partir du fond polyclonal.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunogénétique chronique de leucémie lymphocytique pour explorer l’impact pronostique du statut somatique d’épimutation dans les patients. N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthylium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler sous le capot en tout temps doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Établissement et analyse des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés des spécimens de métastasie osseuse du cancer de la prostate du patient et de leurs Xénogreffes

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...