Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
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Wir danken gegenwärtigen und ehemaligen Mitgliedern der unsere Forschungsgruppen, die IgCLL Gruppe und ERIC, für ihr Engagement und ihre Begeisterung an einem Studium Immungenetik in CLL. Wir möchten auch die vertrauensvolle Zusammenarbeit aller Mitglieder der Initiative IMGT/CLL-DB und vor allem Professor Marie-Paule Lefranc und Dr. Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moléculaire, LIGM, Universite anerkennen Montpellier II, Montpellier, Frankreich, und IMGT, das internationale Immungenetik Informationssystem für ihre enorme Unterstützung und helfen bei IG gen Sequenzanalyse. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse von TRANSCAN-179 Roman JTC 2016 unterstützt; Associazione Italiana per la Ricerca Sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 und spezielle Programm molekulare klinische Onkologie-5 Promille #9965), Milano, Italien; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rom, Italien; Der schwedische Cancer Society, der schwedischen Forschungsrat, Knut und Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Universität Uppsala, Uppsala University Hospital und der Löwe Cancer Research Foundation, Uppsala; ODYSSEUS-Programm implementiert unter der "Aktion für den strategische Entwicklung auf der Forschung und technologischen Sektor", finanziert durch das operationelle Programm "Wettbewerbsfähigkeit, unternehmerische Initiative und Innovation" (NSRP 2014-2020) und Co-finanziert durch Griechenland und der Europäischen Union (European Regional Development Fund).

Die Forschungs-Protokoll wurde von der Ethikkommission des San Raffaele wissenschaftliche Institute, Mailand, Italien genehmigt.
1. Material-Auswahl
<ol><li>
Wahl des Ausgangsmaterials Hinweis: In den meisten Fällen der CLL ist die Zellzahl Tumor zum Zeitpunkt der Diagnose hoch (> 80-90 %). Deshalb Zellsortierung oder Bereicherung der leukämischen Zellen in der Regel nicht notwendig.<ol>
<li>Peripherem Blut (PB), die am häufigsten verwendete Material der Wahl für IG gen Sequenzanalyse, verwenden eine Blutvolumen zwischen 10-20 mL.</li>
		<li>In Fällen mit einer niedrigen CLL Zelle Belastung, alternativ Zellsortierung PB Proben oder Material aus anderen Geweben, wie Knochenmark (BM) oder Lymphknoten (LN).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Abtastzeit
	<ol>
<li>Abtastzeit ist nicht entscheidend, angesichts der Tatsache, dass der IG SHM Status stabil Überstunden; Das heißt, vermeiden Sie Probenahme zu bestimmten Zeiten, wie z. B. unmittelbar nach oder während der Therapie, da die geringe Anzahl der CLL-Zellen kann die Analyse zu erschweren und zu unzuverlässigen Ergebnissen führen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Materialsammlung und Lagerung Hinweis: Erfassung und Speicherung von Ausgangsmaterial, hängt stark von der Wahl des Materials.<ol>
<li>Verwenden Sie für PB oder BM Proben EDTA oder CPT (Citrat-Tris-Pyridossalphosphate) Röhrchen, um Hemmung der PCR-Amplifikation Prozess zu verhindern; Alternativ können Sie Heparin-Röhrchen.</li>
		<li>Für LN Proben sind Abholoptionen entweder Zellsuspensionen, Biopsien aus frisch gefrorenes Gewebe oder in seltenen Fällen Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gradient Dichtetrennung
Hinweis: Wenn PB oder BM das Ausgangsmaterial der Wahl, die häufigste Szenario ist, wird mononukleären Zellen isoliert mit Farbverlauf Dichtetrennung empfohlen.
<ol><li>Fügen Sie 200 µL EDTA (0,5 M EDTA / pH 8.0) für eine 50 mL sterile Sammelröhrchen. 20 mL von PB und 15 mL RPMI hinzugeben. Mix von Pipettieren (2 - 3 Mal ist ausreichend).</li>
	<li>Eine neue Sammlung-Tube 50 mL 15 mL Dichte Gradienten Medium hinzufügen. Hinweis: für den Fall, dass das PB-Volumen beträgt weniger als 20 mL, die Bände von RPMI (vorheriger Schritt) und Dichtegradient sollte entsprechend geändert werden.</li>
	<li>Langsam in die Lösung von Schritt 2.1 Schicht, so dass es nicht, dass das Gefälle stört. Zentrifugieren Sie bei 800 X g für 20 Minuten mit der Zentrifuge Bremse aus.</li>
	<li>Sammeln des mononukleären Zellen-Rings, der zwischen der oberen Plasma/Thrombozyten und der Dichte gradient mittlere Schicht mit einer sterilen Pasteurpipette gebildet hat, dann übertragen auf eine sterile 15 mL Sammelröhrchen.</li>
	<li>Ein Endvolumen von 12 mL RPMI hinzufügen und mischen. Für 8 Minuten bei 750 X g zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie die Zelle-Pellet mit 10 mL RPMI und wiederholen Sie Schritt 2.5.</li>
	<li>Auflösen der Zelle Pellet in 1 mL PBS (DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium). Durchführen einer Zellzahl mit einer Neubauer-Platte durch das Mischen von 20 µL Probe und 80 µL 01:10 Türk Lösung.</li>
	<li>Wenn downstream-Processing der Probe nicht für den gleichen Tag geplant ist, Zentrifugieren Sie die Probe bei 750 X g für 8 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und speichern Sie die Zelle Pellet bei-80o C.</li>
</ol>(3) Nukleinsäure-Extraktion
<ol><li>Auf einem Substrat für die Analyse von der SHM-Status der IG-Gene entscheiden. Genomischer DNA (gDNA) ist die beliebteste Wahl gibt es keine Notwendigkeit für einen Schritt der reversen Transkription; Alternativ sorgt die Verwendung von RNA/ergänzende DNA (cDNA), zumindest auf transkriptioneller Ebene produktiv, funktionelle Clonotypic IG Neuordnung "bevorzugte" Ziel.</li>
	<li>Verwenden Sie eine der zahlreichen im Handel erhältlichen Kits geeignet für gDNA oder Gesamt-RNA-Extraktion und die Synthese der cDNA (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Die Integrität der DNA oder RNA mit empfindlichen Nukleinsäure-Quantifizierung Systeme zu bewerten. Wenn mit FFPE-Material für die Analyse, bewerten die Qualität und Quantität der extrahierten gDNA/cDNA durch PCR-Amplifikation eines bekannten Zimmermädchen-Gens, z.B. Retinoic Säure Rezeptor Alpha (RARa), Beta-Actin, etc..</li>
</ol>4. Verstärkung und die Abfolge der IGHV-IGHD-IGHJ-gen Rearrangements
<ol><li>
IGH PCR-Primer-Auswahl
	<ol>
<li>Führen Sie vorzugsweise, Multiplex-PCR mit IGHV Untergruppe spezifische 5' Grundierungen und IGHJ Gen 3' spezifische Primer25,26. Wenn die Ergebnisse nicht optimal sind, bereiten Sie separate PCR Mischungen mit einzelnen IGHV Untergruppe-spezifische Primer.</li>
		<li>Verwenden Sie 5' Primer, die entweder die Leader-Region befindet sich Tempern unmittelbar vor der IG-Umlagerung oder innerhalb der kodierenden Region des Gens IGHV (z. B. Rahmen 1, FR1).<ol>
<li>Verwendung Führer Zündkapseln, die für die Verstärkung des gesamten ermöglichen neu IGHV-IGHD-IGHJ gen-Sequenz, die wiederum die genaue Schätzung der SHM Ebenen ermöglichen. Daher sind IGHV Führer Primer von ERIC in ihren aktualisierten Richtlinien für IG gen-Sequenz-Analyse27empfohlen.</li>
			<li>Verwenden Sie in Fällen, wo Führer Primer Versagen die Clonotypic IG Neuordnung zu verstärken IGHV FR1 Primer. Rahmen Primer jedoch nicht die gesamte Clonotypic IG gen Neuordnung verstärken ungenaue Bestimmung des Niveaus der SHM führen. In diesem Szenario klar im klinischen Bericht, dass die Verwendung von Primern IGHV FR1 Prozent Identität an das nächstgelegene Keimbahn gen überschätzen kann.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie für das 3' Ende Konsens Primer für die IGHJ Gene, Multiplex-Sätze von IGHJ gen-spezifische Primer oder Isotype-spezifische Primer, je nach Substrat. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt, während Abbildung 1 die verschiedenen Standorte für Grundierung zu glühen zeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-Amplifikation der IGHV-IGHD-IGHJ gen rearrangements
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Grundierung-Mix mit äquimolaren Mengen an jede Untergruppe Zündkapseln, um unvoreingenommene Verstärkung zu gewährleisten.<ol>
<li>Beispielsweise werden bei der Verwendung von Führer Primer zwei verschiedene Grundierungen zur Umgestaltungen gehören zur Untergruppe IGHV1 verstärken. So verwenden Sie eine Menge von diesen 2 Primer (IGHV1L und IGHV1bL), die ist die Hälfte im Vergleich zu IGHV4L, die die einzige Grundierung für IGHV4 Untergruppe Umgestaltungen ist.</li>
			<li>Die umgekehrte Vorgehensweise bei der IGHJ1-2 und IGHJ4-5 Primer anwenden. Wie diese Primer zwei unterschiedliche IGHJ gen Untergruppen Ziel, doppelte Menge im Vergleich zu den IGHJ3 und IGHJ6 Primer.</li>
			<li>Verwenden Sie Tabelle 1 , um die genaue Grundierung Mengen zu bestimmen, wann entsprechende Grundierung Mischungen vorbereiten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mix-PCR Reagenzien wie in Tabelle 2aufgeführt. Nach der Kombination der PCR-Reagenzien in einem PCR-Röhrchen, fügen Sie 0.5 µL Taq Polymerase und 100 ng gDNA oder 2 µL cDNA (cDNA sollten bereit sein, mit 1 µg RNA). Hinweis: Ein Enzym Taq mit Korrekturlesen Tätigkeit ist nicht notwendig, da die Verstärkung Fehlerquote extrem niedrig ist und hat daher keine Auswirkungen auf das Niveau der SHM.</li>
		<li>Führen Sie das thermische PCR-Protokoll detailliert in Tabelle 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infektionsstaus Bewertung Hinweis: Ein kritischer nächste Schritt umfasst die Auswertung der Infektionsstaus Muster des PCR Produktes. Infektionsstaus bei Patienten mit CLL zu beurteilen, ist der häufigste Befund eine einzelne, monoklonalen Peak/Band.<ol>
<li>Verwenden Sie Methoden mit hoher Empfindlichkeit, wie Fragment oder Heteroduplex Analyse zur Infektionsstaus Bewertung28,29.</li>
		<li>Fragment-Analyse<ol>
<li>Multiplex-PCR mit 5'-Label IGHV Führer oder FR1 Untergruppe spezifische PCR Primer durchzuführen; Dies erbringt PCR-Produkte, die durch Kapillarelektrophorese getrennt werden können, damit bei schönem Infektionsstaus Einschätzung des IGH PCR Produkte basierend auf ihrer IGHV Komplementarität Bestimmung Region 3 (CDR3) Längen.</li>
			<li>Grundierungen, Reagenzien und thermischen Bedingungen identisch mit den zuvor genannten (siehe Tabellen 1-3) zu verwenden. Benutzerdefinierte 5´-mit der Bezeichnung Primer sind Eindringmittel Oligos mit einer Auswahl von Farbstoffen auf 5'-Ende beschriftet. Beispiele für Reporter Farbstoffe 6-FAM, HEX, NED oder TET. Somit sind 2 separate Reaktionen erforderlich basiert auf der Verwendung von 3 verschiedenen Farbstoffen pro Reaktion.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Beurteilung die Größe der PCR-Produkte auf einem sechs Prozent (6 %)-Polyacrylamid-Gel (dieser Prozentsatz ergibt optimale Auflösung), 1 X TBE als laufende Puffer. Führen Sie bei 80 V für 45 Minuten. Hinweis: Es wird empfohlen, dass PCR-Produkte dürfen auf dem Gel ausreichend Zeit zu migrieren, so dass monoklonale Proben aus dem polyklonalen Hintergrund getrennt werden können und die DNA Größe Marker kann ausreichend trennen. Faktoren wie der Größe und Dicke des Gels können Migration beeinflussen also keine einzige Einstellung (Spannung und Zeit) garantieren ein optimales Ergebnis, das Einstellen der Spannung bei 80 V 45 Minuten lang ein guter Ausgangspunkt ist, wie es minimiert das Risiko der Migration zu Probe sagte, schnell und "läuft" deaktiviert das Gel.</li>
		<li>Suchen Sie nach PCR-Produkte von rund 500 Basenpaaren Verwendung IGHV Führer Grundierungen und 350 Basenpaaren, wenn IGHV FR1 Grundierung Mischungen zu verwenden. Hinweis: In seltenen Fällen CLL Fällen wurden gefunden, Doppel, monoklonalen Produkte tragen und in noch selteneren Fällen Fällen können eine Oligoclonal Muster aufweisen. Intercalating Vermittler wie Interkalation Bromid (EtBr) oder weniger gefährliche und empfindlicher im Handel erhältlichen DNA Flecken einsetzbar für die Visualisierung der DNA auf Acrylamid Gele mit UV-Anregung oder blaues Licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-Produkt-Reinigung Hinweis: PCR-Produkte werden gereinigt, um jedem polyklonale Hintergrund aus normalen B-Zellen innerhalb der CLL Probe sowie Grundierung Dimere, die zu suboptimalen Sequenzierung zu entfernen. Verwenden Sie jede Methode, die nicht rechtsfähige dNTPs und Primer für PCR-Bereinigung, wie z. B. Sap (Shrimp alkalische Phosphatase) eine enzymatische Behandlung entfernt / Exo (Exonuclease ich), oder spaltenbasierten Reinigung.<ol>
<li>Laden Sie das Gesamtvolumen des PCR-Produkts auf eine 3 % niedrig schmelzende Agarose-Gel.</li>
		<li>Lassen Sie die PCR-Produkte auf dem Gel laufen lassen, bis sie vom Hintergrund zu trennen.</li>
		<li>Die scharfen, prominente PCR-Bands Verbrauchsteuern, reinigen und eluieren. Wenn zwei Umstellungen erkannt werden, beide Bands sollten herausgeschnitten werden und separat sequenziert.</li>
		<li>Um Sap/Exo-Bereinigung durchzuführen, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers bezüglich der spezifischen Volumen zu verwenden; enthalten jedoch eine typische Reaktion auf 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo und 2 µL 5 X Inkubation Puffer pro 5-10 µL PCR-Reaktion. Jede Probe durch sanft aufschütteln mischen und 30 Minuten auf einen PCR-Block bei 37 ° C inkubieren. Deaktivieren Sie die Enzyme durch Erhitzen auf 85 ° C für 15 Minuten.</li>
		<li>Laden Sie eine kleine Menge der PCR-Produkte auf einem 3 % Agarosegel auf die Reinheit des Produktes zu beurteilen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Sanger-Sequenzierung
Hinweis: Mehrere Sequenzierung, die Strategien existieren, jedoch unabhängig von der genauen Ansatz, direkte Sequenzierung von beiden Strängen ist zwingend erforderlich, um ein zuverlässiges Ergebnis zu gewährleisten.
<ol><li>
Allgemeine Sequenzierung Protokolle
	<ol>
<li>Wenn Verstärkung mit einzelnen Primern durchgeführt wurde, fahren Sie durch Sequenzierung mit dem entsprechenden IGHV und IGHJ oder konstanten Region-spezifische Primer. Dieser Ansatz kann auch angenommen werden, wenn gemultiplext Eindringmittel beschrifteten Primer verwendet wurden und das PCR-Produkt Fragment Analyse anhand wurde (Sequenzierung Primer sollten nicht beschriftet).</li>
		<li>Wenn Multiplex Primer verwendet wurden und Infektionsstaus auf einem Gel wurden, verwenden Sie dann eine nachgeschaltete Grundierung beim ersten Schritt der Sequenzierung z. B. einen Konsens IGHJ Grundierung mit der Sequenz 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 ". Alternativ kann eine CH-Grundierung verwendet werden, wenn cDNA als Substrat verwendet wurde. Als Nächstes verwenden Sie teilkonzernspezifische IGHV Führer oder FR1 Primer für den zweiten Schritt der Sequenzierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beispiel-Sequenzierung-Protokoll Hinweis: Mehrere Sequenzierung Protokolle vorhanden sein und eine Beispiel-Protokoll ist unten.<ol>
<li>Verdünnen Sie 33 ng des PCR-Produktes in einem Gesamtvolumen von 11,5 µL verwenden, z. B. sterilem Wasser. Denaturieren Sie das PCR-Produkt durch Erhitzen auf 95 ° C für 5 Minuten. Legen Sie sofort auf Eis für 10 Minuten zur Bildung von Sekundärstrukturen zu verhindern.</li>
		<li>Jedes Rohr zusammen mit 0,5 µL (entsprechend 5 Pmol) des Primers fügen Sie 8 µL des master-Mix hinzu.</li>
		<li>Als Kontrolle bereiten Sie ein Röhrchen mit 8 µL des master-Mix, 0,5 µL pUC18 Steuerelementvorlage, 2 µL (-) 47 Sequenzierung Grundierung und 9,5 µL sterilem Wasser. Das endgültige Gesamtvolumen in jedem Röhrchen sollte 20 µL.</li>
		<li>Verwenden Sie Radsport Temperaturbedingungen für die Sequenzierung Reaktion, wie in Tabelle 4.</li>
		<li>Vorbereiten der Stopplösung durch das Mischen von 2 µL Natriumacetat 3M (pH 5,2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8,0) und 1 µL von Glykogen (Konzentration 20 mg/mL), fügen Sie 5 µL zu jeder Probe. Übertragen Sie das Produkt auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Fügen Sie 60 µL 100 % Ethanol (-20 ° C) und mischen Sie vorsichtig. Für 15 Minuten (4 ° C) bei 14.000 u/min zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>100 µL 70 % Ethanol (-20 ° C) hinzufügen und vorsichtig mischen. Für 10 Minuten (4 ° C) bei 14.000 u/min zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand. Einmal wiederholen.</li>
		<li>Trocknen Sie das Pellet für 90 Minuten bei Zimmertemperatur. Fügen Sie 40 µL Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Lösung für jede Probe hinzu.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe auf eine Sequenzierung Teller, Deckel mit Streifen Kappen oder Band Dichtungen, auf den Computer laden und führen Sanger Sequenzierung. Die Sequenzierung Platte ist in der Regel eine 96-Well, V-Boden, voll-Rock PCR Platte kompatibel mit dem Sequencer. Die Platten können Barcodes je nachdem, ob die Sequenzierung im eigenen Haus durchgeführt werden, bei einem gewerblichen Unternehmen oder an eine akademische Sequencing Center/Plattform sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach der Sequenzierung, "aufeinandersteppen Sie" der 2 liest aus die einzelnen Sequenzierung Schritte bilden eine komplette IGHV gen Neuordnung d. h. die Konsensussequenz generiert.</li>
</ol>6. Sequenz-Analyse
Hinweis: Die folgenden Abschnitte Fokussierung auf die Ausgabe von IMGT/V-QUEST Werkzeug30 erhalten, bei der Analyse neu geordnet, IG-Sequenzen und IMGT/JunctionAnalysis31, beide sind besonders relevant für klinische Berichterstattung und Forschung Studien. IMGT/V-QUEST ist ein Alignment-Tool, das Benutzer vergleicht IG Sequenzen mit dem IMGT Referenz Verzeichnis legt30vorgelegt. Die Toolausgabe enthält mehrere Abschnitte, in denen der Benutzer bestimmte Parameter definieren kann.
<ol><li>Die Arten, z. B. Homo Sapiens (Mensch), und Rezeptor Typ oder Locus (z.B. Nabenschaltungen, IGK oder IGL) angeben.</li>
	<li>Fügen Sie Sequenzen im FASTA-Format und einschließlich Header, in den Textbereich (in Chargen von bis zu 50 Sequenzen pro Durchlauf) analysiert werden. Alternativ ist eine Option, geben den Pfad zu einer lokalen Datei, enthält die FASTA-Sequenzen zur Verfügung.</li>
	<li>Wählen Sie eines der folgenden 3 Anzeigeoptionen für die Ergebnisse:<ol>
<li>Detailansicht: Wählen Sie diese Option, um die Ergebnisse für jede Sequenz einzeln zu bekommen.</li>
		<li>Synthese-Ansicht: Wählen Sie diese Option, um eine zusammenfassende Tabelle sortiert nach IGHV gen und Allel Namen oder Reihenfolge der Eingabe zu kompilieren. Diese Option bietet auch eine Angleichung der Sequenzen, die in jedem eingereichten Batch den gleichen IGHV gen und Allel zugeordnet sind.</li>
		<li>Excel-Datei: Wählen Sie diese Option, bieten alle Ausgabe-Dateien als Tabellen in einer einzigen Datei integriert. Alle Anzeige-Optionen haben eine große Auswahl an grundlegenden und erweiterten Parameter zur Auswahl, aber nur die am meisten für CLL IG Sequenzanalyse relevanten Faktoren werden unten im Abschnitt "Vertreter Ergebnisse" diskutiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) Festnahme/AssignSubsets-Tool
<ol><li>Um BcR IG Stereotypen innerhalb CLL (zusätzliche Angaben weiter unten im Abschnitt "Vertreter führt") zu untersuchen, reichen Sie IGHV-IGHD-IGHJ FASTA Sequenzen der Verhaftung/AssignSubsets Tool32. Das Tool meldet, dass die Zuordnung zu großen CLL Teilmengen Stereotyp. Die Teilmenge-Zuordnung-Tool zusammen mit detaillierten Anweisungen sind auf die Verhaftung/AssignSubset Website-32 und auch auf der Website von ERIC unter der Registerkarte "Dienste".</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors.">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li><li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL:+Updated+results+of+the+CLL8+trial.">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li><li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fludarabine,+cyclophosphamide,+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia.">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+diagnosis,+indications+for+treatment,+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li><li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations:+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936.">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li><li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/JunctionAnalysis:+The+first+tool+for+the+analysis+of+the+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+complex+V-J+and+V-D-J+JUNCTIONs.">IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs.</a> Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).</li><li>Bystry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARResT/AssignSubsets:+A+novel+application+for+robust+subclassification+of+chronic+lymphocytic+leukemia+based+on+B+cell+receptor+IG+stereotypy.">ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).</li><li>Belessi, C. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+for+previously+untreated+and+relapsed+or+refractory+chronic+lymphocytic+leukaemia+with+TP53+aberrations:+A+phase+2,+single-arm+trial.">Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial.</a> The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).</li><li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia.">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li><li>Burger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+as+initial+therapy+for+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben keine relevante Interessenkonflikte offenlegen.

Die Studie der IG-Gene in CLL wurde entscheidend, nicht nur für die Bereitstellung ein besseres Verständnis in Krankheit Pathobiologie, sondern auch zur Verbesserung der Patienten Risikostratifizierung. Es ist daher sehr wichtig, dass das mehrstufige Verfahren der IG gen Sequenzanalyse und anschließende Interpretation der Sequenzdaten in einer standardisierten Weise durchgeführt werden. Die Verfügbarkeit von geeigneten und ausreichenden Patientenmaterial und der Zeitpunkt der Probenahme sollte keinen Einfluss auf die Fähigkeit, IG Genanalyse Mutationen auszuführen, da der Test auf PB und auf jede Probe mit einer hohen CLL Tumor Zellzahl durchgeführt werden kann. Die Trennung von mononukleären Blutzellen mit Farbverlauf Trennmethoden in diagnostischen Labors routinemäßig durchgeführt wird, und wie immer Vorsicht geboten, wenn Sie das Rohr mit dem Gefälle der Blut/RPMI-Lösung hinzufügen; Diese Aufgabe sollte in einer langsamen, sanften Weise, um nicht zu stören den Farbverlauf und verhindern den Verlust von Zellen durchgeführt werden.
Nach Zellseparation Nukleinsäuren extrahiert werden. Beide gDNA und cDNA eignen sich für SHM-Analyse der Clonotypic IGH Umlagerung, allerdings gibt es vor- und Nachteile für die Verwendung von entweder Material. Die Labor-Workflow geht schneller wenn Sie gDNA verwenden, da kein reverse Transkription muss vor der PCR-Amplifikation durchgeführt werden. Das heißt, mit gDNA wie das Substrat für die PCR Verstärkung der produktiven und unproduktiven Umstellungen führen kann, die wiederum zusätzliche praktische Laborarbeit, d. h. Reinigung oder Gel Exzision mehrerer PCR-Produkte führen können und individuellen Abfolge der alle Umstellungen. Vergleicht man die gDNA und cDNA Ansätze, muss für Letzteres ein reverse Transkription Schritt werden bevor Sie fortfahren mit PCR Verstärkung durchgeführt. Aber in diesem Fall in den meisten Fällen werden nur produktive IG Rearrangements verstärkt und anschließend sequenziert. So wird nur ein einzelnes PCR-Produkt gereinigt und sequenziert, während Ergebnisse Interpretation einfacher ist.
Die Effizienz der Verstärkung hängt weitgehend von der Qualität der gDNA/cDNA, die bewertet werden sollen, mit einem sensiblen Quantifizierungsmethode und die Primer eingesetzt. Die Primer verwendet sind entscheidend für das gesamte analytische Verfahren, da die genaue Bestimmung der SHM Ebene nur erreicht werden kann, durch die die gesamte Sequenz des Gens neu IGHV Verstärkung. Eine Full-length-Umlagerung kann nur beurteilt werden, wenn 5' IGHV Führer Zündkapseln benutzt werden, damit rechtfertigen die jüngsten Empfehlungen von ERIC für die Nutzung der Führer Primer27. Die Verwendung von alternativen Primer, führt zu der Verstärkung der unvollständigen IGHV-IGHD-IGHJ gen Umgestaltungen, eignet sich nicht für IGHV Genanalyse Mutationen und daher dringend abgeraten. Die alleinige Ausnahme bezieht sich auf Fälle, die wiederholt negativen Ergebnissen führen, wenn IGHV Führer Primer verwendet werden und Analyse der neuen Patientenmaterial ist entweder nicht möglich oder auch gar nicht zu Ergebnissen. Wenn verschiedene Patientenproben und/oder Materialeinsatz (gDNA/cDNA) und verschiedenen Primer noch scheitern, ein PCR-Produkt produzieren festlegt, mögliche Gründe könnte sein, dass die Tumorlast Zelle zu niedrig ist oder die Lymphozytose nicht aufgrund eines CLL-Klons ist (in diesem Fall die Immunophenotype sollte neu bewertet werden). Primer für die Analyse verwendet sollte immer in der klinischen Bericht angegeben werden.
Wie CLL aus der Ansammlung von monoklonalen B-Zellen mit der gleichen IGHV-IGHD-IGHJ gen-Umlagerung ergibt, wird für die überwiegende Mehrheit der Fälle Infektionsstaus Bewertung eine einzigartigen monoklonale Spitze, d. h. einen einzigen Klon offenbaren. In seltenen Fällen können doppelte Umgestaltungen oder sogar Oligoclonal Muster35beobachtet werden. In solchen Fällen Gelelektrophorese ist nicht das bevorzugte Verfahren für Infektionsstaus Beurteilung und empfindlichere Methoden wie Fragment Analyse angewandt werden. Sobald Infektionsstaus bestätigt wurde, bezieht sich der letzte Schritt vor der Sequenzierung auf die Reinigung des PCR-Produktes zu gewährleisten, dass die Sequenzen von hoher Qualität gewonnen werden. Schließlich ist das IMGT/V-QUEST-Werkzeug die Ressource für IG Sequenzanalyse von ERIC empfohlen. IMGT Datenbanken werden ständig aktualisiert und Berichten über Ergebnisse konsistent und gut kommentierte, dieses Tool sorgt für standardisierte Analyse und vergleichende Analyse zu verschiedenen klinischen oder wissenschaftlichen Einrichtungen erleichtert.
Als immungenetischen Analyse in CLL hat prognostische und prädiktive Implikationen, robuste Analyse der IGHV-IGHD-IGHJ gen Neuordnung inklusive der Zuordnung zum großen CLL Stereotyp Teilmengen ist insbesondere nicht mehr nur wünschenswert, sondern von zentraler Bedeutung. Dies zeigt sich insbesondere im Zeitalter der neuer Therapeutika und das Potenzial, die IG Genanalyse Behandlung Entscheidungen5,21,22,23,36,37 führen ,38, als offiziell von der jüngsten Aktualisierung der Leitlinien NCI-gesponsert von der International Workshop on CLL24angegeben. Dass gesagt, strenge Normen gerechtfertigt sind, zumal Festlegung des Status von der Clonotypic SHM IGHV Gens bei Patienten mit CLL umgestaltet, ist nicht trivial und beinhaltet einen mehrstufigen Prozess. Wichtig ist, bestimmte experimentelle Schritte eingehalten werden vor allem die Wahl der Primer, Ausbeute bessere Ergebnisse, wenn bestimmte Optionen und/oder nähert sich, andere technische Aspekte sind geeignet, um ein gewisses Maß an Flexibilität, wie Materialauswahl oder die Methode für die Beurteilung der Infektionsstaus, da sie zu feine Unterschiede, ob und gegebenenfalls in Bezug auf die endgültigen Ergebnisse führen.
Im letzten Jahrzehnt hat ERIC versucht, die Standardisierung und Harmonisierung der verschiedenen Methoden zur CLL Diagnose und Prognose zu fördern. Dies spiegelt sich in den veröffentlichten Empfehlungen und Leitlinien für immungenetischen Analyse27,34, zahlreiche organisierte pädagogische Workshops und Veranstaltungen, die Einrichtung von einem IG-Netzwerk sowie ein Online-Expertenforum zu diskutieren und Hilfestellung für IG gen-Sequenz Auslegung im CLL. Das übergeordnete Ziel von ERIC durch diese Aktionen ist es, optimale Behandlung und Versorgung der Patienten zu fördern. Trotz intensiver Bemühungen diese Aufgabe ist bei weitem nicht vollständig und in der Tat komplexer aufgrund der Entwicklung der neuartigen Hochdurchsatz-Sequenzierung zur Profilerstellung immun geworden. Dennoch, obwohl Herausforderungen bleiben bestehen, intensive Bemühungen für die robuste Standardisierung der IG Genanalyse in CLL weiter und stehen derzeit im Mittelpunkt der laufenden Aktivitäten innerhalb von ERIC.

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL), die häufigste Form der Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern zeichnet sich durch die klonale Expansion der Reife neoplastischen B Zellen1. Aus klinischer Sicht ist der Krankheitsverlauf bei einigen Patienten erleben eine aggressive Krankheit, behandlungsbedürftigen sehr früh nach der Diagnose, und oft rezidivierend oder als Therapie refraktär außerordentlich variabel. Dies steht in krassem Gegensatz zu einem Großteil der Patienten (~ 30 %), die mit einer indolenten Krankheit darstellen, nie Behandlung bedürfen, und haben eine Lebenserwartung, die ähnlich wie bei gesunden Alter abgestimmt2. Diese klinische Heterogenität spiegelt sich in der Vielfalt der molekulare Anomalien gefunden bei CLL-Patienten, die letztlich die Pathogenese und Progression von dieser Krankheit3fahren.
Festlegung, dass eine genaue Diagnose der CLL wird in der Regel unkompliziert, jedoch die oben genannten klinischen Heterogenität behindern das effektive Management von Patienten mit CLL und unterstreicht die Notwendigkeit für prognostische und prädiktive Marker, die in helfen könnte Behandlung Entscheidungen2. Zahlreiche Studien haben versucht, die Prognose der CLL, kulminierend in einer Fülle von neuartigen klinische und biologische Marker vorgeschlagenen4verfeinern. Der Mutationszucht Status des Gens Clonotypic Immunglobulin schwere Variable (IGHV) gehört zu den robustesten prognostische Marker in CLL, vor allem aufgrund der Tatsache, dass (i) es stabil, im Laufe der Zeit und wenn die Krankheit fortschreitet bleibt, und (Ii) es unabhängig von anderen ist klinische und biologische Parameter5. Dass trotzdem, wenn überhaupt nur sehr wenige Markierungen, einschließlich IGHV mutagenen Status, derzeit in der klinischen Routine zum Zeitpunkt der Diagnose angewendet werden.
Erste Berichte über den klinischen Nutzen von IG Gensequenzierung in CLL Datum bereits 1999, als 2 unabhängige Studien, dass Patienten mit Nein oder eine minimale somatische Hypermutation (SHM) Last (Krebszelle CLL, U-CLL berichtet) haben eine schlechtere Prognose als Patienten, die eine höhere Belastung der SHM (mutierte CLL, M-CLL)6,7. Genauer gesagt, die U-CLL-Gruppe bestand aus Fällen Clonotypic IGHV Gene mit wenigen oder keinen SHM beherbergen und damit eine hohe prozentuale Identität an das nächstgelegene Keimbahn IGHV gen (≥98 %), während M-CLL Fällen mit einer höheren mutagenen Last bestand (Prozent Identität, die am nächsten Keimbahn IGHV gen < 98 %). Seit diesen frühen Studien wurde immer wieder nachgewiesen, dass eine kürzere Zeit zu ersten Behandlung (TTFT) und Gesamtüberleben (OS) im Vergleich zu M-CLL U-CLL Vitrinen.
Im Nachhinein markiert dieser bahnbrechenden Studien die zentrale Rolle der B-Zell-Rezeptor (BcR) IG in CLL Pathobiologie, und ebnete damit den Weg für umfangreiche Recherchen in CLL-microenvironmental Interaktionen, die wiederum zu einer umfassenden Würdigung der führte die biologische Heterogenität dieser Erkrankung8,9. Neuere Studien haben zusätzlichen Unterstützung für die Bedeutung der immungenetischen Analysen in CLL durch die Enthüllung, die Einzelfälle in Teilmengen aufgrund Freigabe (quasi-) identische BcR IG Gensequenzen cluster können zur Verfügung gestellt, ein Phänomen genannt BcR IG Stereotypen10 ,11,12,13. Sammeln Beweise unterstützt die Vorstellung, dass Patienten die gleichen Stereotypen Teilmenge Hafen ähnliche Clinicobiological Eigenschaften, die sie deutlich von anderen CLL-Patienten innerhalb der gleichen SHM-Kategorie, aber mit unterschiedlichen IG Gensequenzen zu trennen; Es wurde sogar berichtet, dass die Kategorisierung von Patienten mit CLL basierend auf BcR IG Stereotypen weiter die Bulk Segregation von Patienten mit CLL in U-CLL oder M-CLL Gruppen14,15,16, verfeinert 17 , 18 , 19 , 20.
Aus klinischer Sicht ist es bemerkenswert, dass der SHM-Status des Gens Clonotypic IGHV scheint auf eine konkrete Antwort auf Chemoimmunotherapy beziehen. In bestimmten, M-CLL-Patienten behandelt mit einer Kombination aus Fludarabin/Cyclophosphamid/Rituximab (FCR), die Gold-Standard-Behandlung für medizinisch Fit CLL-Patienten fehlt TP53 Gendefekten, zeigte deutlich längere progressionsfreie Überleben (PFS) und OS im Vergleich zu U-CLL-Patienten, die die gleiche Behandlung21,22,23erhalten. Daher, Identifikation des SHM Status wichtig geworden, insbesondere für die Unterstützung in das therapeutische Management der CLL Patienten z. B. eines prädiktiven Markers und nicht für die Beurteilung der klinischen Verlaufs der Krankheit also, eine prognostische Marker. In der Tat, nach der Aktualisierung der Leitlinien NCI-gesponsert von der International Workshop on CLL der SHM-Status der neu IGHV Gene bestimmt in allen CLL Fällen vor Behandlungsbeginn in beiden Allgemeinmedizin und klinische sollte Studien-24. Darüber hinaus kann die SHM-Status der IG-Molekül aufgrund der letzten Genehmigung des Roman Behandlungsmitteln und die wachsende Zahl von Drogen in Studien, eine noch größere Rolle in der therapeutischen Behandlung von Patienten mit CLL in der nahen Zukunft5spielen.
Dieser Bericht beschreibt alle Aspekte der IG gen Sequenzanalyse, angefangen bei der Wahl des geeigneten Materials und ihren Höhepunkt mit der klinischen Interpretation der Sequenzierung Ergebnisse. Gründliche Bewertung dieser Schritte ist wichtig in der diagnostischen Routine für die Herstellung von zuverlässige Ergebnisse und genaue Patienten Schichtung innerhalb von klinischen Studien zu gewährleisten. Protokolle werden bereitgestellt, um Hilfe bei der Harmonisierung der IG gen Sequenzanalyse, damit Ergebnisse unter verschiedenen Labors vergleichbar sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

Während der B-Zell-Reifung der komplexe Prozess der Immunglobuline (IG) Gen V (D) J Rekombination mit somatische Hypermutation (SHM) führt zu einer einzigartigen DNA-Sequenz innerhalb jeder einzelnen B Zelle gekoppelt. Da B-Zell-Tumoren durch die klonale Expansion einer einzelnen Zelle entstehen, repräsentieren IG Gene eine einzigartige molekulare Signatur häufig auf die bösartigen Zellen innerhalb eines einzelnen Patienten; So können IG gen Umlagerungen als klonaler Marker verwendet werden. Zusätzlich zu seiner Tätigkeit als wichtige klonalen Bezeichner, kann die IG-gen-Sequenz als "molekulare Timeline" handeln, da steht in Zusammenhang mit bestimmten Entwicklungsstadien und somit die Geschichte der B-Zellen die neoplastische Transformation beteiligt spiegelt. Darüber hinaus gilt für bestimmte Tumoren, insbesondere chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), die IG Gensequenz potenziell prädiktive und prognostische Fähigkeiten. Allerdings rechnet man sinnvolle Schlussfolgerungen aus IG gen Sequenzanalyse unmöglich wäre nicht wären robuste Methoden und Werkzeuge zur Verfügung, um in ihrer Analyse zu unterstützen. Dieser Artikel, gestützt auf die langjährige Erfahrung der Europäischen Forschungsinitiative auf CLL (ERIC), Details der technischen Aspekte und grundlegenden Anforderungen erforderlich, um zuverlässige und reproduzierbare IG gen Sequenzanalyse in CLL, einen Test zu gewährleisten, die jetzt empfohlen wird für alle Patienten mit CLL vor der Behandlung. Genauer gesagt, werden die verschiedenen analytischen Phasen beschrieben die Identifizierung von Clonotypic IG gen Neuordnung und die Bestimmung der Nukleotid-Sequenz bis hin zu genaue klinische Interpretation von der IG gen Sequenzdaten.

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Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Hier präsentieren wir eine Protokoll, das Details der technischen Aspekte und wesentliche Voraussetzungen, um robuste IG gen Sequenzanalyse bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), stellen Sie sicher basierend auf den gesammelten Erfahrungen der Europäischen Forschungsinitiative auf CLL (ERIC).

Immunglobulin-gen-Sequenzanalyse In chronischer lymphatischer Leukämie: Aus Patientenmaterial Sequenz Interpretation

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der chronischen lymphatischen Leukämie zu beantworten, wie die genaue Prognose der Patienten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach, schnell und hochpräzise ist. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu robusten Prognostizierungen, insbesondere Risikozertifizierungen bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie, da die genaue Prognose später das therapeutische Management der Krankheit definieren kann.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, z. B. die PCR-Produktauswahl und die Analyse von Digest-Sequenzen sind schwer zu erlernen, da sie sowohl Präzision als auch Erfahrung erfordern. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie 200 Mikroliter EDTA zu einem 50 Milliliter sterilen Sammelrohr hinzu. Fügen Sie 20 Milliliter peripheres Blut und 15 Milliliter RPMI Medium in die Röhre und Pipette nach oben und unten zwei bis drei Mal zu mischen.Als nächstes fügen Sie 15 Milliliter DichteGradient medium zu einem neuen 50 Milliliter Sammelrohr hinzu. Überlagern Sie die periphere Blutlösung langsam auf das Dichtegradientenmedium, um sicherzustellen, dass sie den Gradienten nicht stört. Zentrifuge bei 800 mal G für 20 Minuten mit der Zentrifuge bremse ab.Verwenden Sie dann eine sterile Pasteur-Pipette, um den mononukleären Zellring zu sammeln, der sich zwischen der oberen Plasmaplättchenschicht und der Dichtegradienten-Mittelschicht gebildet hat, und übertragen Sie ihn in ein neues steriles 15-Milliliter-Sammelrohr. Fügen Sie RPMI Medium so hinzu, dass das Endvolumen 12 Milliliter beträgt und Pipette die Lösung nach oben und unten nach oben und unten zu mischen. Zentrifuge bei 800 mal G für acht Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 10 Millilitern RPMI-Medium wieder auf. Zentrifugieren Sie wieder bei 750 mal G für acht Minuten. Danach den Überstand entsorgen und das Zellpellet in einem Milliliter PBS auflösen.Mit einer neuen Bauer-Platte eine Zellzahl durch Mischen von 20 Mikrolitern Probe und 80 Mikroliter einer bis 10 Turk-Lösung bilden. Wenn die nachgelagerte Verarbeitung der Probe nicht für denselben Tag geplant ist, zentrieren Sie die Probe acht Minuten lang bei 750 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius.Bereiten Sie zunächst den Primermix mit äquimolaren Mengen jedes Subgruppenprimers vor, um eine unvoreingenommene Verstärkung zu gewährleisten. Mischen Sie die PCR-Reagenzien, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls aufgeführt. Fügen Sie 0,5 Mikroliter TAP-Polymerase in die PCR-Röhre mit den gemischten PCR-Reagenzien.Fügen Sie dann entweder 100 Nanogramm gDNA oder zwei Mikroliter cDNA hinzu. Führen Sie das thermische PCR-Protokoll wie in Tabelle 3 des Textprotokolls beschrieben aus. Danach suchen Sie bei Verwendung der IGHPFR1-Grundierungsmischungen nach PCR-Produkten von ca. 500 Basispaaren, wenn Sie IGHV-Litergrundierungen oder 350 Basispaare verwenden.Um mit der PCR-Produktreinigung zu beginnen, laden Sie das Gesamtvolumen des PCR-Produkts auf ein drei Prozent schmelzendes Agarosegel. Lassen Sie die PCR-Produkte auf dem Gel laufen, bis sie sich vom Hintergrund trennen. Verbrauchen Sie die scharfen prominenten PCR-Bänder und reinigen und elute sie dann.Wenn zwei Umlagerungen erkannt werden, sollten beide Bänder getrennt ausgeschnitten und sequenziert werden. Bereinigung von Exo-Sap- und -Bereinigungen befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers in Bezug auf die zu verwendenden spezifischen Volumina. Wirbeln Sie jede Probe sanft, um sie auf einem PCR-Block bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten zu mischen und zu inkubieren.Inaktivieren Sie die Enzyme, indem Sie sie 15 Minuten lang auf 85 Grad Celsius erhitzen. Danach laden Sie eine kleine Menge der PCR-Produkte auf ein drei Prozent Agarose-Gel, um die Reinheit des Produkts zu beurteilen. Der letzte Prüfpunkt vor der Sequenzierung ist die Bestimmung der Clonalität der Stichprobe mithilfe der Fragmentanalyse.Starten Sie die entsprechende Software, um mit der Analyse der Sequenz zu beginnen. Geben Sie die Art, z. B. homo sapiens, und den Rezeptortyp oder -ort an. Beschleunigen Sie die Sequenzen, die im Fasta-Format analysiert werden sollen, und schließen Sie Bezeichner in Batches von bis zu 50 Sequenzen pro Durchlauf in den Textbereich ein.Wählen Sie dann eine der folgenden drei Anzeigeoptionen für die Ergebnisse aus. Detailansicht:Wählen Sie diese Option, um die Ergebnisse für jede Sequenz einzeln zu erhalten. Syntheseansicht:Wählen Sie diese Option aus, um eine Zusammenfassungstabelle nach IGHV-Gen und Allelname oder nach Sequenzeingabereihenfolge zu kompilieren.Diese Option bietet auch eine Ausrichtung der Sequenzen, die in jedem eingereichten Batch demselben IGHV-Gen und Allel und schließlich der Excel-Datei zugewiesen sind. Wählen Sie diese Option aus, um alle Ausgabedateien als Tabellenkalkulationen bereitzustellen, die in eine einzelne Datei integriert sind. Nur der Einsatz von IGHV-Litergrundierungen ermöglicht die Verstärkung der gesamten Länge des neu angeordneten IGHV und ermöglicht so die Ermittelte der wahren HSM-Last.Das erwartete PCR-Produkt beträgt ca. 500 Basenpaare. In seltenen Fällen, in denen IGHV-Litergrundierungen die clonotypic IG-Umlagerung nicht verstärken können, können IGHBFR1 Primer verwendet werden. Das erwartete PCR-Produkt beträgt ca. 350 Basenpaare.Die erhaltenen Sequenzen werden dann mit dem IMG TV Quest-Tool analysiert. In der ersten Zeile in der Ergebnistabelle wird die Funktionalität der Sequenz angezeigt, da eine neu angeordnete Sequenz von IG entweder produktiv oder unproduktiv sein kann. Eine IGH-Gen-Neuanordnung ist unproduktiv, da Stop-Codons entweder innerhalb der VDJ-Region vorhanden sind und/oder wenn die Neuanordnung aufgrund von Einfügungen/Deletionen a-frame ist.Es ist wichtig zu beachten, dass nur produktive und damit funktionale Umlagerungen weiter analysiert werden sollten. Bei Verwendung der standardmäßigen IMG TV Quest-Parameter werden Einfügungen und Löschungen nicht automatisch erkannt, jedoch werden starke Hinweise darauf, dass eine Sequenz solche Änderungen mit sich bringen kann, vom Tool bereitgestellt und eine Warnwarnung wird unter der Ergebniszusammenfassungstabelle angezeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die PCR-Produkte lange genug auf dem Gel zu landen, damit die klonale Bindung vom polyklonalen Hintergrund diskriminiert werden kann.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der chronischen lymphatischen Leukämie-Immungenetik, um die prognostischen Auswirkungen des somatischen Epimutationsstatus bei Patienten zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethylbromid extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter der Haube zu jeder Zeit sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Forschung

Krebsforschung

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subzelluläre Fraktionierung der primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen zur Überwachung des nuklearen/zytoplasmatischen Proteinhandels

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...