Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

אנו מודים אנשי ההווה והעבר שלנו קבוצות מחקר, קבוצה IgCLL, אריק, עבור שלהם מחויבות והתלהבות בלימוד immunogenetics ב CLL. אנו גם רוצים להכיר שבבואה שיתוף פעולה של כל החברים של יוזמת IMGT/CLL-DB, ובעיקר, פרופסור מארי-פול Lefranc, ד ר ורוניק Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, ההיסטוריוגראפיה מונפלייה II, מונפלייה, צרפת, ו- IMGT, הבינלאומי ImMunoGeneTics מידע מערכת, שלהם עצום לתמוך ולעזור עם ניתוח רצף גנטי IG. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים TRANSCAN-179 הרומן JTC 2016; Associazione Italiana לכל החיפוש אחר לה סול למקורות Cancro (חוקר גרנט #20246 ו מיוחד תוכנית מולקולרית קליניים אונקולוגיה-5 לכל מיל #9965), מילאנו, איטליה; Progetti di Rilevante Interesse נאציונלה (משחקים מהפ) #2015ZMRFEA, MIUR, רומא, איטליה; האגודה למלחמה בסרטן שוודית, המועצה למחקר השבדי, קנוט, אליס ולנברג קרן, Institutet קרולינסקה, אוניברסיטת אופסלה, החולים האוניברסיטאי אופסלה של האריה קרן למחקר סרטן, אופסלה; תוכנית אודיסאוס, מיושמת תחת "פעולה עבור אסטרטגי על מחקר, טכנולוגית בתחום", במימון התכנית המבצעית "תחרותיות, יזמות וחדשנות" (NSRF 2014-2020) ובמימון משותף יוון, האיחוד האירופי (קרן לפיתוח האזור האירופי).

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).</li><li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+where+do+we+stand+how+do+we+proceed?.">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?.</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li><li>Sutton, L. A., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+between+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+factors+driving+the+evolution+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2015).</li><li>Mina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+prognostic+models+in+CLL+to+personalize+approach+to+clinical+care:+Are+we+there+yet?.">Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?.</a> Blood Reviews. , (2017).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+genes+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+Key+to+understanding+the+disease+and+improving+risk+stratification.">Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification.</a> Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).</li><li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).</li><li>Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmutated+Ig+V(H)+genes+are+associated+with+a+more+aggressive+form+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).</li><li>Burger, J. A., Chiorazzi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).</li><li>Packham, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+proliferation+or+anergy.">The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy.</a> Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).</li><li>Messmer, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+distinct+sets+of+stereotyped+antigen+receptors+indicate+a+role+for+antigen+in+promoting+chronic+lymphocytic+leukemia.">Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).</li><li>Stamatopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+20%+of+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+carry+stereotyped+receptors:+Pathogenetic+implications+and+clinical+correlations.">Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations.</a> Blood. 109 (1), 259-270 (2007).</li><li>Agathangelidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotyped+B-cell+receptors+in+one-third+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+a+molecular+classification+with+implications+for+targeted+therapies.">Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies.</a> Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).</li><li>Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+stereotypy+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).</li><li>Baliakas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+effect+of+stereotyped+B-cell+receptor+immunoglobulins+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+A+retrospective+multicentre+study.">Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study.</a> The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).</li><li>Gounari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+antigen+reactivity+may+underlie,+the+clinical+aggressiveness+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#8.">Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8.</a> Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).</li><li>Ntoufa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+anergy+modulated+by+TLR1/2+and+the+miR-17+approximately+92+cluster+underlies+the+indolent+clinical+course+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#4.">B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4.</a> Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).</li><li>Mansouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+of+IkappaBepsilon+leads+to+NF-kappaB+deregulation+in+aggressive+chronic+lymphocytic+leukemia.">Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).</li><li>Navrkalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+mutations+in+major+stereotyped+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+enrichment+in+subset+#2+is+associated+with+markedly+short+telomeres.">ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres.</a> Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+molecular+lesions+and+specific+B-cell+receptor+subsets+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors.">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li><li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL:+Updated+results+of+the+CLL8+trial.">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li><li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fludarabine,+cyclophosphamide,+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia.">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+diagnosis,+indications+for+treatment,+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li><li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations:+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936.">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li><li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+family+specific+leader+region+primers+for+PCR+amplification+of+the+human+heavy+chain+variable+region+gene+repertoire.">Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire.</a> Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).</li><li>Rosenquist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+gene+sequence+analysis+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+updated+ERIC+recommendations.">Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations.</a> Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).</li><li>Linke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high+resolution+PCR+fragment+analysis+for+identification+of+clonally+rearranged+immunoglobulin+heavy+chain+genes.">Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes.</a> Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).</li><li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroduplex+analysis+of+VDJ+amplified+segments+from+rearranged+IgH+genes+for+clonality+assessments+in+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.+A+comparison+between+different+strategies.">Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies.</a> Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).</li><li>Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/V-QUEST:+The+highly+customized+and+integrated+system+for+IG+and+TR+standardized+V-J+and+V-D-J+sequence+analysis.">IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).</li><li>Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/JunctionAnalysis:+The+first+tool+for+the+analysis+of+the+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+complex+V-J+and+V-D-J+JUNCTIONs.">IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs.</a> Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).</li><li>Bystry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARResT/AssignSubsets:+A+novel+application+for+robust+subclassification+of+chronic+lymphocytic+leukemia+based+on+B+cell+receptor+IG+stereotypy.">ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).</li><li>Belessi, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGHV+gene+insertions+and+deletions+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+&amp;#34;CLL-biased&amp;#34;+deletions+in+a+subset+of+cases+with+stereotyped+receptors.">IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: &amp;#34;CLL-biased&amp;#34; deletions in a subset of cases with stereotyped receptors.</a> European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).</li><li>Langerak, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+sequence+analysis+and+prognostication+in+CLL:+guidelines+from+the+ERIC+review+board+for+reliable+interpretation+of+problematic+cases.">Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases.</a> Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).</li><li>Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+IGHV+DNA+gene+rearrangements+in+CLL:+Influence+of+mixed-mutated+and+-unmutated+rearrangements+on+outcomes+in+CLL.">Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).</li><li>Farooqui, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+for+previously+untreated+and+relapsed+or+refractory+chronic+lymphocytic+leukaemia+with+TP53+aberrations:+A+phase+2,+single-arm+trial.">Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial.</a> The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).</li><li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia.">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li><li>Burger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+as+initial+therapy+for+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).</li></ol>

המחברים יש לא רלוונטי ניגוד עניינים לחשוף.

המחקר של IG גנים ב- CLL כבר חיוניים לא רק על מתן הבנה טובה יותר לתוך המחלה pathobiology אלא גם לשיפור ריבוד הסיכון לחולה. לכן זה בעל חשיבות עליונה כי הליך רב שלבי ניתוח רצף גנטי IG ופרשנות עוקבות של רצף הנתונים מתבצע בצורה סטנדרטית. הזמינות של החומר המטופל מתאים ומספיק ותזמון של דגימה לא צריך להשפיע על היכולת לבצע ניתוח mutational גנטי IG מאז הבדיקה יכולה להתבצע על חמאת בוטנים ועל דוגמה עם ספירת תאים גבוהה CLL הגידול. הפרדת תאי תאי דם באמצעות שיטות הפרדת צבע מתבצע באופן שגרתי במעבדות לאבחון, כמו תמיד, כדאי לשים לב בעת הוספת הפתרון דם/RPMI הצינור המכיל מעבר הצבע; פעילות זו צריכה להתבצע בצורה איטית, עדין כדי להימנע מהפרעה מעבר הצבע ולמנוע האובדן של תאים.
בעקבות הפרדת התא, חומצות גרעין מחולצים. הן gDNA ו- cDNA מתאימים לניתוח SHM של התארגנות מחודשת וקשתות clonotypic, עם זאת, ישנם יתרונות וחסרונות לשימוש של חומר או. מעבדה זרימת העבודה ממשיכה מהר יותר בעת שימוש gDNA מאז שעתוק במהופך אין חייב להתבצע לפני ה-PCR הגברה. אמר, באמצעות gDNA כפי המצע עבור ה-PCR עלול לגרום ההגברה של rearrangements היצרני והן יצרנית אשר, בתורו, יכול להוביל את עבודת מעבדה תרגולים נוספים, קרי, טיהור או ג'ל כריתה של מספר מוצרים PCR ורצף בודדים של כל rearrangements. בעת השוואה בין הגישות gDNA ו- cDNA, עבור הלה צעד שעתוק במהופך חייב להתבצע לפני שתמשיך עם הגברה PCR. עם זאת, במקרה זה, ברוב המקרים, רק rearrangements איג פרודוקטיבי מוגבר, לאחר מכן וסודרו. לפיכך, רק מוצר ה-PCR אחד מטוהר, רציף, ואילו תוצאות פרשנות היא יותר ישירה.
היעילות של הגברה תלויה, במידה רבה איכות gDNA/cDNA, אשר וצריך להעריך באמצעות שיטה כימות רגיש, תחל את מנוצל. צבעי יסוד בשימוש הם קריטיים כדי ההליך האנליטי כולו כי הקביעה מדויקת של רמת SHM תוכל להיות מושגת רק על ידי הגברה את הרצף השלם של הגן IGHV שסודר. רק יכול להיות מוערך על שחלוף באורך מלא אם 5' IGHV מנהיג תחל משמשים, ובכך להצדיק את ההמלצות האחרונות על-ידי אריק לשימוש של מנהיג תחל27. השימוש תחל חלופיים, שמוביל ההגברה של rearrangements לא שלם של ג'ין IGHV-IGHD-IGHJ, אינו מתאים לניתוח mutational ג'ין IGHV, ומכאן חריפה ייעץ. החריגה היחידה נוגעת למקרים בהם שוב ושוב לתוצאות שליליות כאשר תחל מנהיג IGHV משמשים, ניתוח של המטופל חומר חדש הוא לא אפשרי או גם האם לא מניבות תוצאות. אם השימוש מדגם החולה שונים ו/או חומר (gDNA/cDNA), תחל שונים מגדיר עדיין להיכשל כדי לייצר מוצר ה-PCR, סיבות אפשריות יכול להיות כי הנטל תא הגידול הוא נמוך מדי או את ריבוי לימפוציטים ואינו שיבוט CLL (ובמקרה immunophenotype צריך להיות מחדש). יש לציין תחל המשמש לניתוח תמיד בדו ח קליני.
כפי CLL היא תוצאה של ההצטברות של תאי B monoclonal הנושאת את הסידור החדש באותו גן IGHV-IGHD-IGHJ, עבור הרוב המכריע של המקרים clonality הערכת תחשוף ייחודי monoclonal לשיא, קרי, שיבוט יחיד. במקרים נדירים, כפול rearrangements או אפילו oligoclonal דפוסי ייבחנו35. במקרים כאלה, בג'ל אינו הטכניקה המועדפת להערכת clonality ולא צריך להיות מיושם שיטות רגיש יותר כגון ניתוח שבר. ברגע clonality אושרה, השלב האחרון לפני רצף מתייחס הטיהור של המוצר PCR על מנת להבטיח כי רצפים באיכות גבוהה מתקבלים. לבסוף, הכלי IMGT/V-השאיפה היא המשאב מומלץ לניתוח רצף IG על ידי אריק. IMGT מסדי הנתונים מתעדכנים כל הזמן, לדווח על תוצאות וגאנדהרו, באופן טוב המבואר, כלי זה מבטיח ניתוח מתוקננת ואסטמה ומקילה על ניתוח השוואתי בין מתקני קליני או אקדמיות שונות.
ניתוח immunogenetic ב CLL יש prognostic, בפרט, השלכות חיזוי, ניתוח חזקים של הסידור החדש ג'ין IGHV-IGHD-IGHJ כולל את המשימה CLL הגדולות תקטלג קבוצות משנה, אינו רק רצוי אלא חשיבות מרכזית. זה בולט במיוחד בעידן זה של הריפוי ואת הפוטנציאל שיש IG מפענוח להנחות טיפול החלטות5,21,22,23,36,37 ,38, כמו באופן רשמי שמציין העדכון האחרון של ההנחיות NCI במימון מבית המלאכה הבינלאומי ב CLL24. כי אמר, קפדני סטנדרטים הם לאחריות, במיוחד כאשר הנחישות של מצב SHM clonotypic מחדש ג'ין IGHV בחולי CLL אינה עניין של מה בכך ולא כרוך תהליך רב שלבי. והכי חשוב, שלבים ניסיוני מסוימים, בייחוד הבחירה של תחל תוצאות משופרות תשואה ספציפי אופציות ו/או מתקרב הם דבקו, היבטים טכניים אחרים נתונות מידה מסוימת של גמישות, כגון בחירת חומרים או שיטה להערכת clonality, בשל העובדה כי הם מובילים את ההבדלים הדקים, אם בכלל, לגבי התוצאות הסופיות.
במהלך העשור האחרון, אריק שואבת כדי לקדם את סטנדרטיזציה והרמוניזציה של שיטות שונות הקשורה שעייפים ולכלי CLL. זה משתקף בשיעור שפורסמו המלצות וקווים מנחים עבור ניתוח immunogenetic27,34אינספור סדנאות חינוך מאורגן, אירועים, הקמת רשת איג, כמו גם פורום מקוון מומחה כדי לדון ולספק הדרכה על פרשנות רצף גנטי IG ב- CLL. המטרה הכוללת של אריק דרך פעולות אלה היא לקדם טיפול בחולה וניהול קליני אופטימלית. למרות המאמצים אינטנסיבי, משימה זו היא רחוקה מסיומה, למעשה הפך מורכבים יותר בשל ההתפתחות של הרומן רצף תפוקה גבוהה, במטרה לאפיין את סוגי מערכת החיסון. ובכל זאת, למרות האתגרים נמשכות, מאמץ אינטנסיבי התקינה חזקים של IG מפענוח ב- CLL המשך, הם כיום המוקד של פעילות שוטפת בתוך אריק.

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), הצורה הנפוצה ביותר של לוקמיה אצל מבוגרים במדינות המערב, מאופיין על ידי התפשטות המשובטים בוגרת אמצעים B תאים1. מבחינה קלינית, מהלך המחלה הוא מאוד משתנה עם חלק מהחולים חווים מחלה אגרסיבית, הדורשים טיפול מוקדם מאוד לאחר האבחנה, ו לעיתים קרובות ושבה או להיות עקשן לטיפול. זה בניגוד חלק ניכר מהחולים (~ 30%) להציג עם מחלה indolent, מעולם לא דורשים טיפול, אשר יש תוחלת חיים דומה אנשים בריאים תואם גיל2. הטרוגניות קלינית זו משתקפת המגוון ליקויים מולקולרית נמצאו בחולי CLL אשר בסופו של דבר להסיע את פתוגנזה ואת התקדמות של המחלה זה3.
הקמת ש-CLL אבחנה מדויקת היא בדרך כלל פשוטה, עם זאת, הטרוגניות קלינית הנ ל עלול לעכב את ניהול יעיל של חולי CLL, מדגישה את הצורך סמנים prognostic הניבוי והחיזוי, יכול לסייע טיפול קבלת ההחלטות2. מחקרים רבים ניסו לעדן את שעייפים CLL, שהגיעה לשיאה בשפע של סמנים קליניים וביולוגית הרומן להיות המוצע4. המצב mutational של הגן clonotypic בנוגדנים כבד משתנה (IGHV) הוא אחד הסמנים prognostic ביותר עמיד ב- CLL, במידה רבה בשל העובדה כי (i) זה נשאר יציב לאורך זמן, כאשר המחלה מתקדמת, וזה (ii) תלויים בזה פרמטרים קליניים וביולוגית5. כי, סמנים מעט מאוד, אם בכלל, כולל מצב mutational IGHV, כיום מיושמים בשגרת קליניים בזמנו של אבחון.
דיווח ראשוני על התועלת הקלינית של IG רצף גנטי CLL תאריך כבר 1999, כאשר 2 מחקרים עצמאיים דיווחו כי בחולים ללא או עומס מינימלי היפרמוטציה (SHM) (unmutated CLL, U-CLL) בעלי פרוגנוזה גרועה מאשר חולים נושאת SHM גבוה יותר נטל (CLL שעבר מוטציה, M-CLL)6,7. ליתר דיוק, הקבוצה U-CLL כללה מקרים מחסה clonotypic IGHV גנים עם SHM ספורים או בכלל לא, ומכאן זהות אחוז גבוה אל הגן IGHV germline הקרוב (≥98%), ואילו M-CLL כללה מקרים עם עומס mutational גבוהה יותר (אחוז זהות הכי קרוב germline IGHV ג'ין < 98%). מאז אלה מחקרים מוקדם, זה הרף הוכח כי המקרים U-CLL להציג קצר הזמן-כדי-הראשון (TTFT) וטיפול ההישרדות (OS) בהשוואה ל- M-CLL.
במבט לאחור, מחקרים הזרע אלה מודגש תפקיד מרכזי של הקולטן תא B (BcR) IG ב- CLL pathobiology, ובכך לסלול את הדרך עבור מחקר מקיף לתוך אינטראקציות CLL-microenvironmental אשר, בתורו, הוביל הערכה מקיפה יותר של הטרוגניות הביולוגי של8,זו מחלה9. מחקרים מאוחרים יותר מספק תמיכה נוספת לחשיבות של ניתוחים immunogenetic ב CLL חושף כי מקרים בודדים עשוי אשכולות בדרך קבוצות משנה עקב שיתוף (הקבועה) רצפי הגן BcR IG זהים, תופעה כינה BcR איג stereotypy10 ,11,12,13. לצבירת ראיות תומך הרעיון הזה חולים שהוקצו באותה משנה הסטראוטיפי הארבור דומה clinicobiological המאפיינים בבירור מפרידים בינם לבין חולי CLL אחרים בתוך הקטגוריה SHM זהה אבל עם רצפי הגן IG שונים; אכן דווח כי סיווג של חולי CLL בהתבסס על BcR איג stereotypy עוד מזקק ההפרדה בצובר של חולי CLL U-CLL או M-CLL קבוצות14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
מנקודת מבט קליני, זה לציון כי המצב SHM של הגן IGHV clonotypic נראה כדי לתאם עם תגובה ספציפית chemoimmunotherapy. בחולים M-CLL מסוים, מטופלים עם שילוב של ציקלופוספאמיד/fludarabine/rituximab (ה-FCR), הטיפול תקן הזהב לחולי CLL כשיר מבחינה רפואית חסר פגמים הגן TP53 , הציג באופן משמעותי יותר ללא התקדמות המחלה הישרדות (PFS) ו- OS בהשוואה ל- U-CLL חולים שקיבלו את אותו הטיפול21,22,23. לכן, זיהוי של המצב SHM הפך חשוב במיוחד לסיוע בניהול טיפולית של CLL חולים קרי, סמן ניבוי, ולא לשם הערכת הקורס הקליני של המחלה , כלומר, סמן prognostic. למעשה, לפי העדכון האחרון של ההנחיות NCI במימון מבית המלאכה הבינלאומי ב- CLL, המצב SHM של הגנים IGHV שסודר צריך להיות נחוש בכל המקרים CLL לפני הטיפול חניכה בפועל כללית הן וניסויים קליניים ניסויים24. יתר על כן, בשל אישור אחרונים של סוכנים טיפול חדשניים, ואת המספר הגדל והולך של תרופות בניסויים, המצב SHM של המולקולה IG עשוי לשחק תפקיד גדול עוד יותר ההנהלה טיפוליות בחולים עם CLL ליד לעתיד5.
בדוח זה מפורטים בכל ההיבטים של ניתוח רצף גנטי איג, מתחילה עם בחירת החומר המתאים, שהגיעה לשיאה עם הפרשנות קליני של רצף תוצאות. הערכה מעמיק של השלבים חשוב בשגרת אבחון עבור הייצור של תוצאות אמינות וכדי להבטיח מדויק ריבוד המטופל במסגרת ניסויים קליניים. פרוטוקולים ניתנים כדי לסייע משלים ניתוח רצף גנטי איג, ובכך להבטיח תוצאות דומות בין מעבדות שונות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

במהלך ההבשלה תא B, תהליך מורכב של אימונוגלובולינים (IG) גנים V (D) J רקומבינציה יחד עם היפרמוטציה (SHM) מעורר רצף ה-DNA ייחודי בתוך כל תא B בודדים. מאז תא B ממאירות כתוצאה משובט הרחבה של תא בודד, גנים IG מייצגים חתימה מולקולרי ייחודי משותף תאים ממאירים בתוך חולים בודדים; לפיכך, איג ג'ין rearrangements יכול לשמש כסמני המשובטים. בנוסף להיותם מזהה המשובטים חשוב, רצף גנטי IG יכול לשמש "ציר זמן מולקולרי" מאז היא קשורה ספציפית שלבים התפתחותיים, ומכאן משקף את ההיסטוריה של תא B מעורב הטרנספורמציה אמצעים. יתר על כן, עבור ממאירות מסוימות, במיוחד לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), רצף גנטי IG מחזיקה prognostic ויכולות חזוי באופן פוטנציאלי. עם זאת, חיוץ משמעות מסקנות ניתוח רצף גנטי IG יהיה בלתי אפשרי אם הכלים והשיטות חזקים לא היו זמינים לסייע בניתוח שלהם. מאמר זה, ציור על הניסיון העצום של יוזמת המחקר האירופית על CLL (אריק), פרטים ההיבטים הטכניים הדרושים כדי להבטיח לשחזור ואמין IG רצף מפענוח ב- CLL, מבחן המומלץ עכשיו היחנה לכל החולים CLL לפני הטיפול. ליתר דיוק, אנליטי השלבים השונים מתוארים החל הזיהוי של התארגנות מחודשת ג'ין איג clonotypic קביעת הרצף נוקלאוטיד הפרשנות קליניים מדויקת של הנתונים רצף של גנים IG.

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

במסמך זה, אנו מציגים את פרוטוקול פרטים ההיבטים הטכניים ודרישות חיוני כדי להבטיח ניתוח רצף גנטי של IG חזקים אצל חולים עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL), המבוסס על ניסיון מצטבר של יוזמת המחקר האירופית על CLL (אריק).

ניתוח רצף גנטי בנוגדנים בלוקמיה לימפוציטית כרונית: מחומר החולה לפרשנות רצף

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום לוקמיה לימפוציטית כרונית, כגון פרוגנוזה מדויקת של חולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, מהירה ומדויקת ביותר. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת prognostication חזק, במיוחד אישורי סיכון עם חולים עם לוקמיה לימפוציטית כרונית כי הפרוגנוזה המדויקת עשויה להגדיר מאוחר יותר ניהול טיפולי של המחלה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כגון בחירת המוצר PCR וסוגי ניתוח רצף עיכול קשה ללמוד כי הם דורשים גם דיוק וניסיון. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף 200 microliters של EDTA לצינור איסוף סטרילי 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של דם היקפי ו 15 מיליליטר של מדיום RPMI לצינור פיפטה למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב.לאחר מכן, להוסיף 15 מיליליטר של בינוני שיפוע צפיפות לצינור איסוף חדש 50 מיליליטר. שכבה איטית של ת Solution הדם ההיקפי על המדיום שיפוע הצפיפות, מוודא שזה לא לשבש את שיפוע. צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך 20 דקות עם בלם הצנטריפוגה כבוי.לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר סטרילי כדי לאסוף את טבעת התא mononuclear שנוצר בין שכבת טסיות הפלזמה העליונה ואת שכבת בינוני שיפוע צפיפות ולהעביר אותו צינור אוסף סטרילי חדש 15 מיליליטר. הוסף מדיום RPMI כך שהנפח הסופי הוא 12 מיליליטר ו pipette הפתרון למעלה ולמטה לערבב. צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך שמונה דקות.השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI. צנטריפוגה שוב ב 750 פעמים G במשך שמונה דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהמיס את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS.באמצעות צלחת באואר חדשה, ליצור ספירת תאים על ידי ערבוב 20 microliters של מדגם ו 80 microliters של פתרון טורקי אחד עד 10. אם עיבוד במורד הזרם של המדגם אינו מתוזמן לאותו יום, צנטריפוגה המדגם ב 750 פעמים G במשך שמונה דקות. השליכו את העל-טבעי ואחסנו את גלולת התא במינוס 80 מעלות צלזיוס.ראשית, הכינו את תערובת הפריים באמצעות כמויות שיווי משקל של כל פריימר תת-קבוצה כדי להבטיח הגברה לא משוחדת. ערבבו את ה- PCR כפי שרשום בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. הוסף 0.5 מיקרוליטרים של פולימראז TAP לצינור PCR המכיל את רייגנטים PCR מעורבים.לאחר מכן, להוסיף גם 100 ננוגרם של gDNA או שני microliters של cDNA. הפעל את פרוטוקול PCR התרמי כמפורט בטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, בדוק אם קיימים מוצרי PCR של כ- 500 זוגות בסיס בעת שימוש בפרימרים של ליטר IGHV או 350 זוגות בסיס בעת שימוש בתערובות פריימר IGHPFR1.כדי להתחיל טיהור מוצר PCR, לטעון את הנפח הכולל של מוצר PCR על שלושה אחוזים נמוך נמס ג'ל אגרוז. אפשר למוצרים PCR לפעול על הג'ל עד שהם נפרדים מן הרקע. Excise להקות PCR בולטות חדות ולאחר מכן לטהר ולחמק מהם.אם זוהו שני סידורים מחדש, יש ללחוץ את שתי הרצועות ולרצף אותן בנפרד. כדי לבצע ניקוי exo-sap, בצע את הוראות היצרן לגבי אמצעי האחסון הספציפיים לשימוש. בעדינות מערבולת כל מדגם לערבב ולהדגיר אותם על בלוק PCR ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.להשבית את האנזימים על ידי חימום אותם ל 85 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, לטעון כמות קטנה של מוצרי PCR על ג'ל אגרוז שלושה אחוזים כדי להעריך את הטוהר של המוצר. נקודת הביקורת האחרונה לפני רצף היא קביעת שיבוט המדגם באמצעות ניתוח שברים.כדי להתחיל לנתח את הרצף, הפעל את התוכנה המתאימה. ציין את המין, כגון הומו ספיינס, ואת סוג הקולטן או לוקוס. קצב הרצפים שיש לנתח בפורמט fasta וכולל מזהים לתוך אזור הטקסט באצוות של עד 50 רצפים לכל ריצה.לאחר מכן, בחר אחת משלוש אפשרויות התצוגה הבאות לקבלת התוצאות. תצוגה מפורטת:בחר באפשרות זו כדי לקבל את התוצאות עבור כל רצף בנפרד. תצוגת סינתזה:בחר באפשרות זו כדי להרכיב טבלת סיכום שהוזמנה לפי גן IGHV ושם אלל או לפי סדר קלט רצף.אפשרות זו מספקת גם יישור של רצפים שבאצווה שנשלחה מוקצים לאותו גן IGHV ואלל, ולאחר מכן לקובץ Excel. בחר באפשרות זו כדי לספק את כל קבצי הפלט כגליונות אלקטרוניים המשולבים בקובץ יחיד. רק השימוש פריימרים ליטר IGHV מאפשר הגברה של האורך המלא של IGHV מחדש, ובכך מאפשר את עומס HSM האמיתי להיקבע.מוצר PCR הצפוי הוא כ 500 זוגות בסיס. במקרים נדירים שבהם פריימרים של ליטר IGHV אינם יכולים להגביר את סידור מחדש של IG קלונוביפיק, ניתן להשתמש בפרימרים של IGHBFR1. מוצר ה-PCR הצפוי הוא כ-350 זוגות בסיסים.הרצפים שהושגו מנותחים לאחר מכן באמצעות הכלי IMG טלוויזיה Quest. השורה הראשונה בטבלת התוצאות מציינת את הפונקציונליות של הרצף, מכיוון שרצף מסודר מחדש של IG יכול להיות פרודוקטיבי או לא פרודוקטיבי. סידור מחדש של גנים של IGH אינו פרודוקטיבי הוא עצור codons נמצאים בתוך אזור VDJ ו / או אם הסידור מחדש הוא מחוץ למסגרת עקב הוספות / מחיקות.חשוב לציין כי יש לנתח עוד יותר את הסידורים הפרודוקטיביים ובכך הפונקציונליים. בעת שימוש בפרמטרים ברירת המחדל של IMG TV Quest, הוספות ומחיקות אינן מזוהות באופן אוטומטי, עם זאת אינדיקציות חזקות כי רצף עשוי לשאת שינויים כאלה מסופקים על ידי הכלי והתראת אזהרה מופיעה מתחת לטבלת סיכום התוצאות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להנחית את מוצרי PCR על הג'ל מספיק זמן, כך הקשר שיבוט יכול להיות מופלה מן הרקע הפוליקלונלי.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונוגנטיקה של לוקמיה לימפוציטית כרונית כדי לחקור את ההשפעה הפרוגנוסטית של מצב האפימוטציה סומטית בחולים. אל תשכח כי עבודה עם אתיליום ברומיד יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון עבודה מתחת למכסה המנוע בכל עת תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

שבירה משנית של תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשונית לניטור גרעיני/Cytoplasmic סחר בחלבונים

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...