Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
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Ringraziamo i membri attuali e del passato dei nostri gruppi di ricerca, il gruppo IgCLL ed ERIC, per l'impegno e l'entusiasmo nello studio immunogenetica in CLL. Vorremmo anche riconoscere la fiduciosa collaborazione di tutti i membri dell'iniziativa IMGT/CLL-DB e, in particolare, il Professor Marie-Paule Lefranc e Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, Francia e IMGT, il sistema di informazioni internazionale di immunogenetica, per le loro enormi sostenere e aiutare con analisi di sequenza del gene di IG. Questo lavoro è stato supportato in parte dalle concessioni dal TRANSCAN-179 romanzo JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 e speciale programma molecolare clinica oncologia-5 per mille #9965), Milano, Italia; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) n. 2015ZMRFEA, MIUR, Roma, Italia; L'associazione svedese del cancro, il Consiglio di ricerca svedese, Knut e Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Università di Uppsala, Uppsala University Hospital e Cancer Research Foundation del Leone, Uppsala; Programma ODYSSEUS, attuato nell'ambito di "Azione per la strategica sviluppo su the ricerca e settore tecnologico", finanziato dal programma operativo "Competitività, imprenditorialità e innovazione" (QRSN 2014-2020) e co-finanziato dalla Grecia e l'Unione europea (Fondo europeo di sviluppo regionale).

Il protocollo di ricerca è stato approvato dal comitato etico dell'Istituto Scientifico San Raffaele, Milano, Italia.
1. materiale di selezione
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Scelta del materiale di partenza Nota: Nella maggior parte dei casi di CLL il conteggio delle cellule del tumore è elevato alla diagnosi (> 80-90%). Così, ordinamento delle cellule o arricchimento delle cellule leucemiche di solito non è necessario.<ol>
<li>Se si utilizza sangue periferico (PB), il più comune materiale di scelta per l'analisi di sequenza del gene di IG, utilizzare un volume di sangue tra 10-20 mL.</li>
		<li>In alternativa, nei casi con un basso peso di cellula CLL, utilizzare ordinamento delle cellule di PB campioni o materiale da altri tessuti, come il midollo osseo (BM) o i linfonodi (LN).</li>
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Tempo di campionamento
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<li>Tempo di campionamento non è cruciale, dato che lo stato di IG SHM è stabile, ore di lavoro straordinario; detto questo, evitare di campionamento in determinati periodi, come subito dopo o durante la terapia, dato il basso numero di cellule di CLL può complicare l'analisi e portare a risultati inaffidabili.</li>
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</li>
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Deposito e raccolta di materiale Nota: Raccolta e conservazione del materiale di partenza dipende fortemente la scelta del materiale.<ol>
<li>Per campioni PB o BM, utilizzare provette EDTA o CPT (citrato-tris-pyridossalphosphate) per evitare l'inibizione del processo di amplificazione di PCR; in alternativa, utilizzare provette di eparina.</li>
		<li>Per esempi di LN, opzioni di raccolta sono entrambi sospensioni cellulari, biopsie dal tessuto congelato fresco o, in rari casi alla tessuti (FFPE) per la paraffina-incastonato formalina-fisso.</li>
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</li>
</ol>2. densità gradiente separazione
Nota: Se PB o BM è il materiale di partenza di scelta, che è lo scenario più frequente, è consigliabile isolamento di cellule mononucleate mediante separazione gradienti di densità.
<ol><li>Aggiungere 200 µ l di EDTA (EDTA 0.5 M / pH 8.0) in una provetta di raccolta sterile 50 mL. Aggiungere 20 mL di PB e 15 mL di RPMI. Mix di pipettaggio (2 - 3 volte è sufficiente).</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di mezzo di gradienti di densità ad un nuovo tubo di raccolta di 50 mL. Nota: nel caso in cui il volume di PB è inferiore a 20 mL, i volumi di RPMI (passaggio precedente) e gradiente di densità devono essere modificati di conseguenza.</li>
	<li>Strato lentamente nella soluzione da passo 2.1 così da non interrompere la sfumatura. Centrifugare a 800 x g per 20 minuti con il freno di centrifuga fuori.</li>
	<li>Raccogliere l'anello di cellule mononucleate che si è formata tra lo strato superiore del plasma/piastrine e il livello medio gradiente di densità utilizzando una pipetta Pasteur sterile, poi trasferire in una provetta di raccolta sterile 15 mL.</li>
	<li>Aggiungere RPMI ad un volume finale di 12 mL e mescolare. Centrifugare a 750 x g per 8 minuti. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare utilizzando 10 mL di RPMI e ripetere il punto 2.5.</li>
	<li>Sciogliere il pellet cellulare in 1 mL di PBS (DPBS, nessun calcio, senza magnesio). Eseguire un conteggio delle cellule usando un piatto di Neubauer mescolando 20 µ l di campione e 80 µ l di 01:10 soluzione di Türk.</li>
	<li>Se l'elaborazione a valle del campione non è prevista per il giorno stesso, centrifugare il campione a 750 x g per 8 minuti. Eliminare il surnatante e conservare il pellet cellulare a-80o C.</li>
</ol>3. estrazione di acidi nucleici da
<ol><li>Decidere su un substrato per l'analisi dello stato dei geni IG SHM. DNA genomico (gDNA) è la scelta più popolare come non c'è alcun bisogno di un passaggio di trascrizione d'inversione; in alternativa, l'uso di RNA/DNA (cDNA) complementari garantisce che, almeno a livello trascrizionale, la riorganizzazione di IG clonotypic produttivo, funzionale è la destinazione "favorita".</li>
	<li>Utilizzare uno dei numerosi disponibili in commercio kit adatti per l'estrazione di RNA gDNA o totale e la sintesi di cDNA (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Valutare l'integrità del DNA o RNA usando sistemi di quantificazione degli acidi nucleici sensibili. Se utilizzando FFPE materiale per l'analisi, valutare la qualità e la quantità del cDNA/gDNA estratto dall'amplificazione di PCR di un gene housekeeping noti, ad esempio l'alfa del ricevitore acido retinoico (RARa), beta-actina, ecc.</li>
</ol>4. amplificazione e sequenziamento delle riorganizzazioni di Gene IGHV-IGHD-IGHJ
<ol><li>
Selezione dell'iniettore IGH PCR
	<ol>
<li>Preferibilmente, eseguire PCR multiplex con IGHV sottogruppo specifico 5' primer e IGHJ gene specifico 3' primer25,26. Se i risultati sono sub-ottimale, preparare mix PCR separati utilizzando singolo IGHV sottogruppo specifico primer.</li>
		<li>Utilizzare primer 5' che tempri sia la regione leader situata immediatamente a Monte della riorganizzazione IG o entro la regione di codificazione del gene IGHV (ad es. quadro 1, FR1).<ol>
<li>Primer leader di utilizzo che consentono l'amplificazione dell'intero riorganizzate la sequenza del gene IGHV-IGHD-IGHJ, che a sua volta permetterà la stima accurata dei livelli di SHM. Così, si consigliano IGHV leader primer da ERIC nelle loro linee guida aggiornate per IG gene sequenza analisi27.</li>
			<li>In casi dove primer leader non riescono ad amplificare la riorganizzazione di IG clonotypic, utilizzare primer IGHV FR1. Tuttavia, gli iniettori quadro non amplificare la riorganizzazione di gene di IG clonotypic intero, che può portare a inesatta determinazione del livello di SHM. Per questo scenario, indicare chiaramente nella relazione clinica che l'uso di primer FR1 IGHV può sovrastimare la vera identità di percentuale al gene di germline più vicino.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per l'estremità 3', uso degli iniettori di consenso targeting i geni IGHJ, multisala imposta di iniettori di gene-specific IGHJ o primer specifici, a seconda del substrato. Sequenze dell'iniettore sono forniti nella tabella 1, mentre la Figura 1 illustra le varie posizioni per ricottura di primer.</li>
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Amplificazione di PCR delle riorganizzazioni di gene IGHV-IGHD-IGHJ
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<li>Preparare il mix di primer utilizzando quantità equimolari di ogni sottogruppo primer(s) per garantire amplificazione imparziale.<ol>
<li>Ad esempio, quando si utilizza primer leader, due primer diversi sono utilizzati per amplificare le riorganizzazioni appartenendo al sottogruppo IGHV1. Pertanto, utilizzare una quantità di questi 2 primer (IGHV1L e IGHV1bL) che è che la metà rispetto a IGHV4L, che è il fondo unico per le riorganizzazioni del sottogruppo di IGHV4.</li>
			<li>Applicare l'approccio opposto nel caso i primer IGHJ1-2 e IGHJ4-5. Come questi iniettori di destinazione due sottogruppi differenti di gene IGHJ, raddoppiare la quantità rispetto al primer IGHJ3 e IGHJ6.</li>
			<li>Utilizzare la tabella 1 per determinare la quantità esatta primer durante la preparazione di miscele di primer pertinenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reagenti PCR mix come elencato nella tabella 2. Dopo la combinazione di tutti i reagenti PCR in un tubo PCR, aggiungere 0,5 µ l di Taq polimerasi e 100 ng di gDNA o 2 µ l di cDNA (cDNA dev'essere preparato usando 1 µ g di RNA). Nota: Un enzima Taq con attività di correzione di bozze non è essenziale come il tasso di errore di amplificazione è estremamente basso e pertanto non influenzerà il livello di SHM.</li>
		<li>Eseguire il protocollo PCR termico dettagliato nella tabella 3.</li>
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</li>
	<li>
Valutazione di clonalità Nota: Un passo critico successivo implica la valutazione il pattern di clonalità del prodotto della PCR. Nel valutare la clonalità nei pazienti con LLC, l'individuazione più comune è una singola picco/banda monoclonale.<ol>
<li>Utilizzare metodi con alto-sensibilità, quali l'analisi del frammento o dell'eteroduplex, per clonalità valutazione28,29.</li>
		<li>Analisi del frammento<ol>
<li>Eseguire PCR multiplex utilizzando 5'-labeled IGHV leader o iniettori di PCR specifici sottogruppo FR1; Questo consente di ottenere prodotti di PCR che possono essere separati mediante elettroforesi capillare, permettendo la valutazione di clonalità del IGH PCR prodotti basato sulla loro complementarità IGHV determinazione regione 3 lunghezze (CDR3).</li>
			<li>Utilizzare il primer, reagenti e condizioni termiche identiche a quelli menzionati in precedenza (Vedi tabelle 1-3). Personalizzati 5 ´-etichettato primer fluorescente sono etichettati i oligos con una scelta di coloranti all'estremità 5'. Esempi di reporter coloranti 6-FAM, HEX, NED o TET. Quindi, 2 reazioni separate sono richieste basato sull'impiego di 3 differenti tinture per reazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Valutare la dimensione dei prodotti di PCR su un gel di poliacrilammide del sei per cento (6%) (questa percentuale si traduce in risoluzione ottimale), usando 1 x TBE come un buffer in esecuzione. Eseguire a 80 V per 45 min. Nota: È consigliabile che i prodotti di PCR possono migrare sul gel per un tempo sufficiente affinché i campioni monoclonali possono essere separati dallo sfondo policlonale e il marcatore del DNA può separare adeguatamente. Fattori quali la dimensione e lo spessore del gel possono influire sulla migrazione quindi nessuna singola impostazione (voltaggio e tempo) in grado di garantire un risultato ottimale che detto, impostazione della tensione a 80 V per 45 minuti è un buon punto di partenza, come si riduce al minimo il rischio del campione la migrazione troppo rapidamente e 'funzionante' fuori il gel.</li>
		<li>Controllare i prodotti di PCR di circa 500 coppie di base quando si utilizza primer leader IGHV e 350 paia di basi quando si utilizza il mix di primer IGHV FR1. Nota: In rari casi, casi di LLC sono stati trovati per trasportare prodotti di double, monoclonali e in casi ancora più rari, casi possono presentare un modello di oligoclonal. Agente intercalante come etidio bromuro (EtBr) o meno pericolose e più sensibile commercialmente disponibile macchie di DNA può essere utilizzato per la visualizzazione del DNA su gel di acrilammide utilizzando eccitazione UV o luce blu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione del prodotto PCR Nota: I prodotti di PCR vengono purificati per eliminare qualsiasi sfondo policlonale provenienti da cellule B normali all'interno del campione CLL, nonché primer dimeri che possono portare al sequenziamento non ottimale. Utilizzare qualsiasi metodo che rimuove non incorporata dNTP e primer per PCR clean-up, come un trattamento enzimatico, ad esempio, Sap (fosfatasi alcalina del gambero) / Exo (Exonuclease io), o basata su colonne di purificazione.<ol>
<li>Caricare il volume totale del prodotto della PCR su un gel di agarosio 3% basso punto di fusione.</li>
		<li>Permettono ai prodotti PCR di eseguire sul gel fino a quando non si separano dallo sfondo.</li>
		<li>Asportare le bande PCR sharp, prominente, purificare ed eluire. Se vengono rilevate due riorganizzazioni, entrambe le bande dovrebbero essere asportate ed ordinato separatamente.</li>
		<li>Per eseguire la pulitura Sap/Exo, seguire le istruzioni del produttore per quanto riguarda i volumi specifici da utilizzare; Tuttavia una reazione tipica può contenere 1 µ l Sap, 0. 5 µ l Exo e incubazione di 5 x 2 µ l tampone per reazione di PCR di 5-10 µ l. Mescolare delicatamente nel vortex ciascun campione e incubare su un blocco PCR a 37 ° C per 30 minuti. Inattivare gli enzimi da riscaldamento a 85 ° C per 15 minuti.</li>
		<li>Caricare una piccola quantità di prodotti di PCR su un gel di agarosio al 3% per valutare la purezza del prodotto.</li>
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</li>
</ol>5. Sanger sequenziamento
Nota: Esistono strategie, tuttavia, indipendentemente dall'approccio alla esatta, diretto sequenziamento di entrambi i filamenti diversi di sequenziamento è obbligatorio per garantire un risultato affidabile.
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Protocolli di sequenziamento generale
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<li>Se l'amplificazione è stata eseguita utilizzando primers singola, procedere utilizzando l'appropriato IGHV - e IGHJ - o costante regione-specifico primer di sequenziamento. Questo approccio può anche essere adottato qualora multiplexed fluorescente con etichetta primer sono stati utilizzati e il prodotto PCR è stato valutato mediante analisi del frammento (primer di sequenziamento non deve essere etichettato).</li>
		<li>Se sono stati utilizzati primer multiplex e clonalità è stata valutata su un gel, quindi utilizzare un primer a valle nella prima fase di sequenziamento ad es. un consenso primer IGHJ con la sequenza 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 '. In alternativa, può essere utilizzato un primer CH se cDNA è stato utilizzato come substrato. Successivamente, utilizzare sottogruppo specifico IGHV leader o primer FR1 per il secondo passaggio di sequenziamento.</li>
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	<li>
Protocollo di sequenziamento di esempio Nota: Esistono diversi protocolli di sequenziamento e un protocollo di esempio è descritto di seguito.<ol>
<li>Diluire 33 ng del prodotto della PCR in un volume totale di 11,5 µ l utilizzando, per esempio, acqua sterile. Denaturare il prodotto PCR di riscaldamento a 95 ° C per 5 minuti. Mettere immediatamente in ghiaccio per 10 minuti per impedire la formazione di strutture secondarie.</li>
		<li>Aggiungere 8 µ l di master mix in ogni provetta con 0,5 µ l (corrispondente a 5 pmol) del primer.</li>
		<li>Come controllo, preparare una provetta contenente 8 µ l di master mix, il modello di controllo pUC18 0,5 µ l, 2 primer di sequenziamento 47 µ l (-) e 9,5 acqua sterile µ l. Il volume totale finale in ogni tubo dovrebbe essere 20 µ l.</li>
		<li>Utilizzare condizioni termiche in bicicletta per la reazione di sequenziamento come dettagliato nella tabella 4.</li>
		<li>Preparare la soluzione di arresto mescolando 2 µ l di acetato di sodio 3M (pH 5.2), 2 µ l EDTA 100 Mm (pH 8.0) e 1 µ l di glicogeno (concentrazione di 20 mg/mL), quindi aggiungere 5 µ l di ciascun campione. Trasferire il prodotto ad un nuovo tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Aggiungere 60 µ l di etanolo al 100% (-20 ° C) e mescolare delicatamente. Centrifugare a 14.000 rpm per 15 minuti (4 ° C). Scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di etanolo al 70% (-20 ° C) e mescolare delicatamente. Centrifugare a 14.000 rpm per 10 minuti (4 ° C). Scartare il surnatante. Ripetere una volta.</li>
		<li>Asciugare il pellet per 90 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 40 µ l di sodio dodecil solfato soluzione (SDS) per ogni campione.</li>
		<li>Trasferire il campione ad una piastra di sequenziamento, coprire con striscia tappi o guarnizioni di nastro, caricare alla macchina ed eseguire Sanger sequenziamento. La piastra di sequenziamento è solitamente un 96 pozzetti, fondo v, piastra PCR a pieno-gonna compatibile con il sequencer. Le piastre possono essere con codice a barre a seconda se deve essere eseguita internamente il sequenziamento, presso una società commerciale o presso una centro accademico sequenziamento/piattaforma.</li>
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</li>
	<li>Dopo la sequenziazione, 'cucire insieme' la 2 legge generati dalla procedura di sequenziamento individuali per formare un completo IGHV gene riarrangiamento cioè, la sequenza di consenso.</li>
</ol>6. l'analisi di sequenza
Nota: L'attenzione di sezioni seguenti per l'output ottenuto dal IMGT/V-QUEST tool30 quando si analizzano riorganizzate sequenze di IG e IMGT/JunctionAnalysis31, entrambi i quali sono particolarmente rilevanti per segnalazione clinica e ricerca studi. IMGT/V-QUEST è uno strumento di allineamento che confronta l'utente presentato sequenze di IG con la directory di riferimento IMGT imposta30. L'output dello strumento comprende diverse sezioni all'interno del quale l'utente può definire alcuni parametri.
<ol><li>Specificare la specie, per esempio, Homo sapiens (umane) e tipo di recettore o locus (ad es. IGH, IGK o IGL).</li>
	<li>Incollare le sequenze devono essere analizzate, in formato FASTA e tra cui intestazioni, nell'area di testo (in gruppi di fino a 50 sequenze per corsa). In alternativa, è disponibile un'opzione per immettere il percorso di un file locale contenente le sequenze FASTA.</li>
	<li>Scegliere una delle seguenti opzioni di 3 visualizzazione per i risultati:<ol>
<li>Visualizzazione dettagliata: scegliere questa opzione per ottenere i risultati per ogni sequenza singolarmente.</li>
		<li>Vista di sintesi: scegliere questa opzione per compilare una tabella riassuntiva ordinata per nome del gene e allele IGHV o da ordine della sequenza di input. Questa opzione fornisce anche un allineamento di sequenze che, qualsiasi batch inviato, sono assegnate alla stesso gene IGHV e allele.</li>
		<li>File di Excel: scegliere questa opzione per fornire tutti i file di output come fogli di calcolo incorporati in un unico file. Tutte le opzioni di visualizzazione hanno una grande selezione dei parametri di base e avanzate da scegliere, tuttavia soltanto i fattori più pertinenti per l'analisi di sequenza CLL IG sono discussi di seguito nella sezione 'Rappresentante risultati'.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. arresto/AssignSubsets strumento
<ol><li>Per studiare l'assimilazione di IG di BcR all'interno di CLL (ulteriori informazioni fornite di seguito nella sezione 'Rappresentante risultati'), inviare sequenze di IGHV-IGHD-IGHJ FASTA della strumento di arresto/AssignSubsets32. Lo strumento indica che l'assegnazione al CLL principali stereotipati sottoinsiemi. Lo strumento di sottoinsieme-assegnazione insieme con le istruzioni dettagliate sono disponibili sul sito Web arresto/AssignSubset32 e anche sul sito di ERIC sotto la scheda servizi.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).</li><li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+where+do+we+stand+how+do+we+proceed?.">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?.</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li><li>Sutton, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors.">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li><li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL:+Updated+results+of+the+CLL8+trial.">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li><li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fludarabine,+cyclophosphamide,+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia.">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+diagnosis,+indications+for+treatment,+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li><li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations:+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936.">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li><li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. 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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi rilevante di divulgare.

Lo studio dei geni IG in CLL è stato vitale non solo per fornire una migliore comprensione nella patobiologia di malattia ma anche per migliorare la stratificazione del rischio del paziente. È quindi fondamentale che la procedura multi-step di analisi di sequenza del gene di IG e successiva interpretazione dei dati di sequenza viene eseguite in un modo standardizzato. La disponibilità di materiale paziente adeguata e sufficiente e i tempi di campionamento non dovrebbe avere un impatto sulla capacità di eseguire analisi mutazionale del gene IG, dal momento che il test può essere eseguito su PB e su ogni campione con un alto conteggio delle cellule del tumore CLL. La separazione di cellule mononucleari di anima usando metodi di separazione gradiente è effettuata ordinariamente nei laboratori diagnostici, e come sempre, cura dovrebbe essere presa quando si aggiunge la soluzione di sangue/RPMI nella provetta contenente il gradiente; Questa operazione deve essere eseguita in modo lento e delicato per evitare di disturbare il gradiente e prevenire la perdita di cellule.
A seguito di separazione cellulare, vengono estratti gli acidi nucleici. Sia gDNA e cDNA sono adatti per l'analisi SHM della riorganizzazione clonotypic IGH, tuttavia, ci sono vantaggi e svantaggi per l'utilizzo di qualsiasi materiale. Il flusso di lavoro di laboratorio procede più rapidamente quando si utilizza gDNA poiché nessuna trascrizione inversa deve essere eseguita prima dell'amplificazione di PCR. Detto questo, utilizzando gDNA come substrato per la PCR può provocare l'amplificazione delle riorganizzazioni sia produttive e improduttive, che, a sua volta, può portare a ulteriori laboratorio hands-on, cioè, purificazione o l'asportazione del gel di più prodotti PCR e sequenziamento individuo di tutte le riorganizzazioni. Quando si confrontano gli approcci gDNA e cDNA, per quest'ultimo, un passaggio di trascrizione inversa deve essere eseguita prima di procedere con l'amplificazione di PCR. Tuttavia, in questo caso, per la maggior parte dei casi, solo le riorganizzazioni produttive di IG saranno amplificate e successivamente sequenziate. Così, solo un unico prodotto PCR sarà purificato e sequenziato, mentre l'interpretazione dei risultati è più semplice.
L'efficienza di amplificazione dipende in larga misura la qualità del gDNA/cDNA, che dovrebbero essere valutato utilizzando un metodo di quantificazione sensibili e i primer utilizzati. I primers utilizzati sono fondamentali per l'intera procedura analitica perché la determinazione accurata del livello di SHM può essere raggiunto solo amplificando l'intera sequenza del gene IGHV riarrangiato. Un riarrangiamento full-length può essere valutato solo se vengono utilizzati 5' primer di leader IGHV, giustificando così le recenti raccomandazioni da ERIC per l'uso di leader primer27. L'uso di primers alternativi, che conducono all'amplificazione delle riorganizzazioni di gene IGHV-IGHD-IGHJ incomplete, non è appropriato per l'analisi mutazionale del gene IGHV e quindi fortemente sconsigliato. La sola eccezione relativamente ai casi che ripetutamente producono risultati negativi quando IGHV leader gli iniettori sono utilizzati e analisi del materiale nuovo paziente è non possibile o anche fa non dare risultati. Se l'uso di diversi campioni dei pazienti e/o materiale (gDNA/cDNA) e vari primer imposta ancora non riescono a produrre un prodotto PCR, possibili ragioni potrebbero essere che il carico delle cellule del tumore è troppo basso o che linfocitosi non è a causa di un clone CLL (nel qual caso il immunophenotype deve essere rivalutato). Primer usati per l'analisi deve sempre essere indicato nel rapporto clinico.
Come CLL deriva dall'accumulazione delle cellule di B monoclonali recanti la stessa riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ, per la stragrande maggioranza del clonality casi valutazione rivelerà un unico picco monoclonale, vale a dire, un singolo clone. In rare occasioni, doppio riorganizzazioni o anche modelli di oligoclonal possono essere osservati35. In tali casi, l'elettroforesi del gel non è la tecnica preferita per la valutazione di clonalità e metodi più sensibili come l'analisi del frammento devono essere applicati. Una volta confermata la clonalità, il passaggio finale prima del sequenziamento si riferisce alla purificazione del prodotto della PCR per garantire che le sequenze di alta qualità sono ottenute. Infine, lo strumento IMGT/V-QUEST è la risorsa consigliata per l'analisi di sequenza IG di ERIC. Come i database IMGT sono costantemente aggiornati e relazione risultati in maniera coerente e ben commentato, questo strumento garantisce analisi standardizzate e facilita l'analisi comparativa tra diverse strutture cliniche o accademici.
Come immunogenetici analisi in CLL ha prognostico e, in particolare, implicazioni predittive, robusta analisi della riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ tra cui l'assegnazione ai principali sottoinsiemi CLL stereotipato, non è più solo auspicabile, ma di fondamentale importanza. Ciò è particolarmente evidente in questa epoca di approcci terapeutici e le potenzialità che l'analisi del gene IG ha per guidare il trattamento decisioni5,21,22,23,36,37 ,38, come ufficialmente indicato dal recente aggiornamento delle linee guida NCI-sponsorizzato dall'International Workshop on CLL24. Che ha detto, rigorosi standard sono garantiti, soprattutto come determinazione dello status della clonotypic SHM riorganizzate gene IGHV nei pazienti con LLC non è una questione banale e coinvolge un processo multi-step. Soprattutto, determinate fasi sperimentali, in particolare la scelta dei primer, resa risultati superiori quando specifiche opzioni e/o approcci siano rispettati, altri aspetti tecnici sono favorevoli ad un certo grado di flessibilità, come ad esempio la scelta dei materiali o il Metodo per valutare la clonalità, dovuto al fatto che conducono a sottili differenze, se del caso, per quanto riguarda i risultati finali.
Nell'ultimo decennio, ERIC ha cercato di promuovere la standardizzazione e l'armonizzazione dei vari metodi pertinenti alla predizione e diagnostica CLL. Questo si riflette le raccomandazioni pubblicate e gli orientamenti per analisi immunogenetica27,34, numerosi laboratori didattici organizzati ed eventi, l'istituzione di una rete di IG, come pure un forum online esperto per discutere e fornire indicazioni sull'interpretazione di sequenza genica IG in CLL. L'obiettivo generale di ERIC attraverso queste azioni è quello di promuovere la gestione clinica ottimale e cura del paziente. Malgrado gli sforzi intensi, questo compito è lungi dall'essere completa e infatti è diventata più complesso a causa lo sviluppo del romanzo high throughput sequenziamento puntato profilatura immuni. Tuttavia, anche se rimangono problemi, intensi sforzi per la standardizzazione robusto di analisi del gene IG in CLL continuano e sono attualmente al centro delle attività in corso all'interno di ERIC.

Leucemia linfocitaria cronica (CLL), la forma più comune di leucemia negli adulti nei paesi occidentali, è caratterizzata dall'espansione clonale di cellule di B mature neoplastici1. Da una prospettiva clinica, il decorso della malattia è estremamente variabile, con alcuni pazienti vivendo una malattia aggressiva, che richiede un trattamento molto presto dopo la diagnosi e spesso recidivante o di essere refrattario alla terapia. Questo è in netto contrasto con una percentuale sostanziale di pazienti (circa il 30%) che presentano una malattia indolente, mai richiedono un trattamento e hanno un'aspettativa di vita simile a individui sani di pari età2. Questa eterogeneità clinica si riflette nella diversità delle anomalie molecolari trovati nei pazienti di CLL che guidano in ultima analisi, la patogenesi e la progressione di questa malattia3.
Stabilire che una diagnosi esatta di CLL è di solito semplice, tuttavia, l'eterogeneità clinica di cui sopra può ostacolare la gestione efficace dei pazienti con LLC e sottolinea la necessità di marcatori prognostici e predittivi che potrebbe contribuire a decisionale del trattamento2. Numerosi studi hanno tentato di perfezionare il pronostico di CLL, culminando in un'abbondanza di nuovi marcatori clinici e biologici, essendo proposto4. Lo stato mutazionale del gene clonotypic immunoglobulina pesante variabile (IGHV) è uno degli indicatori prognostici più robusti in CLL, in gran parte a causa del fatto che (i) rimane stabile nel tempo e come la malattia progredisce, e (ii) è indipendente da altro i parametri clinici e biologici5. Che nonostante ciò, gli indicatori molto pochi, se del caso, compreso lo stato mutazionale IGHV, sono attualmente applicati nella routine clinica al momento della diagnosi.
I primi rapporti sull'utilità clinica di sequenziamento del gene IG in data CLL già nel 1999, quando 2 studi indipendenti ha riferito che i pazienti con no o un carico minimo hypermutation somatico (SHM) (unmutated CLL, U-CLL) hanno una prognosi peggiore rispetto ai pazienti che trasportano un maggiore carico SHM (mutato CLL, M-CLL)6,7. Più specificamente, il gruppo U-CLL ha consistito dei casi che harboring geni IGHV clonotypic con pochi o nessun SHM e quindi un'alta percentuale identità al gene IGHV più germinale (≥ 98%), mentre M-CLL ha consistito dei casi con un più alto carico mutazionale (percentuale identità per la più gene IGHV di germline < 98%). Da questi primi studi, è stato continuamente dimostrato che U-CLL casi visualizzano un trattamento più breve di tempo-a-primo (TTFT) e la sopravvivenza globale (OS) rispetto a M-CLL.
Col senno di poi, questi studi seminali ha evidenziato il ruolo fondamentale del recettore delle cellule B (BcR) IG nella patobiologia CLL, spianando così la strada per ricerche approfondite in CLL-microambientali interazioni che, a sua volta, ha condotto ad un apprezzamento più completo di l'eterogeneità biologica di questa malattia8,9. Gli studi più recenti hanno fornito ulteriore supporto per l'importanza delle analisi immunogenetica in CLL rivelando che singoli casi possono cluster in sottogruppi a causa della condivisione (quasi) identiche sequenze del gene BcR IG, un fenomeno definito stereotypy BcR IG10 ,11,12,13. Raccogliendo la prova sostiene la nozione che i pazienti assegnati a stesso sottoinsieme stereotipato harbor simili dati proprietà che chiaramente li separano da altri pazienti CLL all'interno della stessa categoria SHM, ma con diverse sequenze del gene IG; infatti è stato segnalato che la categorizzazione dei pazienti CLL basato su assimilazione di BcR IG ulteriormente affina la segregazione di massa di pazienti affetti da LLC in U-CLL o M-CLL gruppi14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Da un punto di vista clinico, è da nota che lo stato SHM del gene IGHV clonotypic sembra correlare con una risposta specifica alle chemio e immuno terapia. In particolari, pazienti di M-CLL trattati con una combinazione di fludarabina/ciclofosfamide/rituximab (FCR), il trattamento di parità aurea per pazienti affetti da LLC medicamente fit privo di difetti del gene TP53 , hanno esibito significativamente più libera da progressione Survival (PFS) e OS rispetto a U-CLL pazienti che hanno ricevuto il trattamento stesso, il21,22,23. Di conseguenza, identificazione dello status SHM è diventato importante in particolare per assistere nella gestione terapeutica di CLL pazienti , cioè, un marker predittivo, piuttosto che per valutare il decorso clinico della malattia cioè, un indicatore prognostico. Infatti, secondo il recente aggiornamento delle linee guida NCI-sponsorizzato dall'International Workshop on CLL, lo status SHM di geni IGHV riorganizzati dovrebbe essere determinato in tutti i casi di LLC prima dell'inizio del trattamento in entrambi pratica generale e clinica prove24. Inoltre, a causa della recente approvazione della agenti di trattamento novello e il numero crescente di farmaci nelle prove, lo stato SHM della molecola IG può svolgere un ruolo ancora maggiore nella gestione terapeutica dei pazienti con CLL in futuro vicino5.
Questo rapporto dettaglia tutti gli aspetti dell'analisi di sequenza del gene di IG, cominciando con la scelta del materiale adatto e che si conclude con l'interpretazione clinica dei risultati di sequenziamento. Valutazione approfondita di questi passaggi è importante nella routine diagnostica per la produzione di risultati affidabili e per garantire il paziente accurata stratificazione all'interno di studi clinici. Protocolli sono forniti per facilitare l'armonizzazione in materia di analisi di sequenza del gene di IG, garantendo così che i risultati sono comparabili tra i diversi laboratori.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

Durante la maturazione delle cellule B, il complesso processo di ricombinazione di V (D) J del gene dell'immunoglobulina (IG) accoppiato con hypermutation somatico (SHM) dà luogo a una sequenza di DNA unica all'interno di ogni singola cellula di B. Dato che le malignità delle cellule di B il risultato di espansione clonale di una singola cella, geni IG rappresentano un'unica firma molecolare comune a tutte le cellule maligne all'interno di un singolo paziente; così, le riorganizzazioni di gene di IG possono essere utilizzate come marcatori clonali. Oltre a servire come un importante identificatore clonale, la sequenza del gene IG può agire come un 'timeline molecolare' poiché è associato a specifiche fasi di sviluppo e quindi riflette la storia della cellula B coinvolta nella trasformazione neoplastica. Inoltre, per determinate malignità, in particolare leucemia linfocitaria cronica (CLL), la sequenza del gene IG tiene capacità prognostica e potenzialmente predittive. Detto questo, estrapolare conclusioni significative dall'analisi di sequenza del gene IG sarebbe impossibile se strumenti e metodi robusti non erano disponibili per aiutare nella loro analisi. In questo articolo, sulla base della vasta esperienza dell'iniziativa europea di ricerca sul CLL (ERIC), dettagli gli aspetti tecnici e requisiti essenziali necessari per garantire l'analisi di sequenza di gene affidabile e riproducibile IG in CLL, un test che è ora raccomandato per tutti i pazienti CLL prima del trattamento. Più specificamente, le varie fasi analitiche sono descritti che vanno da identificare la riorganizzazione di gene clonotypic IG e la determinazione della sequenza del nucleotide per l'accurata interpretazione clinica dei dati di sequenza del gene di IG.

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Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Qui, presentiamo un protocollo che dettagli gli aspetti tecnici e requisiti essenziali affinché robusta analisi di sequenza del gene di IG in pazienti con la leucemia linfocitaria cronica (CLL), basato sull'esperienza accumulata dell'iniziativa di ricerca europea su CLL (ERIC).

Analisi di sequenza di Gene dell'immunoglobulina nella leucemia linfocitaria cronica: Da materiale paziente all'interpretazione di sequenza

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della leucemia linfocitica cronica, come la prognosi accurata dei pazienti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, veloce e altamente accurata. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una robusta prognosticazione, in particolare certificazioni di rischio con pazienti con leucemia linfocitica cronica perché l'accurata prognosticazione può successivamente definire la gestione terapeutica della malattia.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, ad esempio la selezione del prodotto PCR e i tipi di analisi della sequenza di digest sono difficili da imparare perché richiedono precisione ed esperienza. Per iniziare questa procedura, aggiungere 200 microlitri di EDTA a un tubo di raccolta sterile da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di sangue periferico e 15 millilitri di mezzo RPMI al tubo e pipetta su e giù da due a tre volte per mescolare.Aggiungere quindi 15 millilitri di gradiente di densità medio a un nuovo tubo di raccolta da 50 millilitri. Sovrapporre lentamente la soluzione di sangue periferico sul mezzo gradiente di densità, assicurandosi che non interrompa il gradiente. Centrifuga a 800 volte G per 20 minuti con il freno di centrifuga spento.Quindi utilizzare una pipetta Pasteur sterile per raccogliere l'anello cellulare mononucleare che si è formato tra lo strato piastrinica al plasma superiore e lo strato medio gradiente di densità e trasferirlo in un nuovo tubo sterile di raccolta da 15 millilitri. Aggiungere il mezzo RPMI in modo che il volume finale sia di 12 millilitri e pipettare la soluzione su e giù per mescolare. Centrifuga a 800 volte G per otto minuti.Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare con 10 millilitri di mezzo RPMI. Centrifugare di nuovo a 750 volte G per otto minuti. Successivamente, scartare il supernatante e sciogliere il pellet cellulare in un millilitro di PBS.Utilizzando una nuova piastra Bauer, formare un conteggio delle cellule mescolando 20 microlitri di campione e 80 microlitri di una o 10 soluzioni turche. Se la lavorazione a valle del campione non è programmata per lo stesso giorno, centrifugare il campione a 750 volte G per otto minuti. Scartare il supernatante e conservare il pellet di cellule a meno 80 gradi Celsius.In primo luogo, preparare la miscela di primer utilizzando quantità equimolari di ogni primer del sottogruppo per garantire un'amplificazione imparziale. Mescolare i reagenti PCR elencati nella tabella due del protocollo di testo. Aggiungere 0,5 microlitri di TAP polimerasi al tubo PCR contenente i reagenti PCR misti.Quindi, aggiungere 100 nanogrammi di gDNA o due microlitri di cDNA. Eseguire il protocollo PCR termico come descritto nella tabella tre del protocollo di testo. Successivamente, verificare la presenza di prodotti PCR di circa 500 coppie di basi quando si utilizzano primer IGHV litri o 350 coppie di basi quando si utilizzano le miscele di primer IGHPFR1.Per iniziare la purificazione del prodotto PCR, caricare il volume totale del prodotto PCR su un gel di agarosio a bassa fusione del tre per cento. Consentire ai prodotti PCR di funzionare sul gel fino a quando non si separano dallo sfondo. Asportare le bande PCR prominenti e quindi purificarle ed eluirle.Se vengono rilevati due riarrangiamenti, entrambe le bande devono essere asportate e sequenziate separatamente. Per eseguire la pulizia exo-sap, seguire le istruzioni del produttore relative ai volumi specifici da utilizzare. Vortice delicatamente ogni campione per mescolarli e incubarli su un blocco PCR a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Inattivare gli enzimi riscaldandoli a 85 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, caricare una piccola quantità di prodotti PCR su un gel di agarosio del tre per cento per valutare la purezza del prodotto. L'ultimo checkpoint prima del sequenziamento è determinare la clonalità del campione utilizzando l'analisi dei frammenti.Per iniziare ad analizzare la sequenza, avviare il software appropriato. Specificare la specie, ad esempio l'homo sapiens, e il tipo di recettore o locus. Esegui il passo delle sequenze da analizzare in formato fasta e includendo gli identificatori nell'area di testo in lotti fino a 50 sequenze per esecuzione.Quindi, scegliere una delle tre opzioni di visualizzazione seguenti per i risultati. Vista dettagliata:scegliete questa opzione per ottenere singolarmente i risultati per ogni sequenza. Vista di sintesi:scegliere questa opzione per compilare una tabella di riepilogo ordinata dal gene IGHV e dal nome dell'allele o dall'ordine di input della sequenza.Questa opzione fornisce anche un allineamento delle sequenze che in qualsiasi batch inviato sono assegnate allo stesso gene E allele IGHV e, infine, al file Excel. Scegliere questa opzione per fornire tutti i file di output come fogli di calcolo incorporati in un unico file. Solo l'uso di primer da litro IGHV consente l'amplificazione dell'intera lunghezza dell'IGHV riorganizzato, consentendo così di determinare il vero carico HSM.Il prodotto PCR previsto è di circa 500 coppie di basi. In rari casi in cui i primer da litro IGHV non possono amplificare il riarrangiamento clonotipico IG, possono essere utilizzati primer IGHBFR1. Il prodotto PCR previsto è di circa 350 coppie di basi.Le sequenze ottenute vengono quindi analizzate utilizzando lo strumento IMG TV Quest. La prima riga della tabella dei risultati afferma la funzionalità della sequenza, poiché una sequenza riarrangiata IG può essere produttiva o improduttiva. Un riarrangiamento genico IGH è improduttivo è che i codoni stop sono presenti all'interno della regione VDJ e /o se il riarrangiamento è fuori dal fotogramma a causa di inserimenti / deduzioni.È importante notare che solo i riarrangiamenti produttivi e quindi funzionali dovrebbero essere ulteriormente analizzati. Quando si utilizzano i parametri predefiniti di IMG TV Quest, gli inserimenti e le eliminazioni non vengono rilevati automaticamente, tuttavia indicazioni forti che una sequenza può portare tali modifiche sono fornite dallo strumento e un avviso appare sotto la tabella di riepilogo dei risultati. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di atterrare i prodotti PCR sul gel abbastanza a lungo in modo che il legame clonale possa essere discriminato dallo sfondo policlonale.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunogenetica della leucemia linfocitica cronica per esplorare l'impatto prognostico dello stato di epimutazione somatica nei pazienti. Non dimenticare che lavorare con il bromuro di etilico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come lavorare sotto il cofano in ogni momento dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Istituzione e analisi di organidi tridimensionali (3D) Derivati dagli spettri della metastasi ossea del cancro della prostata del paziente e dai loro xenoinfi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Frazione subcellulare delle cellule linfonetiche croniche primarie per monitorare il traffico di proteine nucleari/citoplasmiche

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...