Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
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私たちは彼らのコミットメントと CLL に免疫遺伝学の研究に熱意の研究グループ、IgCLL グループとエリックは、現在と過去のメンバーに感謝します。また全員 IMGT/CLL-DB イニシアチブと、特に、教授マリー = ポール ・ Lefranc と Dr ヴェロニク Giudicelli、d'Immunogenetique らが参加した Moleculaire、LIGM、大学の信頼のコラボレーションを認識したいと思いますモンペリエ II、モンペリエ、フランス、IMGT、国際学会情報システムは、彼らの巨大なサポートし、IG 遺伝子のシーケンス解析に役立ちます。この作品は TRANSCAN 179 小説 JTC 2016 年; からの補助金によって一部にはサポートラ Ricerca スル Cancro AIRC (捜査官グラント #20246 および特別なプログラム分子臨床腫瘍学-5 パーミル #9965) あたり Associazione イタリア、ミラノ、イタリア;における地域再生戦略・ ディ ・ Rilevante インテレッセ ナツィオナーレ通り (プリント) # 2015ZMRFEA、MIUR、ローマ, イタリア;スウェーデン癌協会、スウェーデン研究評議会、クヌートとアリス バレンベリー財団、カロリンスカ研究所、ウプサラ大学、ウプサラ大学病院とライオンのがん研究振興財団、ウプサラ;オデュッセウスのプログラム、「アクションの戦略的な開発研究と技術分野」、オペレーション プログラム「競争力、アントレプレナーシップおよびイノベーション」によって資金を供給下で実施 (NSRF 2014 年-2020 年) ギリシャの協調融資と欧州連合 (欧州地域開発基金)。

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著者はある関連する利益相反を開示します。

CLL の IG 遺伝子の研究は、だけでなく疾患病態により良い理解を提供するため、また患者のリスク層別化を改善するために重要されている.したがって、IG 遺伝子配列解析のマルチ ステップの手順とシーケンス データのそれに続く解釈が標準化された方法で実行されることが重要です。適切かつ十分な患者材料の可用性、およびサンプリングのタイミングは PB と高 CLL 腫瘍細胞数と任意のサンプル テストを実行することができますので、IG 遺伝子変異解析を実行する能力に影響する必要があります。勾配分離方法を使用して血単核細胞の分離は、診断研究所で行われる日常的に、いつものようにケアをグラデーションを含むチューブに血液/RPMI ソリューションを追加するときに取られるべきこの作業は、グラデーションを妨害を避けるために、細胞の損失を防ぐためにゆっくりと、穏やかな方法で実行する必要があります。
次の細胞分離、核酸を抽出します。両方の cDNA と gDNA SHM clonotypic IGH の転位の解析に適しています、しかし、どちらかの材料の使用の長所と短所があります。PCR の拡大の前に実行される逆のトランスクリプションを持たないので gDNA を使用するとき、研究室ワークフローは速く進みます。言われて、順番に、追加の実践的な研究作業、すなわち、浄化または複数の PCR の製品のゲル切り出しにつながることができる生産的かつ非生産的な語順換えの増幅 PCR 用基板として gDNA を使用してすべて再編成の個々 のシーケンス。CDNA と gDNA アプローチを比較すると、後者逆のトランスクリプション ステップ実行する必要が前に PCR の拡大。ただし、ほとんどの場合、このインスタンスの生産的な IG 再編成のみ増幅されその後シーケンスします。したがって、PCR の製品は 1 つだけを精製した、シーケンス、結果の解釈はより簡単ですが。
増幅の効率は、敏感な定量化と利用したプライマーを使用して査定されるべき gDNA/cDNA の質によって大きく異なります。使用されるプライマーは、SHM レベルの正確な測定は、再配置の IGHV 遺伝子の全体のシーケンスを増幅することによってのみ実現できますので全体の分析手順に重要です。フルレングスの転位は、エリックの推奨事項は、最近の使用のリーダー プライマー27を正当化するため、5' IGHV リーダーのプライマーを使用する場合にのみ評価できます。不完全な IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子の語順換えの増幅につながる代替のプライマーの使用 IGHV 遺伝子変異解析には適していません、したがってに対して強く助言します。唯一の例外は IGHV リーダーのプライマーを使用する場合、繰り返し否定的な結果を生成する場合に関連し、新しい患者材料の解析がされていない可能かもしない結果が得られない。原因は腫瘍細胞量が低すぎると、リンパ球増加は、原因が CLL クローンかもしれない別患者の検体や材料 (gDNA/cDNA) および様々 なプライマーの使用は、PCR の製品を生産するはまだ失敗を設定する場合 (その場合、イムノフェノ タイプする必要があります再評価される)。分析のために使用されるプライマーは、臨床レポートで常に記載すべき。
CLL は IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成は、同じ単クローン性 B 細胞の蓄積の結果、大多数の場合クローナリティの評価を明らかにするユニークなモノクローナル抗体ピーク、すなわち、単一のクローン。まれに、ダブル再編成またはオリゴグローナル パターンも生じることが35。このような場合は、ゲルの電気泳動は、クロナリティのため最寄りの方法とフラグメント解析などのより敏感な方法を適用する必要があります。一度クローナリティを確認すると、シーケンスの前に最後のステップ シーケンスの高品質が得られることを確保するため PCR の製品の浄化に関連します。最後に、IMGT/V-クエスト ツールはエリックが IG シーケンス解析の推奨リソースです。IMGT データベースが常に更新され、一貫したとも注釈の方法の結果を報告このツールにより、標準化された分析、臨床や学術の施設間での比較分析が容易になります。
CLL の免疫遺伝学的解析、予後と、特に予測への影響、主要な CLL に割り当てを含む IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成のロバスト解析ステレオタイプのサブセット、はやだけ望ましいが重要な鍵です。これは特に明らか治療薬、免疫グロブリン遺伝子解析が治療決定5,21,22,23,36,37 をガイドしている潜在的なこの時代に ,38, CLL24国際ワーク ショップから nci ガイドラインの最近のアップデートで公式に示されます。厳格な基準が保証されます、特に、clonotypic の SHM 状態の定量は、CLL の患者における IGHV 遺伝子を再配置、些細な問題ではないと複数の手順が含まれます。重要なは、特定の実験の手順、特にプライマー、特定のオプションやアプローチ、優れた結果が得られますの選択が守られて、他の技術的な側面は、材料の選択などの柔軟性のある程度または、場合は、最終的な結果について、彼らは微妙な違いにつながるという事実のために、クローナリティを評価するための方法。
最後の 10 年間、エリックは、標準化と CLL の診断および前兆に関連するさまざまな方法の調和を促進するために努めて参りました。これは出版された推薦と免疫遺伝学的解析27,34, 多くの整頓されていた教育ワーク ショップやイベントに専門家のオンライン フォーラムと同様、IG ネットワークの確立のためのガイドラインに反映されます。話し合うし、CLL の IG 遺伝子シーケンスの解釈に関するガイダンスを提供します。これらのアクションによってエリックの全体的な目標は、最適な診療と患者のケアを促進するためです。強烈な努力にもかかわらずこのタスクは、程遠いですし、実は免疫プロファイリングを目指した新規高スループット シーケンスの開発により複雑になっています。それにもかかわらず、課題を永続化、CLL の IG 遺伝子解析の堅牢な標準化のための集中的な努力を続ける、エリック内で継続的な活動の焦点は、現在。

慢性リンパ性白血病 (CLL)、西部国で成人の白血病の最も一般的な形式は、1成熟腫瘍性 B 細胞のクローン性増殖によって特徴付けられます。病気のコースは臨床的観点から、積極的な病が発生して、診断後非常に早期の治療を必要として多くの場合再発されたり療法に不応性患者の一部と非常に変数です。これは無痛症を提示、治療を必要とする、年齢をマッチさせた健常者2のような平均余命 (~ 30%) の患者のかなりの割合は対照的です。この臨床の多様性は、最終的に病因と病3の進行駆動 CLL 患者が見つかりました分子異常の多様性に反映されます。
CLL の診断は通常簡単に確立すること、ただし、前述臨床不均質性 CLL 患者の効果的な管理を妨げる可能性がありで助けることができると予後予測マーカーの必要性を強調治療意思決定2。数多くの研究提案4をされている新しい臨床的および生物学的マーカーの豊富さで最高潮に達する、CLL の前兆を調整しようとしています。Clonotypic 免疫グロブリン重変数 (IGHV) 遺伝子の突然変異の状態は CLL、最も堅牢な予後マーカーの 1 つ主原因という事実に (i) それは安定したまま時間が経つと疾患の進行により、(ii)、他の独立しました。臨床的および生物学的パラメーター5。にもかかわらず、IGHV 突然変異の状態を含む場合、非常に少数のマーカーは、診断の時点で臨床に現在適用されています。
1999 年、2 つの独立した研究報告なしの患者がまたは最小限の体性 hypermutation (SHM) 負荷 (一 CLL、U CLL) まで遡って CLL 日 IG 遺伝子配列の臨床的有用性の最初の報告があるを運んでいる患者よりも予後が悪い、高い SHM 負担 (変異 CLL、M CLL)6,7。具体的には、ほとんどまたはまったく SHM と clonotypic IGHV 遺伝子の場合成っていた U CLL グループおよびそれ故に最も近い生殖 IGHV 遺伝子 (≥98%)、高 % のアイデンティティ M CLL から成っていた高い突然変異荷重症例に対し (パーセントの id、最も近い生殖 IGHV 遺伝子 < 98%)。これらの初期の研究からそれが継続的には実証されて U CLL 例が短い時間に最初の治療 (TTFT) と M CLL と比較して全生存期間 (OS) を表示すること。
後知恵で、これらの種子の研究強調 B 細胞の受容器 (BcR) IG CLL の病理学のための道筋の極めて重要な役割広範な研究を順番より包括的な円高につながった CLL 内微小環境の相互作用にこの疾患8,9の生物学的多様性。最近の研究は、個々 のケースがクラスターのサブセット (準) 同一 BcR IG 遺伝子を共有しているために明らかにして CLL の免疫遺伝学的解析の重要性追加のサポートを提供している、現象と呼ぶ BcR IG 常同症10 ,11,12,13。プロパティに割り当てる同じステレオタイプ化されたサブセット港と同様 clinicobiological 明確に異なる IG 遺伝子シーケンスに対して、同じ SHM カテゴリ内他 CLL 患者からそれらを分離する患者が概念をサポートする証拠の蓄積確かに、U CLL または M CLL グループ14,15,16,に CLL 患者の一括分離を BcR IG 常同症さらに基づく CLL 患者の分類に精製報告されています17,18,19,20。
臨床的観点からは、SHM ステータス clonotypic IGHV 遺伝子の誘導に固有の応答と相関するようであることは注目に値するです。特に、M CLL 患者におけるフルダラビン/シクロホスファミド/リツキシマブ (FCR) の併用治療、 TP53遺伝子欠陥を欠けている医学的に不適当の CLL の患者のための金本位治療展示大幅に長く無増生存 (PFS) と同じ治療21,22,23を受けた U CLL 患者と比較して OS。したがって、SHM 状態の同定が重要になって特に CLL 患者などの治療管理の予測マーカーを支援ではなく、病気などの臨床経過を評価するため、予後マーカー。実際には、CLL 国際ワーク ショップから nci ガイドラインの最近の更新によると再配置の IGHV 遺伝子の SHM 状態する必要があります CLL の場合一般的な実践の両方で治療開始前に決定し、臨床試験24。また、新規処理剤及び試験で薬剤の数の増加の最近の承認により免疫グロブリン分子の SHM 状態は近い将来5CLL の患者の治療の管理にも大きな役割を果たす可能性があります。
このレポートは、IG 遺伝子のシーケンス解析、適切な材料を選択すると、シーケンスの結果の臨床的解釈で最高潮に達する開始のすべての側面を詳しく説明します。これらの手順の詳細な評価は、診断ルーチン臨床試験内正確な患者層別化を確保するため信頼性の高い結果の生産のために重要です。IG 遺伝子のシーケンス解析、結果、異なる研究室の中で比較しないように調和を支援するプロトコルが提供されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

B 細胞の成熟に伴う免疫グロブリン (IG) 遺伝子 V (D) J の組み変えの複雑なプロセスは個々 の B セル内でユニークな DNA シーケンスに上昇する体性 hypermutation (SHM) とつながれます。IG 遺伝子が個々 の患者にすべての悪性細胞に一般的なユニークな分子シグネチャを表す単一細胞のクローン性増殖から B 細胞悪性腫瘍が原因で、したがって、免疫グロブリン遺伝子の再構成は、クローンのマーカーとして使用できます。重要なクローン識別子として機能に加えて、IG 遺伝子の塩基配列は、以来、特定の発達段階に関連付けられ、B 細胞腫瘍の変換に関与するの歴史を反映するそれ故に '分子タイムとして機能できます。また、特定の悪性腫瘍、特に慢性リンパ性白血病 (CLL) IG 遺伝子の塩基配列を保持予後および潜在的予測機能します。つまり、免疫グロブリン遺伝子のシーケンス解析から意味のある結論を外挿することは不可能だろう強力なメソッドやツール、分析のために使用されなかった場合。この記事は、CLL (エリック)、技術的な側面の詳細と CLL、今お勧めするテストの信頼性が高く、再現性のある IG 遺伝子配列解析をするために必要不可欠な要件に関する欧州研究イニシアティブの広大な経験上に描画治療前にすべての CLL の患者。具体的には、さまざまな分析段階、clonotypic IG 遺伝子転位の同定と塩基配列の決定から IG 遺伝子シーケンス データの正確な臨床的解釈に至るまでを説明します。

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Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

本明細書での欧州研究イニシアチブの蓄積された経験に基づいて技術的な側面の詳細および慢性リンパ性白血病 (CLL) 患者の堅牢な IG 遺伝子のシーケンス解析を確保するための必須要件をプロトコルを提案します。CLL (エリック)。

慢性リンパ性白血病の免疫グロブリン遺伝子のシーケンス解析: シーケンスの解釈に患者材料から

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

この方法は、患者の正確な予後など、慢性リンパ性白血病分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで高速で、非常に正確であることです。この技術の意味は、正確な予後が後に疾患の治療管理を定義する可能性があるため、強い予後、特に慢性リンパ性白血病患者に対するリスク認証にまで及ぶ。この方法の視覚的なデモンストレーションは、PCR製品の選択や消化順序解析タイプなど、精度と経験の両方を必要とするため、学習が困難であるなど、非常に重要です。この手順を開始するには、EDTAの200マイクロリットルを50ミリリットルの無菌コレクションチューブに加えます。チューブに末梢血20ミリリットルとRPMI培地15ミリリットルを加え、ピペットを2~3回上下に加えます。次に、15ミリリットルの密度勾配培地を新しい50ミリリットルのコレクションチューブに加えます。末梢血溶液を密度勾配培地にゆっくりと重ね、勾配を乱さないようにします。遠心分離機ブレーキをオフにして20分間Gの800倍で遠心分離機。次に、滅菌パスツールピペットを使用して、上部プラズマ血小板層と密度勾配媒体層の間に形成された単核細胞リングを収集し、それを新しい滅菌15ミリリットルの採取チューブに移します。最終容積が12ミリリットルになるようにRPMI培地を加え、溶液を上下にピペットして混ぜます。8分間Gの800倍で遠心分離機。上清を捨て、細胞ペレットを10ミリリットルのRPMI培地で再び懸濁させる。8分間Gの750倍で再び遠心分離機。この後、上清を捨て、細胞ペレットをPBSの1ミリリットルに溶解する。新しいバウアープレートを使用して、20マイクロリットルのサンプルと80マイクロリットルの1〜10ターク溶液を混合して細胞数を形成する。サンプルの下流処理が同日に予定されていない場合は、試料を8分間Gの750倍にして遠心する。上清を捨て、セルペレットをマイナス80度で保存します。まず、各サブグループプライマーの正モル量を使用してプライマーミックスを調製し、不偏増幅を確実にします。テキストプロトコルの表2に示すように、PCR試薬を混合します。混合PCR試薬を含むPCRチューブに、0.5マイクロリットルのTAPポリメラーゼを加えます。次に、gDNAの100ナノグラムまたは2マイクロリットルのcDNAを加えます。テキストプロトコルの表3に詳述されているように、サーマルPCRプロトコルを実行します。その後、IGHPFR1プライマーを混合する場合は、IGHVリットルプライマーまたは350塩基対を使用する場合、約500塩基対のPCR産物がないか確認してください。PCR製品の精製を開始するには、PCR産物の総容量を3%低融解アガロースゲルにロードします。PCR 製品がバックグラウンドから分離されるまでゲルで実行できるようにします。鋭い顕著なPCRバンドを切り出し、それらを浄化し、溶出する。2 つの再調整が検出された場合は、両方のバンドを切り離し、個別にシーケンスする必要があります。exo-sap のクリーンアップを実行するには、使用する特定のボリュームに関する製造元の指示に従ってください。各サンプルを穏やかに渦を混ぜて、37°CのPCRブロックで30分間混合してインキュベートします。酵素を摂氏85度に15分間加熱して不活性化します。この後、少量のPCR産物を3%のアガロースゲルにロードして、製品の純度を評価します。シーケンス処理の前の最後のチェックポイントは、フラグメント分析を使用してサンプルのクローン性を決定することです。シーケンスの分析を開始するには、適切なソフトウェアを起動します。ホモ・サピエンスなどの種、受容体の種類または遺伝子座を指定します。fasta 形式で分析するシーケンスをペースアップし、1 回の実行で最大 50 のシーケンスをバッチでテキスト領域に識別子を含めます。次に、結果の次の 3 つの表示オプションのいずれかを選択します。詳細ビュー:各シーケンスの結果を個別に取得するには、このオプションを選択します。合成ビュー:IGHV遺伝子と対立遺伝子名または配列入力順に並べ替えられた要約テーブルをコンパイルするには、このオプションを選択します。このオプションは、送信されたバッチ内の配列の配列のアライメントも提供し、送信されたバッチ内で同じ IGHV 遺伝子と対立遺伝子、最後に Excel ファイルに割り当てられます。すべての出力ファイルを 1 つのファイルに組み込まれたスプレッドシートとして提供します。IGHVリットルプライマーの使用のみ、再配列されたIGHVの全長の増幅を可能にし、したがって、真のHSM負荷を決定することを可能にする。PCR産物は約500塩基対です。IGHVリットルプライマーが凝固IG再配列を増幅できない稀な例では、IGHBFR1プライマーが使用され得る。PCR産物は約350塩基対です。取得したシーケンスは、IMG TVクエストツールを使用して分析されます。結果表の最初の行は、シーケンスの機能を示し、IG の並べ替え順序は、生産的または非生産的のいずれかである可能性があります。IGH遺伝子の再構成は、VDJ領域内に存在するコドンが停止し、挿入/欠失のために再構成がフレームから外れている場合に非生産的である。生産性と機能の再調整を更に分析する必要があることに注意することが重要です。デフォルトの IMG TV Quest パラメーターを使用する場合、挿入と削除は自動的に検出されませんが、シーケンスにこのような変更が含まれる可能性があることを示す厳密な兆候がツールによって提供され、結果の概要テーブルの下に警告アラートが表示されます。この手順を試みる場合、クローナル結合がポリクローナルの背景から識別できるように、PCR製品を十分に長くゲルに着陸させることが重要です。その開発後、この技術は、慢性リンパ球性白血病免疫遺伝学の分野の研究者が患者の体細胞エピ突然変異状態の予後的影響を探求する道を開いた。臭化エチリウムで作業することは非常に危険であり、常にボンネットの下で作業するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

急性骨髄性白血病におけるバルク亜集団と幹細胞を区別するNKG2Dリガンド表面検出の2つのフローサイトメトリックアプローチ

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...