Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

Мы благодарим нынешних и прошлых членов наших исследовательских групп, группы IgCLL и Эрик, за их приверженность делу и энтузиазм в изучении иммуногенетики в ХЛЛ. Мы хотели бы также признать доверительное сотрудничество всех членов, IMGT/CLL-DB инициативы и, в частности, Marie-Paule Lefranc профессор и доктор Вероник Гьюдичелли, d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Laboratoire Монпелье II, Монпелье, Франция и IMGT, международной информационной системы иммуногенетики, за их огромную поддержку и помочь с анализа последовательностей гена IG. Эта работа частично поддержали грантов от TRANSCAN-179 Роман JTC 2016; Associazione Italiana за Ла Ricerca Сул Cancro AIRC (следователь Грант #20246 и специальные программы молекулярной клинической онкологии-5 промилле #9965), Милан, Италия; Progetti ди Rilevante заинтересованные Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Рим, Италия; В Швеции онкологическое общество, Шведский исследовательский совет, кнут и Алиса фонд Рауля Валленберга, Каролинского института, Уппсальский университет, Больница университета Упсалы и льва в Фонд исследований рака, Уппсала; Одиссей программа, осуществляемая под «действий для стратегического развития на исследования и технологического сектора», финансируемый оперативной программы «Конкурентоспособность, предпринимательство и инновации» (NSRF 2014-2020) и финансируется совместно Грецией и Европейский союз (Европейский фонд регионального развития).

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).</li><li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+where+do+we+stand+how+do+we+proceed?.">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?.</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li><li>Sutton, L. A., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+between+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+factors+driving+the+evolution+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2015).</li><li>Mina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+prognostic+models+in+CLL+to+personalize+approach+to+clinical+care:+Are+we+there+yet?.">Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?.</a> Blood Reviews. , (2017).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+genes+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+Key+to+understanding+the+disease+and+improving+risk+stratification.">Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification.</a> Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).</li><li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).</li><li>Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmutated+Ig+V(H)+genes+are+associated+with+a+more+aggressive+form+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).</li><li>Burger, J. A., Chiorazzi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).</li><li>Packham, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+proliferation+or+anergy.">The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy.</a> Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).</li><li>Messmer, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+distinct+sets+of+stereotyped+antigen+receptors+indicate+a+role+for+antigen+in+promoting+chronic+lymphocytic+leukemia.">Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).</li><li>Stamatopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+20%+of+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+carry+stereotyped+receptors:+Pathogenetic+implications+and+clinical+correlations.">Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations.</a> Blood. 109 (1), 259-270 (2007).</li><li>Agathangelidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotyped+B-cell+receptors+in+one-third+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+a+molecular+classification+with+implications+for+targeted+therapies.">Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies.</a> Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).</li><li>Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+stereotypy+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).</li><li>Baliakas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+effect+of+stereotyped+B-cell+receptor+immunoglobulins+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+A+retrospective+multicentre+study.">Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study.</a> The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).</li><li>Gounari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+antigen+reactivity+may+underlie,+the+clinical+aggressiveness+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#8.">Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8.</a> Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).</li><li>Ntoufa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+anergy+modulated+by+TLR1/2+and+the+miR-17+approximately+92+cluster+underlies+the+indolent+clinical+course+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#4.">B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4.</a> Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).</li><li>Mansouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+of+IkappaBepsilon+leads+to+NF-kappaB+deregulation+in+aggressive+chronic+lymphocytic+leukemia.">Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).</li><li>Navrkalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+mutations+in+major+stereotyped+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+enrichment+in+subset+#2+is+associated+with+markedly+short+telomeres.">ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres.</a> Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+molecular+lesions+and+specific+B-cell+receptor+subsets+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors.">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li><li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL:+Updated+results+of+the+CLL8+trial.">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li><li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fludarabine,+cyclophosphamide,+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia.">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+diagnosis,+indications+for+treatment,+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li><li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations:+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936.">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li><li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+family+specific+leader+region+primers+for+PCR+amplification+of+the+human+heavy+chain+variable+region+gene+repertoire.">Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire.</a> Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).</li><li>Rosenquist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+gene+sequence+analysis+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+updated+ERIC+recommendations.">Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations.</a> Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).</li><li>Linke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high+resolution+PCR+fragment+analysis+for+identification+of+clonally+rearranged+immunoglobulin+heavy+chain+genes.">Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes.</a> Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).</li><li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroduplex+analysis+of+VDJ+amplified+segments+from+rearranged+IgH+genes+for+clonality+assessments+in+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.+A+comparison+between+different+strategies.">Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies.</a> Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).</li><li>Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/V-QUEST:+The+highly+customized+and+integrated+system+for+IG+and+TR+standardized+V-J+and+V-D-J+sequence+analysis.">IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).</li><li>Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/JunctionAnalysis:+The+first+tool+for+the+analysis+of+the+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+complex+V-J+and+V-D-J+JUNCTIONs.">IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs.</a> Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).</li><li>Bystry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARResT/AssignSubsets:+A+novel+application+for+robust+subclassification+of+chronic+lymphocytic+leukemia+based+on+B+cell+receptor+IG+stereotypy.">ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).</li><li>Belessi, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGHV+gene+insertions+and+deletions+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+&amp;#34;CLL-biased&amp;#34;+deletions+in+a+subset+of+cases+with+stereotyped+receptors.">IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: &amp;#34;CLL-biased&amp;#34; deletions in a subset of cases with stereotyped receptors.</a> European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).</li><li>Langerak, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+sequence+analysis+and+prognostication+in+CLL:+guidelines+from+the+ERIC+review+board+for+reliable+interpretation+of+problematic+cases.">Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases.</a> Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).</li><li>Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+IGHV+DNA+gene+rearrangements+in+CLL:+Influence+of+mixed-mutated+and+-unmutated+rearrangements+on+outcomes+in+CLL.">Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).</li><li>Farooqui, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+for+previously+untreated+and+relapsed+or+refractory+chronic+lymphocytic+leukaemia+with+TP53+aberrations:+A+phase+2,+single-arm+trial.">Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial.</a> The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).</li><li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia.">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li><li>Burger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+as+initial+therapy+for+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).</li></ol>

Авторы имеют конфликта интересов не соответствующих раскрыть.

Изучение генов IG в ХЛЛ был жизненно важным не только для обеспечения лучшего понимания в pathobiology болезни, но и для улучшения пациентов риск стратификации. Поэтому важно, что многоступенчатого процедуры анализа последовательностей гена IG и последующей интерпретации данных последовательности выполняется в стандартизированной форме. Наличие подходящих и достаточно материала пациента и время выборки не должно влиять на способность выполнять мутационного анализ генов IG, поскольку тест может выполняться по PB и любой пробы с высоким количество клеток опухоли ХЛЛ. Разделение мононуклеарных клеток крови с использованием градиента разделение методов обычно выполняется в диагностических лабораториях, и как всегда, следует позаботиться при добавлении крови/RPMI решение в пробирку, содержащую градиента; Эта задача должна быть выполнена образом медленно, нежно, чтобы не мешать градиента и предотвращения гибели клеток.
После разделения клеток извлекаются нуклеиновых кислот. Оба геномная ДНК и cDNA подходят для анализа ГИМ clonotypic IGH перераспределению, однако, есть свои преимущества и недостатки для использования либо материала. Рабочего процесса лаборатории протекает быстрее при использовании геномная ДНК, так как не обратная транскрипция должна быть выполнена до амплификации PCR. Что сказал, используя геномная ДНК как субстрат для ПЦР может привести к амплификации продуктивных и непродуктивных перестановок, которые, в свою очередь, может привести к дополнительные практические лабораторные работы, т.е., очистки или гель вырезание нескольких продуктов ПЦР и отдельные последовательности всех перестановок. При сравнении геномная ДНК и cDNA подходы, для последнего шага обратной транскрипции должна выполняться перед амплификации PCR. Однако в данном случае, в большинстве случаев, только продуктивной IG перестановки будет усиливается и впоследствии виртуализации. Таким образом только один продукт PCR будет очищены и виртуализации, при интерпретации результатов является более простым.
Эффективность усиления во многом зависит от качества геномная ДНК/cDNA, которая должна оцениваться с помощью метода чувствительных квантификации и праймеры используются. Праймеры используются имеют решающее значение для всей аналитические процедуры, поскольку точное определение уровня ШМ может быть достигнута только путем усиления всю последовательность гена переставить IGHV. Полнометражный перегруппировки может оцениваться только если используются 5' IGHV лидер грунты, оправдывая тем самым недавние рекомендации Эрик для использования лидер грунтовки27. Использование альтернативных грунтовки, ведущих к амплификации неполной перестроек гена IGHV-IGHD-IGHJ, не подходит для IGHV гена мутационного анализа и поэтому решительно высказался против. Единственное исключение относится к случаям, которые неоднократно производят отрицательные результаты при использовании IGHV лидер грунты и анализ новых пациентов материала является либо не возможно или также не дала результатов. Если использование различных пациентов образца и/или материала (геномная ДНК/cDNA) и различные грунтовки устанавливает еще не производить продукт PCR, возможные причины могут быть что бремя клеток опухоли является слишком низким или что лимфоцитоз не обусловлено ХЛЛ клон (в этом случае иммунофенотип следует пересмотреть). Грунты, используемые для анализа должен всегда указывается в клинических отчетов.
CLL результатов от накопления моноклональных B клеток, несущих перепланированием же гена IGHV-IGHD-IGHJ, для подавляющего большинства случаев clonality оценки покажет уникальный моноклональных пик, то есть, один клон. В редких случаях двойной перестановки или даже oligoclonal шаблоны могут наблюдаться35. В таких случаях электрофорез геля не является предпочтительной методикой для оценки clonality и должны применяться более чувствительные методы, такие как анализ фрагмента. После того, как было подтверждено clonality, последний шаг до последовательности относится к очистки продукта ПЦР для обеспечения получены последовательности высокого качества. Наконец средство IMGT/V-квест является ресурсом, рекомендованные для анализа последовательностей IG Эрика. Как IMGT базы данных постоянно обновляются и сообщить результаты в последовательной и хорошо аннотированных способом, этот инструмент обеспечивает стандартизированный анализ и облегчает сравнительный анализ среди различных клинических или академические услуги.
Как иммуногенетической анализа в ХЛЛ прогностическо и, в частности, прогнозирования последствий, надежный анализ перепланированием гена IGHV-IGHD-IGHJ, включая назначение основных ХЛЛ стереотипные подмножеств, уже не только желательным, но ключевое значение. Это особенно очевидно в эту эпоху Роман терапии и потенциал, что анализ генов IG руководство лечения решений5,21,,2223,36,37 ,38, как официально свидетельствует недавнее обновление руководящих принципов под эгидой NCI от международного семинара по ХЛЛ24. Что сказал, строгие стандарты необходимы, особенно, как определение статуса ГИМ clonotypic переставить гена IGHV у больных ХЛЛ является не тривиальный вопрос и включает в себя многоступенчатый процесс. Важно отметить, что некоторые экспериментальные шаги, прежде всего выбор грунтовки, урожайность превосходные результаты, когда параметры и/или подходы соблюдаются, другие технические аспекты поддаются определенной степени гибкости, например выбор материала или метод оценки clonality, с тем, что они ведут к тонкие различия, если таковые имеются, в отношении окончательных результатов.
За последнее десятилетие Эрик стремится содействовать стандартизации и согласования различных методов соответствующих ХЛЛ диагностики и прогнозирования. Это отражено в опубликованном рекомендации и руководящие принципы для иммуногенетической анализ27,34, многочисленные организованные учебные семинары и события, создание сети IG, а также онлайн форум экспертов для обсудить и дать указания по интерпретации последовательности гена IG в ХЛЛ. Общая цель Эрик через эти действия является содействие оптимальной клинического управления и ухода за пациентами. Несмотря на интенсивные усилия эта задача далека от завершения и в самом деле стало более сложным вследствие развития Роман высокопроизводительного секвенирования, направленных на иммунные профилирования. Тем не менее хотя проблемы сохраняются, интенсивные усилия для надежной стандартизации анализа генов IG в ХЛЛ продолжить и в настоящее время находятся в центре внимания текущей деятельности в рамках Эрик.

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), наиболее распространенной формой лейкемии у взрослых в западных странах, характеризуется клоновых расширения зрелых опухолевой клетки B1. С клинической точки зрения течения болезни является чрезвычайно переменным с некоторые пациенты испытывают агрессивной заболевания, требующие лечения очень рано после диагноза и часто рецидива или будучи огнеупорные для терапии. Это резко контрастирует с значительная часть пациентов (~ 30%), которые представляют праздного болезнью, никогда не требуют лечения и похож на здоровых людей, соответствует возрасту2продолжительность жизни. Это клиническая неоднородность отражается в разнообразии молекулярных аномалии в ХЛЛ пациентов, которые в конечном итоге патогенезом и прогрессирования болезни3.
Установление точного диагноза ХЛЛ обычно прост, однако, вышеупомянутые клиническая неоднородность может препятствовать эффективному управлению ХЛЛ пациентов и подчеркивает необходимость прогностические и прогнозирования маркеров, которые могли бы помочь в лечения решений2. Многочисленные исследования была предпринята попытка усовершенствовать прогнозирование ХЛЛ, кульминацией обилие Роман клинических и биологических маркеров, будучи предлагаемой4. Мутационного статуса гена clonotypic Иммуноглобулин тяжелые переменной (IGHV) является одним из самых надежных прогностических маркеров в ХЛЛ, главным образом тем, что (i) он остается стабильной во времени и как болезнь прогрессирует, и (ii) оно не зависит от других клинические и биологических параметров5. Что несмотря на это, очень немногие, если таковые маркеров, в том числе IGHV мутационного статуса, в настоящее время применяются в повседневной клинической практике на момент постановки диагноза.
Первоначальные доклады о клинической полезности секвенирования генов IG в ХЛЛ датируются 1999, когда 2 независимых исследований сообщили, что пациенты с без или минимальными соматическими Гипермутационный (ГИМ) нагрузки (unmutated ХЛЛ, U-CLL) имеют хуже прогноз, чем перевозки больных выше ГИМ бремя (мутировавших ХЛЛ, M-CLL)6,7. Говоря более конкретно, U-CLL группа состояла из случаев, укрывательство clonotypic IGHV генов с мало или совсем нет ГИМ и следовательно высокий процент личности к ближайшей гена IGHV микрофлорой (≥98%), тогда как M-CLL состояла из случаев с высокой нагрузкой мутационного (процент личности Ближайший IGHV гена микрофлорой < 98%). Начиная с этих ранних исследований постоянно продемонстрировал, что U-CLL случаев отображения короче время к первая лечения (TTFT) и общей выживаемости (ОС) по сравнению с М-CLL.
В Оглядываясь назад эти исследования семенных подчеркнул ключевую роль B клеточного рецептора (BcR) IG в ХЛЛ pathobiology, проложив тем самым путь для обширных исследований в ХЛЛ microenvironmental взаимодействия, которые, в свою очередь, привело к более всеобъемлющего курса биологической неоднородности этой болезни8,9. Более поздние исследования предоставили дополнительную поддержку для важности иммуногенетической анализов в ХЛЛ, раскрывая, что отдельные случаи могут кластера в подмножества благодаря обмену (квази) идентичные последовательности гена BcR IG, явление называется BcR IG стереотипии10 ,11,12,13. Накапливая доказательства поддерживает понятие, что пациенты, присвоенный же стереотипных подмножество гавань аналогичные свойства clinicobiological, которые четко отделить их от других ХЛЛ больных в пределах одной и той же категории ГИМ, но с различных последовательностей генов IG; действительно было сообщено, что категоризацию ХЛЛ пациентов, основанные на BcR IG стереотипии далее уточняет основную сегрегации ХЛЛ пациентов в U-CLL или M-CLL группы14,,1516, 17 , 18 , 19 , 20.
С клинической точки зрения следует отметить, что, как представляется, состояние ГИМ IGHV гена clonotypic коррелируют с конкретным ответом на chemoimmunotherapy. В частности, M-CLL больных лечение с комбинации флударабина/циклофосфамид/Ритуксимаб (FCR), золотой стандарт лечения больных медицинским подходят ХЛЛ, отсутствуют дефекты гена TP53 , выставлены значительно больше прогрессии бесплатно выживание (PFS) и ОС, по сравнению с U-CLL пациентов, которые получили21,же лечения,22,,23. Таким образом, определение статуса ГИМ стало важным в частности для оказания помощи в терапевтических управления ХЛЛ пациентов , интеллектуального маркер, а не для оценки клинического течения заболевания , Прогностические маркер. В самом деле по данным недавнего обновления руководящих принципов под эгидой NCI от международного семинара по ХЛЛ, ГИМ статус переставить генов IGHV должно быть определены во всех случаях ХЛЛ до начала лечения в обоих общей практики и клинических испытания24. Кроме того из-за недавнее одобрение новых лечения агентов и растущее количество наркотиков в испытаниях, состояние ГИМ молекулы IG может играть еще большую роль в терапевтического ведения больных с ХЛЛ в ближайшем будущем5.
В настоящем докладе подробно описываются все аспекты анализа последовательностей гена IG, начиная с выбора соответствующих материалов и кульминацией которых клиническая интерпретация результатов секвенирования. Углубленная оценка этих шагов важно диагностические процедуры для производства надежных результатов и обеспечения точных пациента стратификации в рамках клинических испытаний. Протоколы предоставляются для помощи в согласовании анализа последовательностей гена IG, обеспечивая тем самым, что результаты сопоставимы между различными лабораториями.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

Во время созревания клетки B сложный процесс иммуноглобулина (IG) гена V (D) J рекомбинации в сочетании с соматической Гипермутационный (ГИМ) порождает уникальную последовательность ДНК в рамках каждой отдельной клетки B. Поскольку B клетки злокачественных опухолей является результатом клоновых расширения одной ячейки, генов IG представляют уникальную подпись молекулярной общих для всех злокачественных клеток в пределах конкретного пациента; Таким образом перестановки генов IG может использоваться как клоновых маркеров. Помимо служит важным клоновых идентификатор, последовательность гена IG может выступать в качестве «молекулярной сроки», так как он связан с определенных этапах своего развития и таким образом отражает историю B клеток, участвующих в неопластической трансформации. Кроме того для некоторых злокачественных опухолей, в частности хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), последовательность гена IG проводит прогностические и потенциально интеллектуальный потенциал. Что говорит, экстраполируя значимые выводы из анализа последовательностей гена IG будет невозможно, если надежные методы и инструменты были не доступны для оказания помощи в их анализ. Эта статья, опираясь на богатый опыт Европейской исследовательской инициативы по ХЛЛ (Эрик), детали технические аспекты и основных требований, необходимых для обеспечения анализа последовательностей гена IG надежных и воспроизводимых в ХЛЛ, тест, который в настоящее время рекомендуется для всех ХЛЛ больных до начала лечения. Говоря более конкретно различные аналитические этапы описаны, начиная от идентификации перераспределение генов IG clonotypic и определение нуклеотидной последовательности для точной клинической интерпретации данных последовательности гена IG.

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Здесь мы представляем протокол, что детали технические аспекты и основные требования для обеспечения надежной анализа последовательностей гена IG больных хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), основанный на опыт, накопленный Европейской исследовательской инициативы по CLL (ЭРИК).

Анализ последовательности гена иммуноглобулинов в хронический лимфоцитарный лейкоз: От пациента материала для интерпретации последовательности

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хронического лимфоцитаного лейкоза, такие как точный прогноз пациентов. Основным преимуществом этой техники является то, что она проста, быстра и очень точна. Последствия этого метода распространяются на надежное прогнозирование, особенно сертификации риска у пациентов с хроническим лимфоцитарный лейкоз, потому что точное прогнозирование может позже определить терапевтическое управление болезнью.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, такие как выбор продукта PCR и дайджест типов последовательности трудно узнать, потому что они требуют как точности, так и опыта. Чтобы начать эту процедуру, добавьте 200 микролитров ЭДТА в 50 миллилитров стерильной трубки сбора. Добавить 20 миллилитров периферической крови и 15 миллилитров RPMI среды в трубку и пипетку вверх и вниз два-три раза, чтобы смешать.Затем добавьте 15 миллилитров градиентной среды плотности в новую трубку сбора 50 миллилитров. Медленно слой периферического раствора крови на плотность градиента среды, убедившись, что он не нарушает градиента. Центрифуга при 800 раз G в течение 20 минут с центрифугой тормоза.Затем используйте стерильную трубу Pasteur для сбора моноядерного клеточного кольца, которое образовалось между верхним слоем плазменной тромбоцитов и средним слоем градиента плотности, и перенесите его в новую стерильную трубку сбора 15 миллилитров. Добавить RPMI среды таким образом, что окончательный объем составляет 12 миллилитров и пипетки раствор вверх и вниз, чтобы смешать. Центрифуга при 800 раз G в течение восьми минут.Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клеточные гранулы 10 миллилитров среды RPMI. Центрифуга снова на 750 раз G в течение восьми минут. После этого отбросьте супернатант и растворите клеточные гранулы в одном миллилитре PBS.Используя новую пластину Бауэра, сформирует количество клеток, смешивая 20 микролитров образца и 80 микролитров раствора от одного до 10 турок. Если обработка образца не запланирована на тот же день, центрифуга образца в 750 раз G в течение восьми минут. Откажитесь от супернатанта и храните клеточные гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Во-первых, подготовить грунтовку смесь с использованием равномерных количествах каждой подгруппы грунтовка для обеспечения беспристрастного усиления. Смешайте реагенты ПЦР, перечисленные во второй таблице текстового протокола. Добавьте 0,5 микролитров полимеразы TAP в трубку ПЦР, содержащую смешанные реагенты ПЦР.Затем добавьте либо 100 нанограммов гДНА, либо два микролитров кДНА. Вы запустите тепловой протокол ПЦР, как описано в таблице 3 текстового протокола. После этого проверьте продукцию PCR примерно 500 базовых пар при использовании литровых грунтовок IGHV или 350 базовых пар при использовании смеси грунтовки IGHPFR1.Для начала очистки продукта ПЦР загрузите общий объем продукта ПЦР на трехпроцентный низкоплавильный агарозный гель. Разрешить PCR продукты для запуска на гель, пока они не отделяются от фона. Акциз резких видных ПЦР полос, а затем очистить и elute их.При обнаружении двух перестановок обе полосы должны быть вырезаны и секвенированы отдельно. Для выполнения очистки экзо-сока следуйте инструкциям производителя относительно конкретных объемов использования. Аккуратно вихрь каждый образец, чтобы смешать и инкубировать их на блок ПЦР при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.Инактивировать ферменты, нагревая их до 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут. После этого загрузите небольшое количество продуктов ПЦР на трехпроцентный агарозный гель, чтобы оценить чистоту продукта. Последним контрольно-пропускным пунктом перед секвенированием является определение клональности выборки с помощью анализа фрагментов.Чтобы начать анализировать последовательность, запустите соответствующее программное обеспечение. Укажите виды, такие как homo sapiens, и тип рецептора или локус. Пейс последовательности, которые будут проанализированы в формате fasta и в том числе идентификаторы в области текста в пакетах до 50 последовательностей за запуск.Затем выберите один из следующих трех вариантов отображения результатов. Подробное представление: выберите этот вариант для того, чтобы получить результаты для каждой последовательности в отдельности. Представление синтеза: выберите эту опцию для составления сводной таблицы, заказанной геном IGHV и именем аллеля или порядком ввода последовательности.Эта опция также обеспечивает выравнивание последовательностей, которые в любой представленной партии присваиваются одному и тому же гену IGHV и аллеле, и, наконец, файлу Excel. Выберите эту опцию, чтобы предоставить все выходные файлы в качестве электронных таблиц, объединенных в один файл. Только использование литровых грунтовок IGHV позволяет обеспечить усиление всей длины перестроенного IGHV, что позволяет определить истинную нагрузку HSM.Ожидаемый продукт PCR составляет около 500 базовых пар. В редких случаях, когда IGHV литровые грунтовки не могут усилить клонотипик IG перестановки, IGHBFR1 грунтовки могут быть использованы. Ожидаемый продукт PCR составляет около 350 базовых пар.Полученные последовательности затем анализируются с помощью инструмента IMG TV Квест. В первой строке таблицы результатов говорится о функциональности последовательности, поскольку измененная IG последовательность может быть продуктивной или непродуктивной. Перестановка гена IGH непродуктивна, это стоп-кодоны присутствуют в регионе VDJ и/или если перестановка находится вне кадра из-за вставок/удалений.Важно отметить, что следует дополнительно анализировать только продуктивные и, следовательно, функциональные перестановки. При использовании параметров IMG TV Квест по умолчанию, вставки и удаления не обнаруживаются автоматически, однако сильные признаки того, что последовательность может нести такие изменения предоставляются инструментом и предупреждение появляется ниже таблицы резюме результата. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы посадить продукты ПЦР на гель достаточно долго, так что клональная связь может быть дискриминирована с поликлонального фона.После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области хронического лимфоцитического лейкоза иммуногенетики для изучения прогностический эффект статуса соматической эпимутации у пациентов. Не забывайте, что работа с бромистым этилием может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как работа под капотом во все времена, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Assay иммунопреципитации Chromatin для выявления роман NFAT2 целевых генов в хронический лимфоцитарный лейкоз

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Создание и анализ трехмерных (3D) органоидов, полученных из метастазов костной ткани рака простаты Исты и их Ксенотранспланты

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Субклеточная фракция первичных клеток хронического лимфоцитарного лейкоза для мониторинга торговли ядерным/цитоплазмическим ибелением

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Создание 3-мерных сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценка их чувствительности к лекарствам

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Генерация и культивирование высокодифференцированных серозных органоидов, полученных от пациентов с раком яичников

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...