Name: immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

Vi tackar nuvarande och tidigare medlemmar av våra forskargrupper, IgCLL gruppen och ERIC, för deras engagemang och entusiasm i studerar immunogenetik vid KLL. Vi vill också uppmärksamma i förtroendefullt samarbete med alla ledamöter av initiativet IMGT/KLL-DB och i synnerhet, Professor Marie-Paule Lefranc och Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, Frankrike, och IMGT, den internationella immunogenetik informationssystemet, för deras enorma stöd och hjälp med IG gen sekvensanalys. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från TRANSCAN-179 roman JTC 2016. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 och särskilda Program molekylär klinisk onkologi-5 promille #9965), Milano, Italien; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rom, Italien; Cancerfonden, Vetenskapsrådet, Knut och Alice Wallenbergs stiftelse, Karolinska Institutet, Uppsala universitet, akademiska sjukhuset och lejonets Cancer Research Foundation, Uppsala; ODYSSEUS-programmet genomförs enligt den ”åtgärder för the strategiska utveckling på the forskning och tekniska sektorn”, finansieras genom det operativa programmet ”konkurrenskraft, entreprenörskap och Innovation” (Strukturfondsstrategin 2014-2020) och medfinansieras av Grekland och Europeiska unionen (Europeiska regionala utvecklingsfonden).

Forskning protokollet godkändes av den etiska kommittén i San Raffaele vetenskapliga Institutet, Milano, Italien.
1. materialval
<ol><li>
Val av utgångsmaterial Obs: I de flesta fall av KLL det tumör celltalet är hög vid diagnos (> 80-90%). Således, cell sortering eller anrikning av leukemiska celler är oftast inte nödvändigt.<ol>
<li>Om perifert blod (PB) vanligaste materialet i valet för IG gen sekvensanalys, använder en blodvolym mellan 10-20 mL.</li>
		<li>Alternativt i fall med en låg KLL-cellen börda, använda cell sortering av PB prover eller material från andra vävnader, som benmärg (BM) eller lymfkörtlar (LN).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Provtagningstiden
	<ol>
<li>Provtagningstid är inte avgörande eftersom IG SHM status är stabil övertid; som sagt, Undvik provtagning under vissa perioder, såsom omedelbart efter eller under behandlingen, eftersom det låga antalet KLL celler kan komplicera analysen och leda till otillförlitliga resultat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Material insamling och lagring Obs: Insamling och lagring av utgångsmaterialet beror starkt på det materiella valet.<ol>
<li>För PB eller BM prover, använda EDTA eller CPT (citrat-tris-pyridossalphosphate) samling rör för att förhindra hämning av PCR-amplifiering. alternativt använda heparin rör.</li>
		<li>För LN prover är samling alternativen antingen cellsuspensioner, biopsier från färsk fryst vävnad eller, i sällsynta fall formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. densiteten Gradient Separation
Obs: Om PB eller BM är utgångsmaterialet val, vilket är det vanligaste scenariot, mononukleära cell isolering använder täthet lutning separation rekommenderas.
<ol><li>Tillsätt 200 µL av EDTA (0,5 M EDTA / pH 8,0) till en 50 mL steril samling tub. Tillsätt 20 mL av PB och 15 mL RPMI. Mix av pipettering (2 - 3 gånger räcker).</li>
	<li>Tillsätt 15 mL täthet lutning medium till en ny 50 mL samling röret. Obs: PB volymen är mindre än 20 mL, volymerna av RPMI (föregående steg) och täthetlutning bör ändras i enlighet därmed.</li>
	<li>Långsamt lager i lösningen från steg 2.1 så att det inte stör övertoningen. Centrifugera vid 800 x g i 20 minuter med centrifug broms.</li>
	<li>Samla in mononukleära celler ringen som bildats mellan övre plasma/trombocyter lagret och täthet lutning medium lagret med hjälp av en steril Pasteur-pipett, sedan överföra till en steril 15 mL collection tube.</li>
	<li>Tillsätt RPMI till en slutlig volym av 12 mL och blanda. Centrifugera vid 750 x g i 8 minuter. Kassera supernatanten.</li>
	<li>Återsuspendera cellpelleten med 10 mL RPMI och upprepa steg 2.5.</li>
	<li>Lös upp cellpelleten i 1 mL PBS (DPBS, inga kalcium, ingen magnesium). Utföra en cell sammanräkning med en Neubauer plattan genom att blanda 20 µL prov och 80 µL av 1:10 Türks lösning.</li>
	<li>Om nedströms behandling av provet inte är schemalagd för samma dag, Centrifugera provet vid 750 x g i 8 minuter. Avlägsna supernatanten och lagra cellpelleten på-80o C.</li>
</ol>3. nukleinsyra utvinning
<ol><li>Besluta om ett substrat för analys av SHM status av IG-gener. Genomiskt DNA (gDNA) är det mest populära valet eftersom det finns ingen anledning för en omvänd Transkription steg; Alternativt, användningen av RNA/kompletterande DNA (cDNA) garanterar att, åtminstone på transkriptionell nivå, produktiv, funktionella clonotypic IG omordningen är ”gynnade” målet.</li>
	<li>Använd en av många kommersiellt tillgängliga kit passar gDNA eller total RNA-extraktion och syntesen av cDNA (se Tabell för material).</li>
	<li>Bedöma integriteten av DNA eller RNA med känsliga nukleinsyra kvantifiering system. Om använda FFPE material för analys, bedöma kvalitet och kvantitet av den extraherade gDNA/cDNA av PCR-amplifiering av en känd städning gen, e.g. retinoic acid receptor alfa (RARa), beta-aktin, osv.</li>
</ol>4. förstärkning och sekvensering av IGHV-IGHD-IGHJ-genen Rearrangements
<ol><li>
IGH PCR primer urval
	<ol>
<li>Helst, utföra multiplex PCR med IGHV undergruppen specifika 5' primers och IGHJ gen specifika 3' primers25,26. Om resultaten är optimalt, förbereda separat PCR-mixar med enda IGHV undergruppen-specifika primers.</li>
		<li>Använd 5' primers som glödga till antingen ledare regionen ligger omedelbart uppströms IG omordningen eller inom den IGHV gen kodande regionen (t.ex. RAM 1, FR1).<ol>
<li>Använd ledare primers som möjliggör en förstärkning av hela omordnats gensekvens IGHV-IGHD-IGHJ, som i sin tur kommer att möjliggöra en korrekt uppskattning av SHM nivåer. Således, IGHV ledare grundfärger rekommenderas av ERIC i sin uppdaterade riktlinjer för IG gen sekvens analys27.</li>
			<li>I fall där ledare primers misslyckas att förstärka clonotypic IG omordningen kan använda IGHV FR1 primers. Dock ramen primers inte förstärka den hela clonotypic IG gen ombildning, vilket kan leda till felaktig bestämning av nivån på SHM. Det här scenariot, tydligt i rapporten kliniska att användningen av IGHV FR1 grundfärger kan överskatta det sanna procent identitet till närmaste könsceller-genen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>För 3' slutet, använda samförstånd primers inriktning de IGHJ gener, multiplex uppsättningar av IGHJ gen-specifika primers eller isotyp-specifika primrar, beroende på underlaget. Primer sekvenser lämnas i tabell 1, medan figur 1 illustrerar de olika platserna för primer glödgning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-amplifiering av IGHV-IGHD-IGHJ genen rearrangements
	<ol>
<li>Förbereda den primer mix med equimolar mängder varje undergrupp primer(s) för att säkerställa opartiska förstärkning.<ol>
<li>Till exempel när du använder ledare primers, används två olika grundfärger för att förstärka rearrangements tillhör undergruppen IGHV1. Således, använda en kvantitet av dessa 2 primers (IGHV1L och IGHV1bL) som är hälften jämfört med IGHV4L, vilket är den enda primern för IGHV4 undergrupp omflyttningar.</li>
			<li>Gäller det motsatta tillvägagångssättet när det gäller IGHJ1-2 och IGHJ4-5 primers. Som dessa primers rikta två olika IGHJ gen undergrupper, jämfört dubbla mängden med IGHJ3 och IGHJ6 primers.</li>
			<li>Använd tabell 1 för att fastställa de exakta primer kvantiteterna när du förbereder relevanta primer mixar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Blanda PCR reagens som förtecknas i tabell 2. Efter att kombinera alla de PCR reagenserna i ett PCR-rör, tillsätt 0,5 µL av Taq polymeras och 100 ng gDNA eller 2 µL av cDNA (cDNA bör förberedas med hjälp av 1 µg RNA). Obs: En Taq enzym med korrekturläsning aktivitet inte är nödvändigt eftersom förstärkning felprocenten är extremt låg och kommer därför inte att påverka nivån på SHM.</li>
		<li>Kör den termiska PCR-protokoll som beskrivs i tabell 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Clonality bedömning Obs: En kritisk nästa steg innebär att utvärdera clonality mönstret av PCR-produkten. När man bedömer clonality hos KLL patienter, är det vanligaste resultatet ett enda, monoklonala peak/band.<ol>
<li>Använda metoder med hög känslighet, såsom fragment eller heteroduplex analys, för clonality bedömning28,29.</li>
		<li>Fragmentet analys<ol>
<li>Utföra multiplex primärvården med 5'-märkt IGHV ledare eller FR1 undergruppen specifika PCR primers; Detta kommer att ge PCR-produkter som kan vara avgränsade med kapillärelektrofores, därmed möjliggöra clonality bedömning av IGH PCR produkter baserat på deras IGHV komplementaritet att bestämma region 3 (CDR3) längder.</li>
			<li>Använd grundfärg, reagenser och värmeförhållanden identisk med de tidigare nämnda (se tabellerna 1-3). Anpassade 5´-märkt primers är fluorescently märkt oligos med ett val av färgämnen i 5'-änden. Exempel på reporter färgämnen 6-FAM, HEX, NED eller TET. Således krävs 2 separata reaktioner baserat på användning av 3 olika färgämnen per reaktion.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bedöma storleken på PCR-produkter på en sex procent (6%) polyakrylamidgel (denna procentsats resulterar i optimal upplösning) och 1 x TBE som kör buffert. Kör på 80 V för 45 min. Obs: Det rekommenderas att PCR-produkter tillåts att migrera på gel tillräckligt länge så att monoklonala prover kan separeras från polyklonala bakgrunden och DNA storlek markören kan separera tillräckligt. Faktorer såsom storlek och tjocklek av gelen kan påverka migration så ingen enda inställning (spänning och tid) kan garantera ett optimalt resultat som sade att spänningen på 80 V 45 minuter är en bra utgångspunkt eftersom det minimerar risken för provet migrera alltför snabbt och 'igång' av gelen.</li>
		<li>Kontrollera för PCR-produkter med cirka 500 baspar när du använder IGHV ledare primers och 350 baspar när du använder IGHV FR1 primer mixar. Obs: I sällsynta fall KLL fall har befunnits bära dubbel, monoklonala produkter och i sällsynta fall, fall kan uppvisa en oligoklonala mönster. En intercalating agent såsom etidiumbromid (EtBr) eller mindre farliga och mer känsliga kommersiellt tillgängliga DNA fläckar kan användas för visualisering av DNA på akrylamid geler med UV excitation eller blått ljus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR-produkten rening Obs: PCR-produkter renas för att ta bort någon polyklonala bakgrund med ursprung från normala B-celler inom såväl KLL prov som primer dimerer som kan leda till suboptimalt sekvensering. Använda valfri metod som avlägsnar unincorporated dNTP och primers för PCR-sanering, såsom en enzymatisk behandling, t ex Sap (räkor alkaliskt fosfatas) / Exo (Exonuclease I), eller kolumnbaserade rening.<ol>
<li>Ladda den totala volymen av PCR-produkten på en 3%-låg-smältande agarosgel.</li>
		<li>Tillåta de PCR-produkterna att köra på gelen tills de skiljs från bakgrunden.</li>
		<li>Punktskatt banden skarp, framstående PCR, rena och eluera. Om två rearrangements upptäcks, båda banden bör vara censurerade och sekvenserade separat.</li>
		<li>För att utföra sanering i Sap/Exo, följ tillverkarens anvisningar angående de specifika volymerna att använda; men en typisk reaktion kan innehålla 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo och 2 µL 5 x inkubation buffert per 5-10 µL PCR-reaktion. Blanda genom att försiktigt vortexa varje prov och inkubera på en PCR block vid 37 ° C i 30 minuter. Inaktivera enzymer genom uppvärmning till 85 ° C i 15 minuter.</li>
		<li>Läsa in en liten mängd av PCR-produkter på en 3% agarosgel att bedöma produktens renhet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Sanger sekvensering
Obs: Flera sekvensering strategier finns, dock, oavsett den exakta metoden, direkt sekvensering av båda delarna är obligatoriska att säkerställa ett tillförlitligt resultat.
<ol><li>
De allmänna sekvensering protokoll
	<ol>
<li>Om förstärkning har utförts med enstaka grundfärger, fortsätta med sekvensering med lämpliga IGHV - och IGHJ- eller konstant region-specifika primers. Detta synsätt kan också antas om multiplexed fluorescently märkt primers har använts och PCR-produkten bedömdes med hjälp av fragmentet analys (sekvensering primers inte bör märkas).</li>
		<li>Om multiplexade primers har använts och clonality bedömdes på en gel, sedan använda en nedströms primer på första steget av sekvensering t.ex. konsensus IGHJ primer med sekvensen som 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'. En CH-primer kan alternativt användas om cDNA användes som substrat. Använd sedan undergruppen-specifika IGHV ledare eller FR1 primers för sekvensering steg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exempel sekvensering protokoll Obs: Flera sekvensering protokoll finns och ett protokoll som exempel beskrivs nedan.<ol>
<li>Späd 33 ng av PCR-produkten i en total volym på 11,5 µL använder, t.ex., sterilt vatten. Denature PCR-produkten genom uppvärmning till 95 ° C i 5 minuter. Placera omedelbart på is i 10 minuter för att förhindra bildandet av sekundära strukturer.</li>
		<li>Tillsätt 8 µL master mix i varje tub tillsammans med 0,5 µL (motsvarande 5 pmol) av primer.</li>
		<li>Som en kontroll, förbereda en tub som innehåller 8 µL av master mix, 0,5 µL pUC18 kontrollmall, 2 µL (-) 47 sekvensering primer och 9,5 µL sterilt vatten. Den slutliga totala volymen i varje rör bör vara 20 µL.</li>
		<li>Användningsförhållanden termisk cykling för sekvensering reaktionen som beskrivs i tabell 4.</li>
		<li>Förbered stopplösningen genom att blanda 2 µL av natriumacetat 3M (pH 5.2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8,0) och 1 µL av glykogen (koncentration 20 mg/mL), sedan Tillsätt 5 µL till varje prov. Överföra produkten till en ny mikrocentrifug rör.</li>
		<li>Tillsätt 60 µL av 100% etanol (-20 ° C) och blanda försiktigt. Centrifugera vid 14.000 rpm i 15 minuter (4 ° C). Kassera supernatanten.</li>
		<li>Tillsätt 100 µL av 70% etanol (-20 ° C) och blanda försiktigt. Centrifugera vid 14.000 rpm i 10 minuter (4 ° C). Kassera supernatanten. Upprepa en gång.</li>
		<li>Torka pelleten i 90 minuter i rumstemperatur. Lägga till 40 µL av sodium dodecyl sulfate (SDS) lösning till varje prov.</li>
		<li>Överför provet till en sekvensering plåt, täck med strip caps eller tejp tätningar, ladda maskinen och utföra Sanger sekvensering. Den sekvensering plattan är vanligtvis en 96 brunnar, v-botten, full-kjol PCR-plattan kompatibla med sequencer. Plattorna kan vara barcoded beroende på om sekvensering ska utföras internt, ett kommersiellt bolag eller en akademisk sekvensering center/plattform.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter sekvensering, 'sy ihop' den 2 läser genereras från enskilda sekvensering stegen att bilda en komplett IGHV gen ombildning dvs sekvensen konsensus.</li>
</ol>6. sequence Analysis
Obs: Följande sektioner fokus på produktionen erhålls från IMGT/V-QUEST verktyg30 när analysera omordnats IG sekvenser och IMGT/JunctionAnalysis31, båda är särskilt relevanta för klinisk rapportering och forskning studier. IMGT/V-QUEST är ett linjeringsverktyg som jämför användaren läggs upp IG sekvenser med katalogen IMGT referens anger30. Resultatet av verktyget innehåller flera sektioner inom vilken användaren kan definiera vissa parametrar.
<ol><li>Ange arter, exempelvis Homo sapiens (human), och receptor typ eller locus (e.g. IGH, IGK eller IGL).</li>
	<li>Klistra in sekvenser som skall analyseras, i FASTA format och inklusive rubriker, till textområdet (i omgångar av upp till 50 sekvenser per körning). Alternativt finns ett alternativ för att ange sökvägen till en lokal fil som innehåller den FASTA sekvenser.</li>
	<li>Välj något av följande 3 visningsalternativ för resultat:<ol>
<li>Detaljerad vy: Välj det här alternativet för att få resultaten för varje sekvens individuellt.</li>
		<li>Syntes Visa: Välj det här alternativet att sammanställa en sammanfattande tabell som beställt av IGHV gen och allel namn eller sekvens ingående order. Detta alternativ ger också en anpassning av sekvenser som, i varje inlämnade parti, tilldelas de samma IGHV gen och allel.</li>
		<li>Excel-fil: Välj detta alternativ för att ge alla utdatafiler som kalkylblad som införlivas i en enda fil. Alla visningsalternativ har ett stort urval av grundläggande och avancerade parametrar att välja mellan, men endast faktorerna som är mest relevant för KLL IG sekvensanalys diskuteras nedan i avsnittet ' representant '.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. gripande/AssignSubsets verktyg
<ol><li>För att undersöka BcR IG stereotypy inom KLL (ytterligare kontaktuppgifter finns nedan i avsnittet 'Representant resultat'), lämna IGHV-IGHD-IGHJ FASTA sekvenser till den gripande/AssignSubsets verktyg32. Verktyget rapporterar tilldelningen till stora KLL stereotypa delmängder. Verktyget delmängd-tilldelning tillsammans med detaljerade anvisningar finns på gripandet/AssignSubset hemsida32 och även på ERIC hemsida under fliken tjänster.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).</li><li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+where+do+we+stand+how+do+we+proceed?.">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?.</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li><li>Sutton, L. A., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+between+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+factors+driving+the+evolution+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2015).</li><li>Mina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+prognostic+models+in+CLL+to+personalize+approach+to+clinical+care:+Are+we+there+yet?.">Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?.</a> Blood Reviews. , (2017).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+genes+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+Key+to+understanding+the+disease+and+improving+risk+stratification.">Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification.</a> Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).</li><li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).</li><li>Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmutated+Ig+V(H)+genes+are+associated+with+a+more+aggressive+form+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).</li><li>Burger, J. A., Chiorazzi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).</li><li>Packham, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+proliferation+or+anergy.">The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy.</a> Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).</li><li>Messmer, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+distinct+sets+of+stereotyped+antigen+receptors+indicate+a+role+for+antigen+in+promoting+chronic+lymphocytic+leukemia.">Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).</li><li>Stamatopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+20%+of+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+carry+stereotyped+receptors:+Pathogenetic+implications+and+clinical+correlations.">Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations.</a> Blood. 109 (1), 259-270 (2007).</li><li>Agathangelidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotyped+B-cell+receptors+in+one-third+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+a+molecular+classification+with+implications+for+targeted+therapies.">Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies.</a> Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).</li><li>Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+stereotypy+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).</li><li>Baliakas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+effect+of+stereotyped+B-cell+receptor+immunoglobulins+in+chronic+lymphocytic+leukaemia:+A+retrospective+multicentre+study.">Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study.</a> The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).</li><li>Gounari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+antigen+reactivity+may+underlie,+the+clinical+aggressiveness+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#8.">Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8.</a> Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).</li><li>Ntoufa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+anergy+modulated+by+TLR1/2+and+the+miR-17+approximately+92+cluster+underlies+the+indolent+clinical+course+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+#4.">B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4.</a> Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).</li><li>Mansouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+of+IkappaBepsilon+leads+to+NF-kappaB+deregulation+in+aggressive+chronic+lymphocytic+leukemia.">Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).</li><li>Navrkalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+mutations+in+major+stereotyped+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+enrichment+in+subset+#2+is+associated+with+markedly+short+telomeres.">ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres.</a> Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+molecular+lesions+and+specific+B-cell+receptor+subsets+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).</li><li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors.">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li><li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL:+Updated+results+of+the+CLL8+trial.">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li><li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li><li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fludarabine,+cyclophosphamide,+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia.">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+diagnosis,+indications+for+treatment,+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li><li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations:+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936.">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li><li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+family+specific+leader+region+primers+for+PCR+amplification+of+the+human+heavy+chain+variable+region+gene+repertoire.">Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire.</a> Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).</li><li>Rosenquist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+gene+sequence+analysis+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+updated+ERIC+recommendations.">Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations.</a> Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).</li><li>Linke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high+resolution+PCR+fragment+analysis+for+identification+of+clonally+rearranged+immunoglobulin+heavy+chain+genes.">Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes.</a> Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).</li><li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroduplex+analysis+of+VDJ+amplified+segments+from+rearranged+IgH+genes+for+clonality+assessments+in+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma.+A+comparison+between+different+strategies.">Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies.</a> Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).</li><li>Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/V-QUEST:+The+highly+customized+and+integrated+system+for+IG+and+TR+standardized+V-J+and+V-D-J+sequence+analysis.">IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).</li><li>Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT/JunctionAnalysis:+The+first+tool+for+the+analysis+of+the+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+complex+V-J+and+V-D-J+JUNCTIONs.">IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs.</a> Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).</li><li>Bystry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARResT/AssignSubsets:+A+novel+application+for+robust+subclassification+of+chronic+lymphocytic+leukemia+based+on+B+cell+receptor+IG+stereotypy.">ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).</li><li>Belessi, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGHV+gene+insertions+and+deletions+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+&amp;#34;CLL-biased&amp;#34;+deletions+in+a+subset+of+cases+with+stereotyped+receptors.">IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: &amp;#34;CLL-biased&amp;#34; deletions in a subset of cases with stereotyped receptors.</a> European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).</li><li>Langerak, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+sequence+analysis+and+prognostication+in+CLL:+guidelines+from+the+ERIC+review+board+for+reliable+interpretation+of+problematic+cases.">Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases.</a> Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).</li><li>Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+IGHV+DNA+gene+rearrangements+in+CLL:+Influence+of+mixed-mutated+and+-unmutated+rearrangements+on+outcomes+in+CLL.">Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).</li><li>Farooqui, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+for+previously+untreated+and+relapsed+or+refractory+chronic+lymphocytic+leukaemia+with+TP53+aberrations:+A+phase+2,+single-arm+trial.">Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial.</a> The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).</li><li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia.">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li><li>Burger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+as+initial+therapy+for+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).</li></ol>

Författarna har ingen relevant intressekonflikt att avslöja.

Studien av IG-gener i KLL har varit avgörande för att ge en bättre förståelse till sjukdom patobiologi men också för att förbättra patientens riskstratifiering. Det är därför avgörande att flera steg tillvägagångssättet av IG gen sekvensanalys och efterföljande tolkning av sekvensdata utförs på ett standardiserat sätt. Tillgången på lämpliga och tillräckliga patientmaterial och tidpunkten för provtagning bör inte påverka förmågan att utföra IG gen mutationsanalys analys eftersom testet kan utföras på PB och på varje prov med en hög KLL tumör cell sammanräkning. Separation av mononukleära celler med hjälp av gradient separationsmetoder utförs rutinmässigt i diagnostiska laboratorier, och som alltid, försiktighet bör iakttas när du lägger till blod/RPMI lösningen till röret som innehåller gradient; denna uppgift bör utföras i en långsam och mild sätt att undvika störande toningen och förhindra förlust av celler.
Efter cellseparation extraheras nukleinsyror. Båda gDNA och cDNA är lämpliga för SHM analys av clonotypic IGH omordningen, men det finns fördelar och nackdelar för användning av antingen material. Laboratoriet arbetsflödet fortsätter snabbare när du använder gDNA eftersom ingen omvänd Transkription skall utföras innan PCR-amplifiering. Som sagt, med gDNA som substrat för PCR kan resultera i förstärkning av både produktiva och improduktiva rearrangements vilket i sin tur kan leda till ytterligare praktiska laborationer, dvs rening eller gel excision av flera PCR-produkter och enskilda sekvensering av alla omflyttningar. När man jämför de gDNA och cDNA förhållningssätt, det senare måste en omvänd Transkription steg utföras innan du fortsätter med PCR-amplifiering. Dock i detta fall, i de flesta fall blir endast produktiv IG rearrangements förstärkt och därefter sekvenserade. Således blir endast en enda PCR-produkt renat och sekvenserade, medan resultaten tolkning är mer okomplicerat.
Effektiviteten av förstärkning beror till stor del på kvaliteten på den gDNA/cDNA, som bör bedömas med hjälp av en känslig kvantifiering metod och primers utnyttjas. Primers används är kritiska till hela analytiska proceduren eftersom den noggrann bestämningen av SHM nivån kan endast uppnås genom att förstärka hela sekvensen av den ordnas IGHV gen. En fullängds omflyttning kan endast bedömas om 5' IGHV ledare primers används, vilket således motiverar ERIC senaste rekommendationer för användning av ledare primers27. Användningen av alternativa grundfärger, leder till förstärkning av ofullständig IGHV-IGHD-IGHJ genen rearrangements, är inte lämpligt för IGHV gen mutationsanalys analys, och därför vi rekommenderar mot. Det enda undantaget avser fall som upprepade gånger ger negativa resultat när IGHV ledare primers används och analys av nya patientmaterial är inte möjligt eller också skiljer inte ger resultat. Om användning av en annan patientprov eller material (gDNA/cDNA) och olika primers anger fortfarande misslyckas att producera en PCR produkt, möjliga orsaker kan vara att tumör cell bördan är för låg eller att Lymfocytos beror inte på en KLL klon (i vilket fall den immunophenotype bör utvärderas på nytt). Primer som används för analysen bör alltid anges i rapporten kliniska.
Som KLL resultat från ansamling av monoklonal B-celler som bär samma IGHV-IGHD-IGHJ gen omordningen, för de allra flesta fall clonality kommer att bedömning avslöja en unik monoklonala topp, dvs en enda klon. Vid sällsynta tillfällen, kan dubbel omflyttningar eller ens oligoklonala mönster observeras35. I sådana fall gelelektrofores är inte rekommenderad tekniken för clonality bedömning och känsligare metoder såsom fragment analys bör tillämpas. När clonality har bekräftats, avser det sista steget innan sekvensering rening av PCR-produkten att säkerställa att sekvenser av hög kvalitet erhålls. Slutligen, verktyget IMGT/V-QUEST är den resurs som rekommenderas för IG sekvensanalys av ERIC. Som IMGT databaserna uppdateras kontinuerligt och rapportera resultaten på ett konsekvent och väl kommenterad sätt, detta verktyg säkerställer standardiserade analys och underlättar jämförande analys bland olika kliniska eller akademiska faciliteter.
Immunogenetisk analys i KLL har prognostiska och, i synnerhet prediktiva konsekvenser, robust analys av IGHV-IGHD-IGHJ gen omordningen inklusive tilldelningen till stora KLL stereotypa delmängder, är inte längre bara önskvärt men av avgörande betydelse. Detta är särskilt tydligt i denna tid av romanen therapeutics och den potential som IG gen analys har att vägleda behandling beslut5,21,22,23,36,37 ,38, som officiellt anges med den senaste uppdateringen av NCI-sponsrade riktlinjerna från den internationella Workshop på KLL24. Som sagt, stränga normer är motiverade, särskilt som fastställande av SHM status av clonotypic omordnats IGHV gen i patienter med KLL är inte en trivial fråga och innebär en process i flera steg. Viktigast av allt, vissa experimentella åtgärder, främst valet av primers, ger överlägsna resultat när specifika alternativ och/eller strategier följs, andra tekniska aspekter är mottagliga för en viss flexibilitet, såsom val av material eller metod för att bedöma clonality, på grund av att de leder till subtila skillnader, om någon, när det gäller de slutliga resultaten.
Under det senaste årtiondet, har ERIC strävat efter att främja standardisering och harmonisering av olika metoder som är relevanta för KLL diagnostik och förutsägelsen. Detta återspeglas i de utgivna rekommendationer och riktlinjer för immunogenetisk analys27,34, talrika organiserade pedagogiska verkstäder och evenemang, inrättandet av ett IG-nätverk, samt en expert online forum till diskutera och ge vägledning om IG gen sekvens tolkning vid KLL. Det övergripande målet för ERIC genom dessa åtgärder är att främja optimal klinisk hantering och vård. Trots intensiva ansträngningar, denna uppgift är långt ifrån komplett, och i själva verket har blivit mer komplicerad på grund av utvecklingen av romanen hög genomströmning sekvensering som syftar till att immun profilering. Ändå, trots utmaningar kvarstår, intensiva ansträngningar för robust standardiseringen av IG gen analys i KLL fortsätta och är för närvarande i fokus för pågående aktiviteter inom ERIC.

Kronisk lymfatisk leukemi (KLL), den vanligaste formen av leukemi hos vuxna i västvärlden, kännetecknas av mogen neoplastiska B celler1klonal expansion. Ur klinisk synvinkel är sjukdomsförloppet extremt varierande med vissa patienter upplever en aggressiv sjukdom som kräver behandling mycket tidigt efter diagnos, och ofta skovvis eller att vara refraktära mot behandling. Detta står i skarp kontrast till en betydande andel av patienterna (~ 30%) som presenterar med en indolent sjukdom, aldrig kräva behandling och har en förväntad livslängd liknar friska åldersmatchade individer2. Denna kliniska heterogenitet återspeglas i mångfalden av de molekylära avvikelser som finns i patienter med KLL som i slutändan driver patogenes och progression av denna sjukdom3.
Att fastställa en korrekt KLL-diagnos är oftast enkel, dock ovannämnda kliniska heterogenitet kan hindra en effektiv hantering av patienter med KLL och understryker behovet av prognostiska och prediktiva markörer som kunde bistå i behandling beslutsfattande2. Många studier har försökt att förfina förutsägelsen av KLL, kulminerade i ett överflöd av nya kliniska och biologiska markörer som de föreslagna4. Mutationsstatus av genen clonotypic immunglobulin tunga variabel (IGHV) är en av de mest robusta prognostiska markörerna i KLL, till stor del beror på att (i) det förblir stabil över tid och eftersom sjukdomen fortskrider, och (ii) det är oberoende av andra kliniska och biologiska parametrar5. Att trots mycket få, om några markörer, inklusive IGHV mutationsstatus, för närvarande tillämpas i klinisk rutin vid tidpunkten för diagnos.
Första rapporterna på den kliniska nyttan av IG gensekvensering i KLL datum så långt tillbaka som 1999, då 2 oberoende studier rapporterade att patienter med ingen eller en minimal somatisk hypermutation (SHM) belastning (unmutated KLL, U-KLL) har sämre prognos än patienter som bär en högre SHM börda (muterade KLL, M-KLL)6,7. Mer specifikt, U-KLL gruppen bestod av fall härbärgerat clonotypic IGHV gener med få eller inga SHM och därmed en hög procent identitet till den närmaste könsceller IGHV gen (≥98%), medan M-KLL bestod av fall med en högre mutationsanalys belastning (procent identitet till den närmaste könsceller IGHV gen < 98%). Sedan dessa tidiga studier, har det kontinuerligt visat att U-KLL fall visar en kortare tid till den första behandling (TTFT) och total överlevnad (OS) jämfört M-KLL.
I efterhand markeras dessa nyskapande studier en nyckelroll av B-cells receptor (BcR) IG i KLL patobiologi, därigenom bereda vägen för omfattande forskning i KLL-microenvironmental interaktioner vilket i sin tur lett till en mer omfattande bedömning av den biologiska heterogeniteten i sjukdom8,9. Senare studier har gett ytterligare stöd för betydelsen av immunogenetisk analyser i KLL genom att avslöja att enskilda fall kan kluster grupper på grund av delning (kvasi) identiska BcR IG gensekvenser, ett fenomen kallas BcR IG stereotypy10 ,11,12,13. Ackumulerande bevis stöder uppfattningen att patienter som tilldelats samma stereotypa delmängd harbor liknande clinicobiological egenskaper som tydligt skiljer dem från andra KLL patienter inom kategorin SHM samma men med olika IG gensekvenser; Det har faktiskt rapporterats att kategorisering av patienter med KLL baserat på BcR IG stereotypy ytterligare förfinar bulk segregeringen av patienter med KLL i U-KLL eller M-KLL grupper14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Ur klinisk synvinkel är det anmärkningsvärt att SHM status av clonotypic IGHV gen verkar korrelera med ett specifikt svar på chemoimmunotherapy. I synnerhet M-KLL-patienter behandlas med en kombination av fludarabin/cyklofosfamid/rituximab (FCR), gold standard behandling för medicinskt fit KLL-patienter som saknar TP53 genen defekter, uppvisade betydligt längre progressionsfri överlevnad (PFS) och OS jämfört med U-KLL patienter som fick den samma behandling21,22,23. Därför identifiering av SHM status blivit viktigt särskilt för att bistå i terapeutiska förvaltningen av KLL patienter dvs en prediktiv markör, snarare än för att bedöma det kliniska förloppet hos den sjukdom dvs en prognostisk markör. I själva verket, enligt den senaste uppdateringen av NCI-sponsrade riktlinjer från the International Workshop på KLL, bör SHM status av ordnas IGHV gener vara beslutsamma i alla KLL fall före behandlingsstart i både allmänmedicin och klinisk Trials24. Dessutom på grund av det senaste godkännandet av ny behandling agenter och det växande antalet droger i prövningar, kan SHM status av IG molekyl spela en ännu större roll i terapeutisk behandling av patienter med KLL i nära framtida5.
Denna rapport beskriver alla aspekter av IG-gen sekvensanalys, börjar med att välja lämpligt material och kulminerade med den kliniska tolkningen av resultaten sekvensering. Fördjupad bedömning av dessa steg är viktigt i diagnostiska rutinen för produktion av tillförlitliga resultat och för att säkerställa korrekt patientens stratifiering inom kliniska prövningar. Protokoll som stöd i harmoniseringen av IG-gen sekvensanalys, vilket säkerställer att resultaten är jämförbara mellan olika laboratorier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>02-689-4</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>362753</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer&#160;Heparin Blood Collection Tubes FAQ</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>366480</td>
			<td>material storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575038</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes PP 50 mL CS500</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X) liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21875-091</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,253,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,685,001</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190250</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer plate</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuerk solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93770</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1820-01</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52304</td>
			<td>RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td>DNA/RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X first-strand buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y02321</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers, 20 &#181;g</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT&#38;trade;&#160; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10777019</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N Y00147</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064-014</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>cDNA synthesis, PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O00065</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;(magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AB0359</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10342-020</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 5&#8242; Labeled Primers</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>PCR/Clonality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>PCR product quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>15585011</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use</td>
			<td>Geneon</td>
			<td>305-105</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-250G</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 10 well</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EC6275BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>78201.1.mL</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>PCR product clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DTCS Quick Start Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>608120</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1024282500</td>
			<td>Sanger sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,737,002</td>
			<td>general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: from patient material to sequence interpretation

Under B-cell mognad, den komplexa processen att immunglobulin (IG) gen V D J rekombination i kombination med somatisk hypermutation (SHM) ger upphov till en unik DNA-sekvens inom varje enskild B-cell. Eftersom B-cell maligniteter resultera från den klonala expansionen av en enda cell, utgör IG gener en unik molekylär signatur gemensamma för alla maligna celler inom en enskild patient; IG genen rearrangements kan således användas som klonal markörer. Förutom att tjäna som en viktig klonal identifierare, kan IG gensekvensen agera som en 'molekylär tidslinje' eftersom det är associerade med specifika utvecklingsstadier och därmed speglar historien av den B-cellen som är involverade i neoplastiska omvandlingen. Dessutom för vissa maligniteter, särskilt kronisk lymfatisk leukemi (KLL), IG gensekvensen innehar prognostisk och potentiellt förutsägande funktioner. Som sagt, extrapolera meningsfulla slutsatser från IG gen sekvensanalys vore omöjligt om robusta metoder och verktyg inte hade tillgång till stöd i sin analys. Denna artikel, den enorma erfarenhet av europeisk forskning initiativet om KLL (ERIC), detaljer de tekniska aspekterna och väsentliga kraven nödvändiga för att säkerställa tillförlitliga och reproducerbara IG gen sekvensanalys i KLL, ett test som rekommenderas nu för alla KLL patienter före behandling. Mer specifikt beskrivs olika analytiska stadier alltifrån clonotypic IG gen omordningen identifiering och bestämning av av nukleotidsekvensen noggranna kliniska tolkningen av IG gene sequence data.

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation at JoVE.com

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Häri, presenterar vi ett protokoll som Detaljer de tekniska aspekterna och väsentliga krav för att säkerställa robust sekvensanalys för IG-genen hos patienter med kronisk lymfatisk leukemi (KLL), baserat på ackumulerade erfarenheter av initiativet europeisk forskning på KLL (ERIC).

Immunglobulin Gene Sequence Analysis i kronisk lymfatisk leukemi: Från patientmaterial sekvens tolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i den kroniska lymfatisk leukemi området, såsom den exakta prognosen av patienter. Den största fördelen med denna teknik är att det är enkelt, snabbt, och mycket exakt. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot robust prognostication, de flesta särskilt riskcertifieringar med patienter med kronisk lymfatisk leukemi eftersom den korrekta prognostication kan senare definiera terapeutisk hantering av sjukdomen.Visuell demonstration av den här metoden är kritisk, till exempel PCR-produktval och analystyperna för digestsekvenser är svåra att lära sig eftersom de kräver både precision och erfarenhet. För att börja detta förfarande, tillsätt 200 mikroliter av EDTA till en 50 milliliter steril samlingsröret. Tillsätt 20 milliliter perifert blod och 15 milliliter RPMI-medium till röret och pipetten upp och ner två till tre gånger för att blanda.Därefter lägger du till 15 milliliter densitetsgradientmedium till ett nytt 50 milliliter uppsamlingsrör. Långsamt lager den perifera blodlösningen på densiteten gradient medium, se till att det inte stör lutningen. Centrifugera vid 800 gånger G i 20 minuter med centrifugbromsen av.Använd sedan en steril Pasteurpipett för att samla upp den mononukleära cellring som har bildats mellan det övre plasmaplättsskiktet och densitetsgradientens mellanskikt och överför den till ett nytt sterilt 15 milliliter uppsamlingsrör. Lägg till RPMI medium så att den slutliga volymen är 12 milliliter och pipetter lösningen upp och ner för att blanda. Centrifugera vid 800 gånger G i åtta minuter.Kassera supernatanten och återuppstäng cellpelletsen med 10 milliliter RPMI-medium. Centrifug igen vid 750 gånger G i åtta minuter. Efter detta kasserar du supernatanten och löser upp cellpelletsen i en milliliter pbs.Med hjälp av en ny Bauer-platta, bilda en cell räkna genom att blanda 20 mikroliter av prov och 80 mikroliter av en till 10 Turk lösning. Om bearbetning i senare led av provet inte är planerad till samma dag, centrifugera provet vid 750 gånger G i åtta minuter. Kassera supernatanten och förvara cellpelleten vid minus 80 grader Celsius.Förbered först primerblandningen med hjälp av ekmolära mängder av varje undergruppsprimer för att säkerställa opartisk förstärkning. Blanda PCR-reagenserna enligt listan i tabell två i textprotokollet. Tillsätt 0,5 mikroliter av TAP-polymeras till PCR-röret som innehåller de blandade PCR-reagenserna.Sedan, lägga till antingen 100 nanogram av gDNA eller två mikroliter av cDNA. Kör det termiska PCR-protokollet som detaljerat i tabell tre i textprotokollet. Efter detta, kontrollera om PCR produkter av cirka 500 baspar när du använder IGHV liter primers eller 350 baspar när du använder IGHPFR1 primer mixar.För att påbörja PCR-produktrening, lasta den totala volymen av PCR-produkten på en tre procent lågsmältande agarosgel. Låt PCR-produkterna köras på gelen tills de separeras från bakgrunden. Punktskatt de skarpa framträdande PCR-banden och sedan rena och elutera dem.Om två omorganiseringar upptäcks bör båda banden strukits och sekvenseras separat. För att utföra exo-sap cleanup, följ tillverkarens anvisningar angående de specifika volymer som ska användas. Försiktigt virvel varje prov för att blanda och inkubera dem på ett PCR-block vid 37 grader Celsius i 30 minuter.Inaktivera enzymerna genom att värma upp dem till 85 grader Celsius i 15 minuter. Efter detta, ladda en liten mängd av PCR-produkterna på en tre procent agarosgel för att bedöma produktens renhet. Den sista kontrollpunkten före sekvensering är att fastställa klonaliteten för provet med hjälp av fragmentanalys.För att börja analysera sekvensen, starta upp lämplig programvara. Ange arten, såsom homo sapiens, och receptortypen eller locusen. Pace de sekvenser som ska analyseras i fasta format och inklusive identifierare i textområdet i partier på upp till 50 sekvenser per körning.Välj sedan något av följande tre visningsalternativ för resultaten. Detaljerad vy:välj det här alternativet för att få resultaten för varje sekvens individuellt. Syntesvy:välj det här alternativet för att kompilera en sammanfattningstabell som beställts av IGHV-gen och allelnamn eller per sekvensindataordning.Det här alternativet ger också en justering av sekvenser som i någon inlämnad batch tilldelas samma IGHV-gen och allel, och slutligen Excel-fil. Välj det här alternativet om du vill tillhandahålla alla utdatafiler som kalkylblad som ingår i en enda fil. Endast användning av IGHV liter primers möjliggör förstärkning av hela längden av den omarrangerade IGHV, vilket möjliggör den sanna HSM belastningen som skall fastställas.Den förväntade PCR-produkten är cirka 500 baspar. I sällsynta fall där IGHV liter primers inte kan förstärka den clonotypic IG rearrangement, IGHBFR1 primers kan användas. Den förväntade PCR-produkten är cirka 350 baspar.De sekvenser som erhålls analyseras sedan med hjälp av verktyget IMG TV Quest. Den första raden i resultattabellen anger sekvensens funktionalitet, eftersom en IG-ordnad sekvens kan vara antingen produktiv eller improduktiv. En IGH gen rearrangement är improduktiva är stoppa kodonerna är närvarande inom antingen VDJ regionen och/eller om omorganisering är ur ramen på grund av infogningar/borttagningar.Det är viktigt att notera att endast produktiva och därmed funktionella rearrangements bör analyseras ytterligare. Vid användning av standard parametrarna IMG TV Quest, identifieras inte infogningar och borttagningar automatiskt, hur starka indikationer en sekvens än får medföra sådana ändringar tillhandahålls av verktyget och en varningsavisering visas under resultatsammanfattningstabellen. När man försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att landa PCR-produkterna på gelen tillräckligt länge så att den klonala bindningen kan diskrimineras från den polyklonala bakgrunden.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom området kronisk lymfatisk leukemi immunogenetik att utforska den prognostiska effekten av den somatiska epimutation status hos patienter. Glöm inte att arbeta med etyliumbromid kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder som att arbeta under huven hela tiden bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel och snabb metod att få hög kvalitet tumör DNA från klinisk-patologiska exemplar med Touch avtryck cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En kromatin Immunoprecipitation analysen identifiera roman NFAT2 målgener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Etablering och analys av tredimensionella (3D) organoider som härrör från patienten prostatacancer Ben metastasering exemplar och deras Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulär fraktionering av primära kroniska Lymfocytiska leukemiceller för att övervaka nukleär/Cytoplasmatisk protein handel

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Två flödescytometriska metoder för NKG2D Ligand Ytdetektering för att skilja stamceller från bulkunderpopulationer i akut myeloisk leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablera 3-dimensionella sfäroider från patient-härledda tumörprover och utvärdera deras känslighet för läkemedel

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering och odling av höggradig serös äggstockscancer patient-derived organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...