Name: membrane remodeling of giant vesicles in response to localized calcium ion gradients
Uploaded: 2018-07-16T13:30:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients at JoVE.com

1-إعداد الحويصلات الدهنية الصغيرة
<ol><li>إعداد حل الدهون جمعية مهندسي البترول/DOPS/ATTO488--المخدر في كلوروفورم مع كتلة خلط نسبة 79/20/1.The النهائي تركيز الدهون في كلوروفورم 1 ملغ/مل، وكتلة النهائي 0.6 ملغ (عادة أقل من 1 ملغ). استخدام المتاح جولة قنينة الزجاج السفلي (جولة أسفل أنابيب زجاجية، 10 × 75 مم) عند إعداد الحل الدهن دون خطوة ما قبل تنظيف.<ol>
<li>ملء وشطف المحاقن الزجاجية (25 ميليلتر) مع كلوروفورم 5 مرات على الأقل قبل الاستخدام. لتعبئة وشطف المحاقن الزجاجية 5 مرات على الأقل، 3-4 مل كلوروفورم كافية. تنبيه: عند التعامل مع كلوروفورم، استخدام المحاقن الزجاجية، وتنفيذ جميع الإجراءات في غطاء دخان أثناء ارتداء القفازات المناسبة والنظارات الواقية في جميع الأوقات. لا تستخدم أي قوارير بلاستيكية، والمحاقن، أو الممصات عند التعامل مع كلوروفورم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لف القنينة الزجاجية التي تحتوي على خليط الدهن مع رقائق معدنية لحماية المحتويات من الضوء المحيط وتتبخر المذيبات في مبخر روتاري ح 3 لإزالة كلوروفورم، مع الضغوط التي وصلت إلى 7 الجيش الشعبي الكوري فراغ 80 لفة في الدقيقة. فيلم الدهنية جافة يتكون في أسفل القنينة الزجاج بعد التبخر (الشكل 2A). ملاحظة: رفع مستوى عدة مرات واستخدام كميات أكبر من الدهون قد تتطلب وقتاً أطول من تبخر دوارة لضمان التخلص التام من كلوروفورم.</li>
	<li>ببطء بإضافة 600 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المحلول الملحي (PBS) في المخزن المؤقت (pH 7.8، دون تمييع) على رأس الفيلم الدهن المجففة. وبعد إضافة المخزن المؤقت، بلطف إضافة 6 ميليلتر من الجلسرين لحماية العينة من الجفاف الكامل خلال الخطوات (تحقيق تركيز نهائي والغليسيرول 1% بالوزن) تشكيل ملف جيوف36. ختم القنينة الزجاجية باستخدام بارافيلم، وتغطي برقائق معدنية لحماية من الضوء المحيط. تخزن في الثلاجة عند درجة 4 مئوية بين عشية وضحاها. ملاحظة: الحل المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني يتكون من ز 0.151 من قاعدة تريزما ز 1.592 ك3ص4، 1.021 ز خ2ص4، ز 0.062 مجسو4 ·7H2س وز 0.0465 يدتا في 250 مل الماء النقي. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية، والحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال. ويمكن استخدام مبلغ يعادل 10 ملم حبيس المخزن المؤقت بدلاً من حل برنامج تلفزيوني. تعد الحل المخزن المؤقت حبيس تمييع حل أسهم حبيس م 1 مع تنقية المياه.</li>
	<li>وفي اليوم التالي sonicate القنينة الزجاجية التي تحتوي على الحل بالنسبة 1 دقيقة باستخدام حمام ultrasonication في درجة حرارة الغرفة. إزالة بارافيلم و "الماصة؛" حتى يتم تشكيل حل موحد بصريا من الحويصلات الدهنية الصغيرة (الشكل 2). الكوة 30 ميليلتر من الحل حويصلة الدهن الصغيرة التي تم الحصول عليها في أنابيب بلاستيكية الفردية 0.5 مل. إبقاء هذه مختبرين الأسهم عند-18 درجة مئوية لمدة أقصاها 6 أشهر. ملاحظة: إذا كان الحل حويصلة صغيرة من الدهن لا بصريا الموحدة، دوامة الحل 4 مرات ل s 1-2 باستخدام خلاط دوامة بأقصى سرعة ممكنة.</li>
</ol>2-إعداد مجمعات جيوف-ملف
<ol><li>ذوبان الجليد أنبوب بلاستيك تحتوي على قاسمة تعليق المجمدة من الحويصلات الدهنية الصغيرة إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة الأنبوب 4 مرات ل s 1-2 باستخدام خلاط دوامة بأقصى سرعة ممكنة.</li>
	<li>جولة ميليلتر 5 مكان تعليق حويصلة الدهن الصغيرة على سطح كشف الغطاء الزجاج (24 × 60 مم) لتشكيل صغيرة الحبرية. استخدام زلة غطاء زجاج دون أي خطوات ما قبل التنظيف.</li>
	<li>ضع بكشف غطاء الزجاج في مجفف فراغ (< 100 كيلوباسكال الفراغ) لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>تخزين الفيلم الدهن المجففة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق، ثم ببطء "الماصة؛" 50 ميليلتر من 10 ملم حبيس العازلة فوق الفيلم الدهن الجاف الإماهة. انتظر 5 دقائق قبل تشكيل المجمعات جيوف-ملف (الشكل 2).</li>
	<li>مركز زلة غطاء زجاج في مرحلة مجهر، ثم "الماصة؛" 300 ميليلتر من المخزن المؤقت حبيس عليه وموقف مركز الحبرية أعلاه (الشكل 3B) والهدف.</li>
	<li>نقل 50 ميليلتر جيوف-ملف الحل قبل المشكلة إلى الحل حبيس (300 ميليلتر). انتظر 25 دقيقة قليلة شكلت مجمعات جيوف-ملف التمسك بشدة في سطح بكشف غطاء الزجاج (الشكل 2D). ملاحظة: في بعض الأحيان، مجمعات جيوف-ملف لا تشكل في كشف غطاء الزجاج وبدلاً من ذلك لوحظت بقع الدهن أو ملفس فقط. وهذا يمكن تفسيره بعرضي هز العينة أثناء خطوات 2.4 أو 2.6 أو العديد من دورات تجميد أذاب تعليق حويصلة صغيرة. كرر الخطوات من 2.1-2.6 أو استخدام حل مخزون الدهن الطازجة (الخطوة 1، 1) للحصول على مجمعات جيوف-ملف.</li>
</ol>3-ميكروبيبيتي إعداد و Microinjection
<ol><li>الجولة حواف زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية بوضع بلطف شعري ينتهي إلى شعلة شمعة للحيلولة دون كسر حين إرفاقها لصاحب ميكروبيبيتي في ميكروبيبيتي.</li>
	<li>سحب الشعيرات الزجاج على الأقل 3 استخدام ساحبة ليزر تلقائي استخدام مجموعة البرنامج: الحرارة = 400، سن الفيل = 4، حطي = 50، Del = 225، بول =؛ الحرارة = 400، سن الفيل = 4، حطي = 60، Del = 150، بول = 120. يجب أن يتم إدخال مجموعة برنامج مع القيمة الأولى لبول ترك فارغاً. استخدام زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية للقطر الداخلي (معرف) 1.00 مم والقطر الخارجي (نقلت) ملم 0.78 النتائج في ميكروبيبيتي مع فتح نصيحة من حوالي 0.3 ميكرومتر في القطر.</li>
	<li>مرة أخرى--تعبئة كل ميكروبيبيتي مع ميليلتر 8 5 مم كاكل2 الحل في حبيس المخزن المؤقت (10 ملم) باستخدام ميكرولوادير. تصفية الحل2 كاكل باستخدام 0.2-0.5 ميكرومتر محقن تصفية قبل الاستخدام لتجنب انسداد من طرف ماصة. ملاحظة: تأكد من أن كاكل2 هو حل تماما في الحل حبيس المخزن المؤقت، الذي يستخدم أيضا للخطوات 2.4-2.6.</li>
	<li>قم بتوصيل حامل ميكروبيبيتي ميكرومانيبولاتور. جبل في ميكروبيبيتي في ميكروبيبيتي حامل محكم. قم بتوصيل مضخة حقن وحامل الشعرية استخدام أنابيب الإمداد.</li>
	<li>بدء تشغيل مضخة حقن. قم بضبط الإعدادات على مضخة حقن إلى 20 hPa (ضغط الحقن) وتعيين ضغط تعويض hPa 5، في الوضع التلقائي. إيقاف مضخة حقن حتى ميكروبيبيتي جاهز microinjection.</li>
	<li>تعيين المجهر لوضع برايتفيلد. تكوينه للتدخل التفاضلية التباين (DIC). استخدم 63 X أو X ارتفاع 100 غ (1.3) الأهداف لتحقيق القرار حافة الغشاء الأمثل.</li>
	<li>استخدم ميكرومانيبولاتور الخشنة لوضع ميكروبيبيتي فوق الحبرية التي تحتوي على مجمعات جيوف-ملف. قم بتحديد موقع غيض ميكروبيبيتي فوق الهدف.</li>
	<li>تركز المجهر على نقطة الوسط للمجمع جيوف-ملف وثم إعادة تركيز حوالي 50 ميكرومتر أعلاه جيوف. استخدام وضع الخشنة ميكرومانيبولاتور لإحضار ميكروبيبيتي لطف إلى التركيز.</li>
	<li>التبديل ميكرومانيبولاتور لوضع جيد. إعادة تركيز ببطء على السطح جيوف أثناء ترجمة نصيحة ميكروبيبيتي إلى أسفل والحفاظ نصيحة في التركيز. ضع ميكرومتر نصيحة ما يقرب من 20 ميكروبيبيتي من السطح جيوف. إذا كان التلميح ميكروبيبيتي مقطوعة بسبب الاتصال العرضي مع كشف الغطاء الزجاج (على سبيل المثال في الشكل 5B)، استبداله فورا لتجنب إطلاق أيون الكالسيوم لا لزوم لها في حل معظم العينة.</li>
</ol>4-تشكيل والترجمة MTPs استخدام "مصدر أيون الكالسيوم"
<ol><li>تعيين المجهر إلى وضع الأسفار. تعيين ديتشرويكس إلى إثارة في 488 نانومتر والكشف عن الانبعاثات في 505-550 نانومتر.</li>
	<li>التبديل على مضخة حقن وبدء ضخ أيونات الكالسيوم. استخدام وضع غرامة ميكرومانيبولاتور، ونهج جيوف مع نصيحة ميكروبيبيتي ببطء. ضع نصيحة ميكروبيبيتي على مسافة 3 ميكرومتر من سطح الغشاء بينما الحقن الحل2 كاكل من ميكروبيبيتي للسماح بالخطط المتوسطة الأجل للنموذج (الشكل 4).</li>
	<li>لترجمة الخطط المتوسطة الأجل على طول السطح جيوف، تتحرك ببطء نصيحة ماصة (مع سرعة 0.1-0.3 ميكرومتر/s) حول جيوف السطحي باستخدام ميكرومانيبولاتور غرامة (الشكل 6). صيانة تقريبا نفس المسافة (3 ميكرومتر) بين سطح جيوف ونصيحة ميكروبيبيتي مع استمرار الحقن أيون الكالسيوم. ملاحظة: أسعار الترجمة عالية من طرف ميكروبيبيتي (أعلاه 0.7 ميكرومتر/s)، الخطط المتوسطة الأجل لن يرتحل في تزامن مع ميكروبيبيتي. بدلاً من ذلك، أنهم سوف مبعثر وتقصير، في حين سيتم تشكيل الخطط المتوسطة الأجل الجديدة في الموقع الجديد من طرف ميكروبيبيتي (الشكل 7).</li>
	<li>لإيقاف microinjection، إيقاف مضخة حقن ونقل ميكروبيبيتي بعيداً عن السطح جيوف.</li>
</ol>

تسمح أنظمة المحاكاة البيولوجية الخلية لدراسة سلوك الغشاء عند التعرض للمؤثرات الخارجية مثل البروتينات، أيونات أو جسيمات نانوية. جوفس، يجري هذا نموذج، يمكن الاستجابة للتغييرات في البيئة الكيميائية عن طريق تعديل شكلها، الذي غالباً ما ينطوي على تشكيل أنبوبي الهياكل وإينفاجينيشنز24،،من4142،43 .
تقدم هذه المقالة نهج لتوليد الخطط المتوسطة الأجل بطريقة الاتصال عن طريق إعادة عرض سطح جيوف عند حقن مترجمة من أيونات الكالسيوم على السطح جيوف. ويصف البروتوكول إعداد المجمع جيوف-ملف الذي يحاكي غشاء بلازما خلية، وكذلك كيفية توظيف تقنية microinjection لتوليد الكالسيوم التدرجات أيون قريبة من جيوف السطحية لنموذج الخطط المتوسطة الأجل. تعرض معظم الدراسات التجريبية السابقة التي تناولت التفاعلات غشاء أيون الكالسيوم الحويصلات الدهنية لمعظم الكالسيوم تركيز أيون14،17. تبعاً لظروف تجريبية، قد يؤدي هذا التعرض الأكبر استجابة غشاء مختلفة مع لا نتوءات أنبوبي شكلت25.
تشكيل المجمعات جيوف-ملف مباشرة بدلاً من ذلك ولا يتطلب سوى معدات المختبرات القياسية، مثل مبخر دوراني، وحمام الموجات فوق الصوتية، وفراغ مجففة. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الهامة للنظر أثناء إعداد حويصلة. من المهم التأكد من أن جفاف الحويصلات كاملة (خلال الخطوة 2، 3 من البروتوكول) ويتكون فيلم دهن دائرية جافة التي تحتوي على كمية صغيرة فقط من بلورات الملح على سطح بكشف غطاء الزجاج. أثناء التجربة، حذراً في التعامل مع الحل حويصلة، استخدام الحل مخزون الدهن الطازج في كلوروفورم، فضلا عن الطازجة حبيس العازلة، أمر أساسي للإعداد الناجح للمجمعات جيوف-ملف. وعلاوة على ذلك، المهم مرفق أمن المجمع جيوف-ملف على سطح الزجاج كشف الغطاء ميكرومانيبوليشن و microinjection. للتأكد من مناسبة انضمام جيوف-ملف المعقدة، ميكروبيبيتي (بدون حقن التدفق) يمكن استخدامها لدفع بلطف على السطح جيوف. سوف لا الشريحة حويصلة التقيد بها بشدة على طول السطح عند الاتصال الجسدي المباشر. لأنه يتم تنفيذ التجارب في الحبرية فتح المخزن مؤقت، الذي قد يكون استجوابه لعدة ساعات، تبخر يجب أن تؤخذ في الاعتبار. التبخر من الحبرية المخزن المؤقت سوف تغير الظروف ناضح، التي يمكن أن تؤثر على وزعزعة استقرار الحويصلات. لاستعادة الأحوال ناضح، إرجاع إضافة دورية من المياه النقية إلى عينة لاستعادة وحدة التخزين الأصلية النظام إلى التوازن.
عند تعديل تكوين غشاء الدهن، من الأهمية بمكان أن الحويصلات يتم إنتاجها في شكل مجمع جيوف-ملف لأنه يسمح ملف لنقل المواد الدهنية جيوف أثناء إعادة الغشاء. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن استبدال مكونات المخلوط جمعية مهندسي البترول بالدهون نقية، أو إضافة 5-30 في المائة من نسبة الكولسترول في الدم، كما يسمح لملف جيوف تشكيل معقدة28،44. غالبيتهم من جوفس استعداد أونيلاميلار45.
وعلاوة على ذلك، عند اختبار الكاتيونات divalent الأخرى، مثل أيونات المغنيسيوم، تشكيل الخطط المتوسطة الأجل يتوقف إلى حد بعيد على وجود DOPS مشحونة سلبا في خليط الدهن. دون DOPS، لا تشكل الخطط المتوسطة الأجل في الحويصلات الموصوفة في هذا البروتوكول. أيضا، والكاتيونات الفموي الأحادي التكافؤ، مثل البوتاسيوم والصوديوم، لم تسفر عن تشكيل الخطط المتوسطة الأجل، حتى في الحويصلات المحتوية على DOPS25.
بالإضافة إلى خطوات حاسمة فيما يتعلق بإعداد والتلاعب جوفس، هناك عدة عوامل هامة للنظر أثناء إجراء microinjection. Microinjection الناجح من أيونات الكالسيوم تعتمد بشكل كبير على الأداء بشكل صحيح الزجاج ميكروبيبيتيس، التي تعد اليوم من التجربة. وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب ميكروبيبيتي لعطل. أن سبب شائعة افتتاح نصيحة انسداد. جزيئات الدهن الصغيرة، التي مشتقات إعداد حويصلة، موزعة في الحل، وتميل إلى التمسك بنصيحة ميكروبيبيتي، مما يولد من انسداد. ويتم تنظيف تلميح ماصة أفضل حتى رفع من الحل حويصلة ووضعه مرة أخرى قريبة من السطح جوف. ويجب تجنب استخدام الدالة التفجرات مضخة microinjection نظراً لأنه يؤدي إلى ضخ أيونات الكالسيوم الضخمة في حل الجزء الأكبر. وعلاوة على ذلك، منع فقاعات الهواء الصغيرة الشرك داخل ميكروبيبيتي microinjection السليم، التي يستعاض عن القضية ميكروبيبيتي مع واحدة جديدة. يمكن تصغير الكسر تلميح إلى حد كبير عن طريق وضع برنامج الإعداد التجريبية على طاولة الاهتزاز الملطف للتقليل من التذبذبات تلميح.
وعلاوة على ذلك، يحتاج الرعاية الواجب اتخاذها عند اختيار نظام مراقبة، للتقليل من فوتوبليتشينج حين الحصول على الصور مرة حل أفضل. واستخدمت مجهرية fluorescence المستحثة بالليزر واسع المجال في هذا البروتوكول لأنه يسمح لمعدل الحصول على صورة عالية نسبيا في عمق موضوعية تحقيق محدودة. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام المجهر المقلوب microinjection المتزامنة والمراقبة للحويصلات الدهنية والخطط المتوسطة الأجل.
أحد القيود الرئيسية لأسلوب عرض هو شرط العمل اليدوي واسعة وكافية ميكرومانيبوليشن المهارات. لأن المجمعات التي تتشكل من خلال عملية تورم عفوية ولا يمكن التحكم في حجم جوفس وملفس. بالإضافة إلى ذلك، لا يسمح هذا البروتوكول للسيطرة على التوتر الغشاء من المجمعات جيوف-ملف المعدة، التي قد تكون ضرورية لجمع تفاصيل إضافية فيما يتعلق بإعادة عرض الغشاء. متصلة جوفس ملفس مع المواد الدهنية الموردة الأخير للنمو الكبير في الخطط المتوسطة الأجل إلى حد أنه سيكون من المستحيل تحقيق فقط استخدام الغشاء متاحة من جوفس. ملفس يسهم أيضا في تخفيض أي تغيرات التوتر السطحي الأفقي داخل ملف جيوف معقدة44، الذي من شأنه أن يعقد محاولات للسيطرة على التوتر من حويصلة باستخدام الشفط ميكروبيبيتي. يوفر هذا النموذج جيوف-المستندة إلى ملف خفض حدة توتر الذي يحاكي أفضل النظم التوتر التي وجدت في هياكل غشاء خلوي متصل بغشاء الخزانات، مثل الغشاء طيات وإينفاجينيشنز46. في الوقت نفسه، يمكن تطبيق تقنية الشفط ميكروبيبيتي بنجاح للتحكم في التوتر الغشاء جوفس واحد. على سبيل المثال، تقدم العمل الذي يقوم به غرابر et al. تفاصيل عن تكوين غشاء إينفاجينيشنز أنبوبي في جوفس واحدة عند ربط أيونات الكالسيوم للغشاء في معظم الظروف من التوتر المتنوعة نظم40. وأخيراً، يتطلب مقارنة سلوك الغشاء في التعرض المحلي والسائبة للكالسيوم تحسين الرقابة على التصاق الغشاء إلى السطح، والتي خارج نطاق هذا البروتوكول.
لتلخيص، يسمح الأسلوب المقترح لإعادة عرض تلامس الغشاء وتشكيل الخطط المتوسطة الأجل على تحفيز المترجمة مع أيونات الكالسيوم. التطبيقات المستقبلية لمركز هذا الأسلوب على الترجمة من نظم حويصلة الاصطناعية للأغشية البيولوجية الأصلية، مثل بليبس الخلية. الطريقة المقترحة يمكن إدماجها مع مخططات الاستجواب خلية واحدة أخرى، مثل أمبيروميتري التصحيح-المشبك أو ميكرويليكترودي، أو جنبا إلى جنب مع المترجمة تدفئة استراتيجيات31،،من4748. اختبار تأثير أيونات أو جزيئات أخرى واضحة، وينطوي على مجرد استبدال أيونات الكالسيوم مع جزيئات ذات الفائدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنتج الحويصلات الدهنية التركيبية المعقدة من خلال غشاء الروغان مع البروتينات ترانسميمبراني، والذي يمكن توسيع فهمنا للفيزياء الحيوية لديناميات تشكيل وغشاء الخلية الخلية المرتبطة بالاستشعار المحلية تدرجات الكيميائية. أخيرا وليس آخراً، يمكن أيضا ترجمة التحفيز تلامس الغشاء الدهني لنظم البوليمرية المسألة لينة، توفر أساسا لمنصة تلاعب تلامس رواية.

دور أيونات الكالسيوم داخل العمليات البيولوجية، على وجه التحديد مشاركتهم في الإشارات وانقسام الخلايا، والغشاء الانصهار، هو محور العديد من الدراسات الميكانيكية1. تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلايا هيولى يقارب 100 نانومتر، بينما الكالسيوم في العضيات، مثل هيولى والحويصلات الافرازية، الميتوكوندريا، الوصول إلى مستويات تصل إلى عشرات ميليمولارس في التركيز. يؤدي هذا إلى إنشاء أوامر الانحدار تركيز أيون الكالسيوم الحاد من حجم عبر الأغشية داخل الخلية2،3،،من45،،من67،8 ،9. مستوى أيون الكالسيوم خارج الخلية حوالي 2 ملم ومن ثم تحدث اختلافات تركيز أيون الكالسيوم على الصعيدين خارج الخلية وداخل الخلية. وعلاوة على ذلك، مزامنة الأخيرة الدراسات دليلاً على أن أيون الكالسيوم داخل الخلايا مما يشير إلى الأحداث ونشاط الخلايا العصبية يمكن أن يحدث في ظل ظروف التقلبات المحلية من تركيزات أيون الكالسيوم خارج الخلية، مما يشير إلى أهمية داخلها والكالسيوم خارج الخلية أيون الاختلافات10.
تهدف إلى فهم التفاعل بين أيونات الكالسيوم والأغشية البيولوجية، واتباع نهج اصطناعية التي يتم استبدال أغشية الخلية الأصلية بدهن بلير حويصلات قد نفذت بنجاح. تعريض الحويصلات إلى حلول أيون الكالسيوم يؤدي إلى تغييرات في مجموعات دهن الرأس والهيدروكربونية سلسلة التعبئة، والغشاء زيادة التوتر، وتجميع حويصلة، فضلا عن فصل الدهون والغشاء المرحلة الانتقالية11،12 ،،من1314،،من1516. خصائص الأغشية الدهنية عند التعرض لأيونات الكالسيوم قد تم التحقيق باستخدام هذه التقنيات التجريبية كالأشعة السينية، 1ح-الرنين المغناطيسي النووي، والدراسات الطيفية أو دينامي حراري11،16، 17 , 18-وفي هذه الدراسات، تكوين غشاء يتم ضبطها وكثيراً ما تشبه أغشية الخلية الأصلية وتحتوي على مثل هذه الدهون الفسيولوجية phosphatidylcholine (PC) وفوسفاتيديليثانولاميني (PE) وفوسفاتيديلسيريني (PS). ملاحظة: يكتسي أهمية خاصة في إعداد حويصلة مصطنعة لأنها عنصر أساسي في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك الاتجار بغشاء داخل الخلايا، والرقابة، والمبرمج19،20.
غالباً ما يتراوح حجم الحويصلات الدهنية المركبة نانومتر إلى عدة ميكرومتر. بين حويصلة مختلف الاستعدادات، الحويصلات أونيلاميلار العملاقة (جوفس)، التي هي عدة عشرات ميكرومتر في القطر، تتسم بأهمية خاصة نظراً لحجمها الكبير نسبيا، تشبه الخلايا أبعاد الفرد21 , 22 , 23-مساحة متوفرة جوفس تمكن أثر التدرجات الكيميائية المحلية على غشاء الخصائص الفيزيائية دراستها. وذلك بتعريض جزء من سطح الغشاء للمؤثرات الخارجية فقط، يمكن أن يحقق أوثق ديناميات الغشاء. على سبيل المثال، فقد ثبت أن التطبيق المترجمة من التدرجات الكيميائية أو درجة الحموضة إلى سطح جوفس يؤدي إلى تكوين نتوءات أنبوبي، التي لم تراع في المجمع التعرض24،25. ما لوحظ من الاختلافات في سلوك الغشاء الدعوة لزيادة تطوير أسلوب مخططات الاستجواب حويصلة واحدة الحصول على بعض الأفكار في آليات إعادة عرض غشاء الخلية.
بناء على أساليب microinjection وميكرومانيبوليشن من أوائل القرن العشرين26،27، فيما يتعلق بالتطورات الأخيرة أكثر من مخططات التلاعب حويصلة واحدة من،القرن الحادي والعشرين2328 ، يعرض هذا المقال نهج في الغشاء الذي يعيد البناء وتشكيل غشاء نتوءات أنبوبي (MTPs) في غشاء جيوف يتم إنشاؤها استجابة للطلب المحلي من أيونات الكالسيوم.
ويستخدم نهجنا حويصلة معقدة تتألف من جيوف متصلاً حويصلة مولتيلاميلار (ملف) كنظام نموذجي غشاء المحاكاة البيولوجية (الشكل 1A). ملف مطلوب كمستودع المحتوى دهني للمجمع لتوريد المواد الدهنية جيوف أثناء التعرض لتدرج أيون كالسيوم. يتيح هذا الاتصال المعقدة للتعويض عن زيادة التوتر الغشاء أثناء إعادة عرض المستحث وشكل الانتقال من الغشاء جيوف وتوفر الدهون للنمو الخطة المتوسطة الأجل. وعلاوة على ذلك، يسهل ملف التثبيت السطحي لأن كتلته أكبر مقارنة جيوف. المجمعات جيوف-ملف، عند معطلة على ركيزة صلبة، وقد استخدمت سابقا لإنتاج شبكات أنابيب نانوية-حويصلة، ودراسة التفاعل غشاء البوليمر، ومحاكاة المراحل المتأخرة من الرقابة29،30، 31،،من3233.
تستخدم البروتوكولات السابقة فول الصويا استخراج الدهن القطبي (SPE) لإعداد ملف جيوف مجمعات28. جمعية مهندسي البترول يتكون من خليط فوسفوليبيدات التي تتضمن أجهزة الكمبيوتر (45.7%)، PE (22.1%)، فوسفاتيديلينوسيتول (PI، 18.4 في المائة)، حمض فوسفاتيديك (السلطة الفلسطينية، ونسبة 6.9 في المائة)، وهي مزيج من الدهون الأخرى (6.9%). في بروتوكولنا هنا، هي يخدر الخليط جمعية مهندسي البترول بنسبة 20% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (ملح الصوديوم) (DOPS) لتقليد النشرة الداخلية لغشاء بلازما الخلية. % 1 إضافية أتو 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-منشطات) يستخدم لوصمة عار بلير الدهن لتمكين الرصد من الغشاء يعيد البناء باستخدام مجهر الأسفار. جوفس تكوين الدهن متماثل عبر بلير ويتعرض محلياً لتركيزات 5 مم من كلوريد الكالسيوم (كاكل2). أيضا تقليد هذه الظروف التجريبية، مع تركيز أيون كالسيوم مرتفعة، النشرة الغشاء الخارجي للخلايا أبوبتوتيك، حيث تكون الجزيئات PS أعرب34. تشكيل المجمعات جيوف-ملف يتطلب استخدام أسلوب الجفاف باﻹماهة معدلة وضعت في البداية من قبل كثيرين وكيلر35. ويتضمن بروتوكول إعداد حويصلة تشكيل طبقة الدهن الجاف، الذي ثم يستخدم بشكل حويصلات صغيرة في الحل. هذا الحل هو المجففة ثم امهاء لتشكيل المجمعات جيوف-ملف النهائي. الشكل 2 ألف د- يوضح الخطوات الأساسية لإعداد مجمع جيوف-ملف نموذجي.
بعد الانتهاء من إعداد حويصلة وهو المعطل تداولها حويصلة المعقدة في الركيزة الزجاج، يستخدم تقنية microinjection بتسليم كميات صغيرة من أيونات الكالسيوم إلى النشرة الخارجي من جوف من خلال ميكروبيبيتي زجاج تلميح مفتوحة. تدفق حل الكالسيوم من الطرف يولد تدرج أيون كالسيوم مترجمة على سطح الغشاء جيوف، مما يؤدي إلى إعادة عرض الغشاء وتوليد الخطط المتوسطة الأجل. تتجه بعيداً عن مصدر أيون الكالسيوم الخطط المتوسطة الأجل وتنمو داخل جيوف. هذا تشكيل الخطة المتوسطة الأجل يمكن رصدها مباشرة باستخدام مجهر الأسفار وتسجيلها باستخدام كاميرا رقمية. ويبين الشكل 3 الإعداد التجريبية المستخدمة لإنتاج الأغشية إعادة عرض. تشكيل الخطط المتوسطة الأجل (2E الشكل و الشكل 4) في هذا البروتوكول يوضح نتيجة متناقضة لايون الكالسيوم التعرض التجارب تجري في ظروف التخزين الأكبر. تحت معظم الظروف، تمزق جوفس وتشكل بقع الأغشية التي يمكن ملاحظتها على التمسك بسطح الزجاج25.
مزيد من التفاصيل حول تشكيل المجمعات جيوف-ملف، فضلا عن إجراءات لتنفيذ microinjection أيونات الكالسيوم، وهي الموضحة في هذه المقالة. البروتوكولات وتركز إلى حد كبير على microinjection أيون الكالسيوم؛ ومع ذلك، يمكن بسهولة تعديل هذا النهج لاستخدامها في دراسة الردود الغشاء بسبب التعرض المحلي إلى أيونات أو البروتينات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ضبطها تكوين الحويصلات لعزل أدوار المكون الدهني عملية إعادة عرض الغشاء. لا يتطلب أي معدات متطورة لإنتاج مجمعات جيوف-ملف البروتوكول قدم وتتميز بدرجة عالية من إمكانية تكرار نتائج.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="890">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:455px;">Soy bean polar lipid extract</td>
			<td style="width:151px;">Avanti 
			Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td>
			<td style="width:119px;">541602C</td>
			<td style="width:167px;">100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS</td>
			<td style="width:151px;">Avanti 
			Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td>
			<td>840035C</td>
			<td>1x25 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>ATTO-TEC (Germany)</td>
			<td>AD 488-31</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Hamilton&#160;syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25&#160;&#956;L, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51&#160;mm (2&#160;in.)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">20735&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack</td>
			<td style="width:151px;">Corning Incorporated (Corning, NY 14831)</td>
			<td style="width:119px;">99445-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Chloroform&#160;CHROMASOLV&#160;Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, contains amylenes as stabilizer</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">650498-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:151px;">B&#252;chi Rotavapor R-144 Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm</td>
			<td style="width:151px;">KEBO lab (Sweden)</td>
			<td style="width:119px;">MA00360500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO</td>
			<td style="width:151px;">Sharlau Chemie S.A. (Spain)</td>
			<td style="width:119px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Glycerol, for molecular biology, minimum 99%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">T-1503 2050 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Trizma base</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">P5629-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium phosphate tribasic (K3PO4)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">MgSO4</td>
			<td style="width:151px;">Merck (USA)</td>
			<td style="width:119px;">34549-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">EDTA</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>H0887 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">HEPES solution 1&#160;M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">Z260282-1PAK</td>
			<td>24x60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Acrodisc&#160;syringe filters,&#160;PVDF membrane, diam. 13&#160;mm, pore size 0.2&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>631-1339&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Menzel Gl&#228;zer #1, glass cover slip</td>
			<td style="width:151px;">VWR (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Diaphragm vacuum pump for the desiccator</td>
			<td style="width:151px;">Vacuubrand (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Ultrasonicate bath</td>
			<td style="width:151px;">Bandelin Sonolex (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">VX-100 Lab vortexer vortex mixer</td>
			<td style="width:151px;">Labnet International (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">488 nm laser line&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Microsystems&#160;immersion oil for microscopes</td>
			<td style="width:151px;">Leica (Germany)</td>
			<td>12847995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:455px;">Inverted fluorescence microscopy system&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)</td>
			<td style="width:151px;">Technologies GmbH (Thuringia, Germany)</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">PatchStar Micromanipulator</td>
			<td style="width:151px;">Scientifica (Uckfield, UK)</td>
			<td style="width:119px;">612-7933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,&#160; 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.&#160;</td>
			<td colspan="2">Harvard Apparatus U.K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microloader (pipette tips)</td>
			<td style="width:151px;">VWR (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P-2000 CO2 laser-puller&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sutter Instruments (Novato, USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet</td>
			<td style="width:151px;">Eppendorf (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane remodeling of giant vesicles in response to localized calcium ion gradients

في مجموعة متنوعة واسعة من عمليات الخلية الأساسية، مثل الاتجار بغشاء والمبرمج، تحدث التحولات شكل غشاء الخلية التزامن مع الاختلافات المحلية في تركيز أيون الكالسيوم. وقد تم التعرف على المكونات الجزيئية الرئيسية المشاركة في هذه العمليات؛ ومع ذلك، أقل بكثير يعرف التفاعل محددة بين التدرجات أيون الكالسيوم والدهون داخل غشاء الخلية، أساسا بسبب الطابع المعقد للخلايا البيولوجية وصعوبة من أنظمة المراقبة. لسد هذه الفجوة، ينفذ بنجاح نهج اصطناعية للكشف عن أثر مترجمة من أيونات الكالسيوم في غشاء الخلية يقلد. إنشاء تقليد تشبه الظروف داخل خلية مشكلة سيفيرالفولد. أولاً، أن نموذج المحاكاة البيولوجية مناسبة مع الأبعاد المناسبة وتكوين غشاء مطلوب لالتقاط الخصائص الفيزيائية للخلايا. ثانيا، مطلوب إعداد ميكرومانيبوليشن لتسليم كمية صغيرة من أيونات الكالسيوم إلى مكان غشاء خاص. وأخيراً، مطلوب نظام مراقبة لاكتشاف وتسجيل استجابة الغشاء الدهني للمؤثر الخارجي. تقدم هذه المقالة نهج المحاكاة البيولوجية مفصلة لدراسة التفاعل غشاء أيون الكالسيوم، حيث يتعرض نظام حويصلة في الدهون، يتكون من أونيلاميلار العملاقة حويصلة (جيوف) متصلاً حويصلة مولتيلاميلار (ملف)، لكالسيوم مترجمة وشكلت التدرج اللوني باستخدام نظام microinjection. لاحظ استخدام مجهر الأسفار ديناميات تأثير الأيونية في الغشاء وسجلت أسعار إطار الفيديو. نتيجة تحفيز غشاء، الغاية منحنى غشاء نتوءات أنبوبي (MTPs) شكلت داخل جيوف، التوجه بعيداً عن الغشاء. النهج الذي وصف بالحث على إعادة عرض الغشاء الدهن وإنتاج الخطة المتوسطة الأجل بطريقة الاتصال بها والتي تسيطر عليها تماما. ويدخل هذا النهج وسيلة لمعالجة تفاصيل التفاعلات غشاء أيون الكالسيوم، توفير سبل جديدة لدراسة آليات إعادة تشكيل غشاء الخلية.

في هذا العمل، ونظهر إنشاء مجمعات جيوف-ملف وكيف يمكن استخدامها لتوضيح تأثير التدرجات أيون الكالسيوم على ديناميات غشاء الخلية. المجمعات جيوف-ملف مرفق بسطح مطلوبة لهذه التجارب للسماح تقليد ثابت الحجم الخلية أثناء تأسيس تدرج أيون من خلال microinjection. الغشاء جيوف الذي يستجيب لتركيز الكالسيوم المترجمة من خلال تشكيل MTPs موجها بعيداً عن مصدر أيون الكالسيوم. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يترجم الخطط المتوسطة الأجل حول جيوف بطريقة الاتصال بتحريك طرف ميكروبيبيتي حول سطح الغشاء.
ويرد على توضيح إجراءات إعداد ملف جيوف تخطيطي في الشكل 2. على الرغم من أن الفعل مسبقاً في البروتوكول المقدم، ويتم تشكيل المجمعات جيوف-ملف أثناء الخطوة 2، 4 (الشكل 2)، نقل الحل حويصلة إلى آخر قطره ميليلتر 300 من المخزن المؤقت (الخطوة 2، 6 من البروتوكول) يسمح مجمعات جيوف-ملف المشكلة قليلة إلى تلتزم بما فيه الكفاية بالركيزة الزجاج. وبهذه الطريقة، يتم تأسيس مجمع مناسبة ميكرومانيبوليشن و microinjection (الشكل 2D). في بعض الأحيان، جوفس تحتوي على واحد أو عدة حويصلات الدهن فخ، التي لا تؤثر في تشكيل الخطة المتوسطة الأجل، كما هو مبين في الشكل 4A. تنتج هذه جوفس الخطط المتوسطة الأجل؛ ومع ذلك، قد أعاقت التصوير إذا كانت الحويصلات فخ كبير. غالبية جوفس استعداد (تصل إلى 75 ٪) تظهر الكرة وإرفاقها ملفس، كما هو مبين في الشكل 1 ألف. هذه الحويصلات هي المحور الرئيسي لهذا البروتوكول، وهي مناسبة للإجراء microinjection. حوالي 25% جوفس المتبقية تظهر متموجة (الشكل 1B)، وهو يدل على نظام التوتر الغشاء السفلي. كما تسمح هذه الحويصلات المتموجة لتشكيل نتوءات أنبوبي؛ ومع ذلك، أنها تظهر حركية مختلفة ومن مورفولوجية مختلفة MTPs المشكلة، التي خارج نطاق هذا بروتوكول25. القطر نموذجية من الحويصلات استعداد يتفاوت بين 2 إلى 15 ميكرون ملفس وبين 2 إلى 40 ميكرومتر جوفس. جيوف الأمثل حجم التعرض لأيونات الكالسيوم هو 5 ميكرون أو أكبر.
وقد استخدمت ميكروبيبيتيس في الخلية أحرق الاستجواب مخططات كذلك كما هو الحال في الإجراءات التي تتطلب التلاعب جوفس الاصطناعية لعدة عقود37،38. وتشارك معظم هذه التطبيقات الاتصال المادي المباشر بين ميكروبيبيتي والسطح من الخلايا أو حويصلات. وتشمل الأمثلة تقنية التصحيح-المشبك أو سحب الحبال غشاء من الغشاء جيوف، بالإضافة إلى بناء أنبوب نانوي-حويصلة شبكات23،،من2839. في الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا لإنشاء التدرجات مترجمة من الأيونات والجزيئات حول جوفس لإعادة بناء الخلية غير المتجانسة ميكرونفيرونمينتس24،25ميكروبيبيتيس. في البروتوكول المقدم، وميكروبيبيتي يعمل بشكل سليم (الشكل 5A) عاملاً حاسما لإنشاء تدرج أيون كالسيوم على السطح جيوف عن طريق الإفراج عن الحل الوارد ضمن. وضعية ميكروبيبيتي في السطح جيوف السليم وتجنب الاتصال مع الغشاء الدهني ضرورية لنجاح microinjection. نصيحة ميكروبيبيتي يقام على مسافة حوالي 3 ميكرومتر من السطح جيوف، وعلى مسافة أمثل لتوليد MTPs بينما يقلد تباينات كالسيوم قرب غشاء الخلية. إذا كان التلميح ميكروبيبيتي كسر الصدفة (الشكل 5B)، مطلوب بديل. مجموعة كاكل تركيز سبق اختبارها2 داخل ميكروبيبيتي، الذي يسمح بتشكيل الخطة المتوسطة الأجل، بين 2 و 5 ملم25، الذي يتوافق مع تركيزات الكالسيوم خارج الخلية. ولوحظت في تركيزات أقل من2 كاكل، أي، 1 مم، لا MTPs.
تشكيل MTPs عند microinjection الكالسيوم يبدأ مع تشكيل إينفاجينيشنز الغشاء الصغيرة، التي تنمو في الخطط المتوسطة الأجل في موقع التعرض (الشكل 4 باء). الخطط المتوسطة الأجل تستمر في النمو ما دامت بقايا الغشاء جيوف تتعرض لأيونات الكالسيوم. أنها تتقلب وأشر بعيداً عن مصدر أيون الكالسيوم (الشكل 4، 1 فيلم التكميلية). عندما يتم إنهاء العرض أيون الكالسيوم الخطط المتوسطة الأجل مبعثر فوق سطح جيوف، مما يجعل من الصعب على اختتام سواء الخطط المتوسطة الأجل البقاء أو تختفي في نهاية المطاف.
تشكيل MTPs يمكن تفسيره بايون الكالسيوم المترجمة ملزمة للنشرة الخارجي يتعرض الغشاء جيوف وتسبب انحناء عفوية (m)، الذي يرتبط مباشرة مع تشكيل عفوية التوتر σ = 2κm2 (وهو صلابة الانحناءκ )، التي تؤدي إلى الانحناء للغشاء وتشكيل MTPs إلى الداخل. وقد أظهرت التقارير السابقة يمكن أن تشوه الغشاء أوضح بالتكثيف و/أو تجميع الدهون مشحونة سلبا على ربط أيونات الكالسيوم للغشاء، أدى إلى انحناء العفوية السلبية40. بدلاً من ذلك، ملزمة قوية من Ca2 + إلى سطح بلير مشحونة سلبا على تحييد كثافة الدهن يتعرض بلير النشرة تهمة السطحية. وهذا يؤدي إلى اختلاف الكثافة تهمة عبر بلير، أدى إلى انحناء عفوية غير صفرية، كافية لثني غشاء25.
لاحظ تشكيل MTPs يوضح حساسية الأغشية الدهنية إلى أيونات الكالسيوم ويقدم نهجاً جديداً يمكن الاتصال بها لإنتاج هياكل أنبوبية الغشاء. توضيح المنشأ لهذا توبوليشن الغشاء يمكن أن تكون هامة لفهم ديناميات الغشاء شكل الانتقال خلال مختلف وظائف الخلية وإعادة تشكيل الخلية ويمكن أن تكون مفيدة لاكتساب رؤى في تنظيم الدهون داخل الخلية الأغشية.
دائماً يتم إنشاؤها MTPs الملحوظ في الموقع على الغشاء تمر التعرض أيون الكالسيوم. وهكذا، عن طريق اختيار موقع طرف ميكروبيبيتي، فمن الممكن لتحديد منطقة سطح جيوف لنمو نتوء. المقبل، إذا كان ميكروبيبيتي ببطء (0.1-0.3 ميكرومتر/s) يتنقلون على السطح جيوف، مع المحافظة على المسافة الفاصلة من الغشاء، تترجم الخطط المتوسطة الأجل جنبا إلى جنب مع ميكروبيبيتي. الرقم 6 و التكميلية المقابلة 2 الفيلم تثبت هذه الهجرة للخطط المتوسطة الأجل حول سطح جيوف. هذه العملية من المحتمل أن تكون مصحوبة بتشكيل الخطط المتوسطة الأجل الجديدة على حقن أيون الكالسيوم المستمر25. أسعار الترجمة عالية (أعلاه 0.7 ميكرومتر/s)، الخطط المتوسطة الأجل ليست قادرة على اتباع نصيحة ميكروبيبيتي. بدلاً من ذلك، يتم تشكيل نتوءات الجديدة في الموقع الجديد من طرف ميكروبيبيتي (الشكل 7).
الكالسيوم تلامس الملاحظة الموجهة بايون ترجمة MTPs حول جيوف السطحية يمكن زيادة فهمنا للقيادة القوات وراء ديناميات هياكل أنبوبية غشاء داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يقدم هذا النهج وضع تلامس رواية لمراقبة نقل المواد في نظم هذه المسألة لينة باستخدام التدرجات الكيميائية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig1.jpg"> الشكل 1 : صور الممثل مجهر فلوري مجمعات جيوف-ملف معطلة على السطح من زلة غطاء الزجاج. (أ)-مثال جيوف كروية. جوف يظهر في شكل نصف الكرة إرفاقه ملف. (ب)-مثال جيوف المتموجة. السهام السوداء تشير إلى المناطق المشوهة للغشاء. تعزيز الصور ومقلوب لتحسين تصور الأغشية جيوف المسمى فلوريسسينتلي. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig2.jpg"> الشكل 2 : الرسوم التوضيحية التخطيطي لإعداد ملف جيوف ومخططات microinjection. (أ)-تشكيل طبقة دهن جاف في أسفل القنينة الزجاج نتيجة التبخر الروتاري كلوروفورم من الحل الدهن. (ب)-هو سونيكاتيد في طبقة الدهن امهاء، وتتشكل الحويصلات الدهنية الصغيرة. (ج)-المعالجة تجميعية صغيرة الحل حويصلة (5 ميليلتر) وضعها على السطح من زلة غطاء الزجاج وتحويله إلى مجفف لمدة 20 دقيقة يذوي الحل الدهن وتشكيل فيلم دهن جاف (لا تظهر هذه الخطوة). ريهيدراتينج الفيلم الدهن الجاف مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت الحل تنتج مجمعات جيوف-ملف سابق التشكيل. (د)-نقل المجمعات سابق التشكيل إلى حجم أكبر من نتائج المخزن المؤقت في تشكيل ملفس جيوف المنفصلة قليلة تعلق على سطح بكشف غطاء الزجاج. (ه)-تحديد المواقع ميكروبيبيتي القرب من السطح جيوف وإطلاق أيونات الكالسيوم يؤدي تشكيل الخطط المتوسطة الأجل. لا يتم رسمها في الرسوم التوضيحية للجدول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig3.jpg"> الشكل 3 : برنامج الإعداد التجريبية ل microinjection أيونات الكالسيوم. (أ)-مكونات الإعداد التجريبية اللازمة لتوليد الخطط المتوسطة الأجل في جوفس. (ب)-تفاصيل إعداد microinjection. ساترة زجاجية مع حل المجمعات جيوف-ملف توضع في مرحلة المجهر. هو الزاوية بين ميكروبيبيتي وسطح بكشف غطاء الزجاج 30° (ملحوظ في الأبيض). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig4.jpg"> الشكل 4 : تكوين MTPs عند microinjection أيونات الكالسيوم على السطح جيوف. (أ)-ملف جيوف المجمع قبل التعرض لتدرج أيون كالسيوم. يشير السهم إلى حويصلة دهن الشرك داخل جوف، والتي لا تعرقل مراقبة MTPs. (ب). وتتشكل MTPs الصغيرة عند microinjection أيونات الكالسيوم (تركيز كاكل2 في ميكروبيبيتي 5 ملم). (ج)-النمو في الخطط المتوسطة الأجل عند التعرض المستمر لأيونات الكالسيوم. تعزيز الصور الفلورية ومقلوب لأغراض التصور. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig5.jpg"> الشكل 5 : زجاج ميكروبيبيتيس المستخدمة للكالسيوم أيون microinjection. (أ)-مثال ميكروبيبيتي يعمل بشكل سليم. (ب)-مثال ميكروبيبيتي يحتوي تلميح كسر (يشار إلى المنطقة المتضررة مع سهم أسود). كل الصور المحسن ومقلوب لرؤية أفضل. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig6.jpg"> الرقم 6 : ترجمة تسترشد أيون الكالسيوم MTPs حول سطح جيوف. (أ)-"الخطط المتوسطة الأجل" تتشكل على سطح جيوف عند microinjection 5 مم كاكل2 الحل. (ب-ج). ترجمة طرف ميكروبيبيتي (0.2-0.3 ميكرومتر/s) حول الغشاء مشغلات سطح حركة الخطط المتوسطة الأجل في اتجاه مصدر أيون الكالسيوم. السهام السوداء تسليط الضوء على اتجاه حركة ميكروبيبيتي. تعزيز الصور ومقلوب لتحسين التصور الغشاء. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig7.jpg"> الشكل 7 : MTPs معدل الترجمة عالية من طرف ميكروبيبيتي- (أ)-"الخطط المتوسطة الأجل" تتشكل على سطح جيوف عند microinjection مم 5 كاكل2 الحل (الخط الأبيض). (ب-ج). النتائج بمعدل ترجمة عالية ميكروبيبيتي حول سطح جيوف (1 ميكرومتر/s) في تشكيل الخطط المتوسطة الأجل الجديدة في الموقع الجديد من طرف ميكروبيبيتي (خط أرجواني)، فضلا عن تشتت MTPs شكلت سابقا (الخط الأبيض). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov1.jpg"> فيلم التكميلي 1: تشكيل الخطط المتوسطة الأجل في جيوف عند التعرض المترجمة إلى المرجع المصدق 2 + التدرج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_1.avi" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيلم-</a> 
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov2.jpg"> فيلم تكميلي 2: الكالسيوم أيون الاسترشاد الهجرة الخطة المتوسطة الأجل حول سطح جيوف.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_2.avi" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيلم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients at JoVE.com

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

نقدم تقنية للاتصال ميكرومانيبوليشن من الحويصلات، استخدام التدرجات أيون الكالسيوم المترجمة. Microinjection الحل أيون الكالسيوم، بالقرب حويصلة دهن عملاقة، يستخدم ليعيد الغشاء الدهني، أسفر عن إنتاج الأغشية نتوءات أنبوبي.

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

كشف تسريع التدهور الحتمي أسعار المستحثة بواسطة المذيبات حيوية في غشاء الانزيمات

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Analyzing the Photo-oxidation of 2-propanol at Indoor Air Level Concentrations Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry

تحليل الصور-أكسدة 2-بروبانول بتركيزات مستوى الهواء في الأماكن المغلقة باستخدام حقل أيون غير المتناظر التنقل قياس الطيف الكتلي

We demonstrate a versatile protocol to be used for determining the effectiveness of photocatalysts in degrading indoor air concentration (ppb) volatile ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

إنزيم TET2 انقسام هندسيا للحمض النووي الكيميائية إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

أسلوب إعداد نموذج فعال لتعزيز الإشارات أيون الكربوهيدرات في مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين الكتلي

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

تشكيل كربونات الكالسيوم في وجود المضافات البوليمرية الحيوية

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

تقنيات قياس الطيف الكتلي للتنقل من أيون لتحديد بنية وآليات التعرف على الأيون المعدني ونشاط الأكسدة من Oligopeptides التجليد المعدني

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

امتصاص الحويصلات الهجينة العملاقة أحاديه الجانب بالكهرباء وقياس خواصها الميكانيكية من خلال شفط الماصات المجهرية

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

3D عمق الشخصي إعادة بناء الشوائب المنفصلة باستخدام مطياف الكتلة الأيونية الثانوية

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Localized Bathless Metal-Composite Plating via Electrostamping

المترجمة بلا حمام المعادن المركبة الطلاء عن طريق االكهربة

Composite plating with particles embedded into the metal matrix can enhance the properties of the metal coating to make it more or less conductive, hard, ...