Name: membrane remodeling of giant vesicles in response to localized calcium ion gradients
Uploaded: 2018-07-16T13:30:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients at JoVE.com

1. подготовка небольших липидов пузырьки
<ol><li>Приготовляют раствор липидов SPE/DOPS/ATTO488-ДОПИНГ в хлороформе с массой пропорции 79/20/1.The окончательный концентрацию липидов в хлороформе 1 мг/мл, и окончательный массой 0,6 мг (обычно менее 1 мг). Использование одноразовых вокруг нижней стеклянных флаконов (круглая снизу стеклянных трубок, 10 x 75 мм) при подготовке решения липидного без предварительной очистки шаг.<ol>
<li>Заполните и промойте стекло шприцы (25 мкл) с хлороформом, по крайней мере 5 раз перед использованием. Чтобы заполнить и промойте стекло шприца по крайней мере 5 раз, достаточно 3-4 мл хлороформа. Предупреждение: Когда обработка хлороформ, использовать стеклянные шприцы и выполнять все процедуры в вытяжной шкаф при ношении соответствующей Перчатки и защитные очки во все времена. Не использовать любые пластиковые флаконы, шприцы или пипетки, при обработке хлороформ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Оберните стеклянный флакон, содержащий смесь липидов с металлической фольгой, чтобы защитить содержимое от окружающего света и испарения растворителя в роторный испаритель для 3 h для удаления хлороформ, с давлением, достигнув 7 кПа вакуум в 80 об/мин. Сухой липидов пленка образуется в нижней части стекла флакона после испарения (рис. 2A). Примечание: Масштабирование вверх несколько раз и использовать большие объемы липидов может понадобится больше времени Ротари испарения для обеспечения полного удаления хлороформ.</li>
	<li>Медленно добавьте 600 мкл фосфата буфер солевой (PBS) буферного раствора (рН 7,8, без разбавления) поверх фильма сушеные липидов. После добавления буфера аккуратно мкл 6 глицерин для защиты образца от полного обезвоживания во время GUV-MLV формирования шаги (достижение конечной концентрации глицерина 1 wt %)36. Уплотнение стекла флакона с использованием парафина и крышка с металлической фольги для защиты от окружающего света. Хранить в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь. Примечание: PBS буфера решение состоит из 0.151 g Trizma базы, 1.592 g K3PO4, 1.021 g KH2PO4, 0,062 g O MgSO4 ·7H2и 0.0465 г ЭДТА в 250 мл очищенной воды. Хранят раствор при температуре 4 ° C и нагреть до комнатной температуры перед использованием. Эквивалент 10 мм HEPES буфера может использоваться вместо решения PBS. HEPES буферный раствор готовится путем разбавления 1 М HEPES раствор очищенной водой.</li>
	<li>Следующий день, sonicate стекла флакон, содержащий решение за 1 мин, с использованием ultrasonication Ванна при комнатной температуре. Удаление парафина и Пипетка до визуально единообразное решение малого липидов везикулы формируется (рис. 2B). Аликвота 30 мкл раствора везикул полученные небольшой липидов в отдельных 0,5 мл пластиковых труб. Держите эти акции аликвоты при-18 ° C для максимум 6 месяцев. Примечание: Если небольшой липидов везикул раствор не визуально обмундирования, вихревой решение 4 раза для 1-2 s с помощью вихревой смеситель на максимальной скорости.</li>
</ol>2. Подготовка GUV-MLV комплексов
<ol><li>Оттепель в комнатной температуре пластиковая трубка, содержащая Алиготе замороженных подвески малых липидов везикулы. Вихрь трубки 4 раза для 1-2 s с помощью вихревой смеситель на максимальной скорости.</li>
	<li>Место 5 мкл подвеска везикул небольшой липидов на поверхность стекла Крышка выскальзования (24 x 60 мм) сформировать небольшой круглой капли. Использование стекла покрытие скольжения без каких-либо предварительно очистки шагов.</li>
	<li>Поместите крышку выскальзования стекла в вакуумный сушильный шкаф (< 100 кПа вакуум) за 20 мин.</li>
	<li>Хранить сушеные липидных Фильм при комнатной температуре в течение 4 мин, а затем медленно Пипетка 50 мкл буфера HEPES 10 мм на вершине сухой липидной пленки для регидратации. Подождите 5 минут в предварительной форме GUV-MLV комплексы (рис. 2 c).</li>
	<li>Центр стекла покрытие скольжения микроскопа, а затем Пипетка 300 мкл буфера HEPES на него и расположите центр капелька выше цели (рисунок 3B).</li>
	<li>Передача 50 мкл предварительно сформированных GUV-MLV раствора в HEPES раствор (300 мкл). 25 мин, подождите, чтобы позволить малонаселенных сформированные комплексы GUV-MLV твердо придерживаться на поверхности стекла покрытие скольжения (Рисунок 2D). Примечание: Иногда, GUV-MLV комплексы не образуют на стекло крышки выскальзования и вместо этого наблюдаются липидные пятна или только MLVs. Это можно объяснить встряхнув случайной выборки во время шагов 2.4 или 2.6 или многочисленных циклов замораживания оттаивания небольшой пузырек подвески. Повторите шаги 2.1-2.6 или использовать свежеприготовленные липидов Стоковый раствор (шаг 1.1) для получения GUV-MLV комплексов.</li>
</ol>3. микропипеткой подготовка и микроинъекции
<ol><li>По краям боросиликатного стекла капилляров, аккуратно поставив капилляра заканчивается в пламени свечи, чтобы не допустить нарушена во время присоединения его к держателю микропипеткой микропипеткой.</li>
	<li>Тянуть по крайней мере 3 стеклянные капилляры, используя Автоматический лазерный съемник, с помощью программы: тепла = 400, Fil = 4, Vel = 50, дель = 225, пули =; Тепла = 400, Fil = 4, Vel = 60, дель = 150, пули = 120. Программа набора должны быть введены с первым значением пул оставлено пустым. С использованием боросиликатного стекла капилляров внутреннего диаметра (и.д.) 1,00 мм и результаты 0,78 мм Наружный диаметр (диаметр) в микропипеткой с кончика открытия примерно 0,3 мкм в диаметре.</li>
	<li>Обратно заполните каждый микропипеткой с 8 мкл 5 мм CaCl2 раствор в HEPES буфера (10 мм) с помощью microloader. Фильтр CaCl2 решения с помощью 0,2-0,5 мкм фильтром шприца до использования, чтобы избежать засорения кончика пипетки. Примечание: Убедитесь, что CaCl2 полностью растворяется в HEPES буферного раствора, который также используется для шагов 2.4-2.6.</li>
	<li>Подключите к микроманипулятор микропипеткой держателя. Смонтируйте микропипеткой в держатель микропипеткой плотно. Соедините ТНВД и капиллярной держатель с помощью питания трубки.</li>
	<li>Запустите насос впрыска. Отрегулировать параметры на ТНВД 20 гПа (давление впрыска) и установите 5 гПа компенсации давления, в автоматическом режиме. Приостановите впрыскивающий насос до тех пор, пока микропипеткой готова к микроинъекции.</li>
	<li>Набор Микроскоп brightfield режим. Настройте его для дифференциальной помехи контраст (ОПК). Использовать для достижения оптимального мембраны края резолюции 63 X или 100 X высоких целей NA (1.3).</li>
	<li>Используйте грубый микроманипулятор для расположения микропипеткой выше капли, содержащие GUV-MLV комплексов. Найдите кончик микропипеткой выше цели.</li>
	<li>Сосредоточиться на середину GUV-MLV комплекса микроскопом и затем переориентировать примерно 50 мкм выше GUV. Используйте грубый режим микроманипулятор нежно привести микропипеткой в фокус.</li>
	<li>Переключатель микроманипулятор для тонкой режиме. Постепенно переориентировать на поверхность GUV при переводе микропипеткой наконечник вниз и держать кончик в фокусе. Расположите микропипеткой кончик приблизительно 20 мкм от поверхности GUV. Если кончик микропипеткой нарушается из-за случайного контакта с стекла Крышка выскальзования (пример на рисунке 5B), замените его немедленно, чтобы избежать ненужных кальций иона выпуска в пример решения массовых.</li>
</ol>4. формирование и перевод MTPs с помощью источника ионов кальция
<ol><li>Набор Микроскоп режим флюоресценции. Установите дихроичными возбудить в 488 нм и обнаружения выбросов на 505-550 Нм.</li>
	<li>Включите насос впрыска и начало впрыска ионов кальция. Использование режима тонкой микроманипулятор и медленно подход GUV микропипеткой кончиком. Расположите наконечник микропипеткой на расстоянии 3 мкм от поверхности мембраны при парентеральном CaCl2 решения от микропипеткой чтобы позволить MTPs формы (рис. 4).</li>
	<li>Чтобы перевести MTPs вдоль поверхности GUV, медленно перемещайте наконечник пипетки (со скоростью 0,1-0,3 мкм/s) вокруг GUV поверхности с помощью тонкой микроманипулятор (рис. 6). Поддерживать примерно таком же расстоянии (3 мкм) между поверхностью GUV и кончик микропипеткой продолжая инъекции ионов кальция. Примечание: По ставкам высокий перевод микропипеткой кончика (выше 0,7 микрон/сек), ССП не будут перенесены в синхронизации с микропипеткой. Вместо этого они будут разброс и сократить, в то время как новый ССП будут создаваться в новом месте микропипеткой кончика (рис. 7).</li>
	<li>Чтобы остановить микроинъекции, выключите ТНВД и переместить микропипеткой от поверхности GUV.</li>
</ol>

Биомиметических систем клетки позволяют для исследования поведения мембраны под воздействием внешних стимулов например, ионы, белки или наночастиц. GUVs, будучи такой модели, может отвечать на изменения в химической среде, регулируя их форму, которая часто включает в себя формирование трубчатых структур и кариолеммы24,,4142,43 .
Эта статья предлагает подход к генерации MTPs через ремоделирования GUV поверхности на локализованных инъекции ионов кальция на поверхности GUV бесконтактных образом. Протокол описывает подготовку GUV-MLV комплекса, который имитирует мембрану клетки плазмы, а также как использовать микроинъекции технику для создания кальция градиентов ионов рядом GUV поверхности в форме ССП. Большинство предыдущих экспериментальных исследований, которые рассмотрены взаимодействия мембраны иона кальция воздействию липидов пузырьки для массового кальций иона концентрации14,17. В зависимости от экспериментальных условий такого массового воздействия может привести к различные мембраны ответ с не трубчатых выступов сформирован25.
Образование комплексов GUV-MLV довольно прост и требует только стандартного лабораторного оборудования, таких как роторный испаритель, Ультразвуковая ванна и вакуумного эксикатора. Тем не менее есть несколько критических шагов для рассмотрения в ходе подготовки везикул. Важно обеспечить обезвоживания везикулы полного (во время шага 2.3 протокола) и сухой круговой липидов фильм, содержащий только небольшое количество кристаллов соли образуется на поверхности стекла Крышка выскальзования. В ходе эксперимента тщательной обработке везикул решения, используя свежие липидов Стоковый раствор в хлороформе, а также свежие HEPES буфера, имеет важное значение для успешной подготовки GUV-MLV комплексов. Кроме того безопасные вложения на поверхность стекла Крышка выскальзования GUV-MLV комплекса имеет решающее значение для микроманипуляции и микроинъекции. Для подтверждения надлежащего адгезии GUV-MLV комплекс, микропипеткой (без инъекций потока) может использоваться для аккуратно вставьте против GUV поверхности. Твердо придерживался везикул не будет скользить по поверхности после прямого физического контакта. Поскольку эксперименты в капли открытого буфера, который может быть допрошен на несколько часов, испарение должны приниматься во внимание. Испарение из буфера капелька изменит осмотического условий, которые могут повлиять на и дестабилизировать везикулы. Чтобы восстановить осмотического условий, периодическое дополнение чистой воды для восстановления первоначального объема образца возвращает системы гомеостаза.
При изменении состава мембранных липидов, важно, что везикулы производятся в виде комплекса GUV-MLV потому что MLV позволяет для передачи материала липидов GUV во время перестройки мембраны. Предыдущие исследования показали, что замена компонентов смеси SPE с чистой липиды, или добавление 5-30% холестерина, также позволяет для GUV-MLV комплекс формирования28,44. Большинство подготовленных GUVs являются однослойных45.
Кроме того при тестировании других двухвалентной катионов, таких как ионы магния, формирование MTPs сильно зависит наличие отрицательно заряженных DOPS в смеси липидов. Без DOPS ССП не образуют в везикулы, указанных в настоящем Протоколе. Кроме того моновалентная катионов, таких как калий и натрий, не приводят к формированию ССП, даже в везикулы, содержащие DOPS25.
Помимо критические шаги в отношении подготовки и манипуляции GUVs есть несколько важных факторов, чтобы рассмотреть во время процедуры микроинъекции. Успешный микроинъекции ионов кальция сильно зависит от надлежащего функционирования стекла micropipettes, которые готовятся в день эксперимента. Существует несколько факторов, которые могут вызвать микропипеткой неисправности. Распространенной причиной является засорение кончик открытия. Малые липидов частицы, которые являются побочными продуктами подготовки везикул, рассредоточены в решении и склонны придерживаться кончик микропипеткой, создавая тем самым засорения. Очистка наконечник пипетки лучше всего сделать, подняв его из раствора везикул и поместив его обратно близко к поверхности GUV. Использование функции Воздуходувный микроинъекции насоса необходимо избегать потому, что это приводит к массовым инъекций в основной раствор ионов кальция. Кроме того небольшие воздушные пузыри в ловушке внутри микропипеткой предотвратить надлежащего микроинъекции, в котором случае микропипеткой следует заменить на новый. Совет поломки могут быть значительно минимизированы, поместив экспериментальной установки на антивибрационная таблицы для сведения к минимуму колебаний Совет.
Кроме того необходимо принимать при выборе схемы наблюдения, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание во время получения лучшее время решена изображений. Микроскопии флуоресцирования лазерно индуцированным поля был использован в этот протокол, потому что она позволяет для приобретения скорости относительно высокий имидж на глубине цель ограниченного зонд. Кроме того использование Перевернутый микроскопии позволяет одновременное микроинъекции и наблюдение везикулы липидов и ССП.
Одним из основных ограничений представленных метода является требование обширные ручной работы и достаточными навыками микроманипуляции. Потому что комплексы формируются в процессе спонтанного отек, невозможно контролировать размер GUVs и MLVs. Кроме того этот протокол не позволяет для контроля мембраны напряженности подготовленных GUV-MLV комплексов, которые может быть необходимо собрать дополнительную информацию в отношении реконструкции мембраны. GUVs подключены к MLVs с последней поставляя липидов материалом для существенного роста MTPs до такой степени, что было бы невозможно добиться исключительно использованием мембраны из GUVs. MLVs также способствовать снижению разброса боковой поверхностное натяжение в пределах GUV-MLV комплекс44, который бы осложнить попытки контролировать натяжение пузырьков с помощью микропипеткой аспирации. Эта модель на основе GUV-MLV предоставляют меньше напряжение, которое лучше имитирует режимов напряженности, в структуры клеточной мембраны, подключен к мембранных резервуаров, такие мембраны складок и кариолеммы46. В то же время метод аспирации микропипеткой может быть успешно применен контролировать натяжение мембраны в одном GUVs. Например работу Грабера et al. представил подробную информацию о формирования трубчатых кариолеммы мембраны в одной GUVs после связывания ионов кальция к мембране в условиях массовых от разнообразных напряженности режимов40. Наконец Сравнение поведения мембраны на как местных, так и массового воздействия кальция требует улучшения управления мембраны прилипания к поверхности, которая выходит за рамки настоящего Протокола.
Подводя итоги, предлагаемая методика позволяет для бесконтактных мембраны ремоделирования и формирования ССП на локализованных стимуляции с ионами кальция. Будущих приложений этот метод центра на перевод от синтетических везикул систем родной биологических мембран, например шелесту клеток. Предложенный метод может быть объединена с другими одноклеточных допроса схем, таких как патч зажим или микроэлектродные amperometry, или в сочетании с локализованных Отопление стратегии31,47,48. Тестирование влияния других ионов или молекул прост и включает в себя просто заменив ионов кальция с молекулами интерес. Кроме того комплекс синтетических липидов везикулы может производиться через мембраны функционализация трансмембранные белки, которые могут расширить наше понимание биофизики клетки реорганизация и клеточной мембраны динамика, связанные с зондирования местных химические градиенты. Не в последнюю очередь, бесконтактных стимуляции липидные мембраны также могут быть переведены для систем полимерных мягкой материи, предлагая основу для платформы Роман бесконтактных манипуляции.

Роль ионов кальция в биологических процессов, специально их причастности к сигнализации, клеточного деления и синтеза мембранных, находится в центре внимания многих механистический исследований1. Концентрация ионов внутриклеточных цитоплазматического кальция составляет порядка 100 Нм, в то время как кальция в органеллы, например эндоплазматического ретикулума, секреторные пузырьки и митохондрии, достигнуть уровня до десятки millimolars в концентрации. Это создает крутой кальция ионный градиент концентрации порядков через внутриклеточные мембраны2,3,4,5,6,7,8 ,9. Внеклеточным кальцием Ион уровень составляет около 2 мм, и следовательно, вариации концентрации ионов кальция происходят на внеклеточные и внутриклеточных уровнях. Кроме того последние исследования подтверждают что внутриклеточный кальций иона сигнализации событий и активности нейронов может произойти в условиях местные колебания концентрации ионов внеклеточным кальцием, указывая значение синхронизации внутри - и внеклеточной кальций иона вариации10.
Стремясь понять взаимосвязь между ионами кальция и биологических мембран, синтетический подход, в котором родной клеточных мембран заменяются липидного бислоя везикулы была успешно выполнена. Разоблачение везикулы решения ион кальция приводит к изменениям в голову групп липидов и углеводородной цепи упаковки, мембрана повышенной напряженности и везикул агрегации, а также сегрегации липидов и мембранный этап перехода11,12 ,13,14,,1516. Исследованы свойства липидные мембраны под воздействием ионов кальция, с использованием таких экспериментальных методов как рентген, 1H ЯМР и спектроскопические или термодинамические исследования11,16, 17 , 18. в этих исследованиях, состав мембраны настраивается часто напоминают родной клеточных мембран и содержит такие физиологические липиды как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилсерина (PS). PS особенно важна в подготовке искусственных везикул потому, что он является важным компонентом во многих клеточных процессах, включая торговлю внутриклеточные мембраны, экзоцитоз и апоптоз19,20.
Размер синтезируемых липидов везикулы часто колеблется от нанометров до нескольких микрометров. Среди различных везикул препаратов, гигантские однослойных везикул (GUVs), которые являются несколько десятков микрометров в диаметре, имеют особое значение из-за их сравнительно большого размера, напоминающий размеры отдельных клеток21 , 22 , 23. имеющаяся площадь поверхности GUVs позволяет влияние местных химические градиенты на мембраны биофизических свойств, чтобы быть изучены. Подвергая только частью поверхности мембраны на внешние раздражители, мембраны динамика могут расследоваться более тесно. Например было показано, что локализованные применение химического или рН градиентов к поверхности GUVs приводит к образованию трубчатых выступы, которые не наблюдались в основную экспозицию24,25. Наблюдаемые различия в поведении мембраны требуют дальнейшего развития метод допроса одного везикул схем получить некоторые идеи в механизмы клеточной мембраны ремоделирования.
Опираясь на методы микроинъекции и микроманипуляции от ранних 1900-х26,,27, в связи с более последними достижениями сингл везикул манипуляции схем х23,28 , эта статья представляет собой подход, в котором мембраны ремоделирования и формирование мембранных трубчатых выступы (ССП) в мембране GUV создаются в ответ на местном применении ионов кальция.
Наш подход использует везикул комплекс, состоящий из GUV подключен к multilamellar везикул (МЛВ) как biomimetic мембраны модель системы (рис. 1A). MLV требуется как резервуар липидного комплекса на поставку материала липидов в GUV во время воздействия на градиент ион кальция. Эта связь позволяет комплекс компенсировать рост напряженности мембраны при индуцированных ремоделирования форма перехода GUV мембраны и липиды для MTP роста. Кроме того, МЛВ облегчает поверхности иммобилизации, потому что его масса увеличивается по сравнению с GUV. GUV-MLV комплексы, когда иммобилизованных на твердом субстрате, ранее использовались для производства нанотрубок везикул сетей, изучение взаимодействия полимерные мембраны и подражая поздних стадиях экзоцитоз29,30, , 3132,33.
Предыдущие протоколы использовались сои экстракт полярных липидов (SPE) подготовить GUV-MLV комплексы28. SPE состоит из смеси фосфолипидов, которые включают PC (45,7%), PE (22,1%), фосфатидилинозитол (PI, 18,4%), фосфатидной кислоты (ПА, 6,9%) и смесь других липидов (6,9%). В настоящем документе нашей протоколе, смеси SPE легированного 20% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (натриевая соль) (DOPS) имитировать внутреннюю листовка плазматической мембраны клеток. Дополнительно 1% Атто 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-ДОПИНГ) используется для пятно липидного бислоя чтобы включить мониторинг реконструкции мембраны, с помощью микроскопии флуоресцирования. GUVs имеют симметричные липидного состава через бислоя и локально подвергаются 5 мм концентрации хлористого кальция (2CaCl). Такие экспериментальные условия, с концентрацией ионов кальция повышенной также имитировать внешней мембраны листовка apoptotic клеток, где молекулы PS, выраженной34. Формирование комплексов GUV-MLV требует использования метода модифицированных регидратации обезвоживания, первоначально разработанный КРИАДО и Келлер35. Везикул подготовка протокола включает в себя формирование сухой липидного слоя, который затем используется для формирования мелких пузырьков в растворе. Это решение затем обезвоживается и Регидратированные сформировать окончательный GUV-MLV комплексов. Рисунок 2A -D иллюстрирует основные шаги для подготовки типичного комплекса GUV-MLV.
После завершения подготовки везикул и комплекс везикул иммобилизованных на стеклянной подложке, микроинъекции техника используется для доставки небольшое количество ионов кальция к внешней листовка GUV через микропипеткой открытым кончик стекла. Поток раствора кальция из кончика создает локализованные кальция ионный градиент на поверхности мембраны GUV, приводит к реконструкции мембраны и поколения MTPs. MTPs ориентированы вдали от источника ионов кальция и расти внутри GUV. Это образование МТЗ могут контролироваться непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии и записаны с помощью цифровой камеры. Рисунок 3 показывает экспериментальной установки для производства ремоделирования мембраны. Формирование ССП (Рисунок 2E и рис. 4) в этом протоколе демонстрирует контрастных результат ион кальция экспозиции эксперименты, проведенные в условиях массовых объем. В условиях массовых GUVs разрыву и образуют мембраны патчи, которые могут наблюдаться присоединиться к поверхности стекла25.
Более подробную информацию о формировании GUV-MLV комплексов, а также процедуры для выполнения микроинъекции ионов кальция, описаны в этой статье. Протоколы являются в основном на микроинъекции ион кальция; Однако этот подход можно легко изменить для использования в изучении мембраны ответов за счет местного воздействия на другие ионы или белки. Кроме того в состав пузырьки могут быть настроены изолировать компонент роли липидов в процессе реконструкции мембраны. Представленные протокол не требует каких-либо сложного оборудования для производства GUV-MLV комплексов и характеризуется высокой степенью воспроизводимости.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="890">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:455px;">Soy bean polar lipid extract</td>
			<td style="width:151px;">Avanti 
			Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td>
			<td style="width:119px;">541602C</td>
			<td style="width:167px;">100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS</td>
			<td style="width:151px;">Avanti 
			Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td>
			<td>840035C</td>
			<td>1x25 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>ATTO-TEC (Germany)</td>
			<td>AD 488-31</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Hamilton&#160;syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25&#160;&#956;L, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51&#160;mm (2&#160;in.)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">20735&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack</td>
			<td style="width:151px;">Corning Incorporated (Corning, NY 14831)</td>
			<td style="width:119px;">99445-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Chloroform&#160;CHROMASOLV&#160;Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, contains amylenes as stabilizer</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">650498-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:151px;">B&#252;chi Rotavapor R-144 Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm</td>
			<td style="width:151px;">KEBO lab (Sweden)</td>
			<td style="width:119px;">MA00360500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO</td>
			<td style="width:151px;">Sharlau Chemie S.A. (Spain)</td>
			<td style="width:119px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Glycerol, for molecular biology, minimum 99%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">T-1503 2050 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Trizma base</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">P5629-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium phosphate tribasic (K3PO4)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">MgSO4</td>
			<td style="width:151px;">Merck (USA)</td>
			<td style="width:119px;">34549-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">EDTA</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>H0887 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">HEPES solution 1&#160;M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">Z260282-1PAK</td>
			<td>24x60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Acrodisc&#160;syringe filters,&#160;PVDF membrane, diam. 13&#160;mm, pore size 0.2&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>631-1339&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Menzel Gl&#228;zer #1, glass cover slip</td>
			<td style="width:151px;">VWR (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Diaphragm vacuum pump for the desiccator</td>
			<td style="width:151px;">Vacuubrand (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Ultrasonicate bath</td>
			<td style="width:151px;">Bandelin Sonolex (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">VX-100 Lab vortexer vortex mixer</td>
			<td style="width:151px;">Labnet International (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">488 nm laser line&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Microsystems&#160;immersion oil for microscopes</td>
			<td style="width:151px;">Leica (Germany)</td>
			<td>12847995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:455px;">Inverted fluorescence microscopy system&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)</td>
			<td style="width:151px;">Technologies GmbH (Thuringia, Germany)</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">PatchStar Micromanipulator</td>
			<td style="width:151px;">Scientifica (Uckfield, UK)</td>
			<td style="width:119px;">612-7933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,&#160; 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.&#160;</td>
			<td colspan="2">Harvard Apparatus U.K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microloader (pipette tips)</td>
			<td style="width:151px;">VWR (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P-2000 CO2 laser-puller&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sutter Instruments (Novato, USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet</td>
			<td style="width:151px;">Eppendorf (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane remodeling of giant vesicles in response to localized calcium ion gradients

В широкий спектр основных клеточных процессов, как оборот мембраны и апоптоз клеточной мембраны форму переходы происходят одновременно с местные различия в концентрации ионов кальция. Были выявлены основные молекулярные компоненты, участвующие в этих процессах; Однако, конкретные взаимосвязи между градиентов ионов кальция и липиды внутри клеточной мембраны гораздо менее известно, главным образом из-за сложного характера биологических клеток и трудно систем наблюдения. Для преодоления этого разрыва, синтетический подход успешно реализуется раскрыть локализованные влияние ионов кальция на имитирует клеточной мембраны. Создание мнемосхемы напоминают условия в ячейке является severalfold проблемой. Во-первых для захвата физические свойства клеток требуется адекватного biomimetic модель с соответствующие размеры и состав мембраны. Во-вторых микроманипуляции установки требуется доставить небольшое количество ионов кальция в частности мембраны место. Наконец для обнаружения и записи отклика липидные мембраны к внешней стимуляции требуется схема наблюдения. Эта статья предлагает подробный biomimetic подход для изучения взаимодействия Ион мембраны кальция, где липидов везикул система, состоящая из гигантских однослойных везикул (GUV), подключенных к multilamellar везикул (МЛВ), подвергается локализованных кальция градиент формируется с помощью системы микроинъекции. Динамика ионного воздействия на мембрану были наблюдается с помощью флуоресцентной микроскопии и записаны на видео кадров. В результате стимуляции мембраны высоко изогнутые мембраны трубчатых выступы (ССП) формируется внутри GUV, ориентированные от мембраны. Описанный подход вызывает Ремоделирование липидные мембраны и ССП производства полностью бесконтактных и контролируемым образом. Этот подход представляет средства для решения детали кальция Ион мембраны взаимодействий, предоставляя новые возможности для изучения механизмов перестройки клеточной мембраны.

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients at JoVE.com

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Мембрана Ремоделирование гигантских пузырьков в ответ на локализованных кальций иона градиенты

Мы представляем технику для бесконтактных микроманипуляции везикулы, используя локализованные кальций иона градиентов. Микроинъекции раствора ионов кальция, вблизи гигантских липидов везикул, используется для того чтобы remodel липидов мембраны, что приводит в производстве мембранных трубчатых выступов.

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Раскрытие Энтропическое Оценить ускорение, растворителем Dynamics в мембранных ферментов

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

От конструктов в кристаллах - в сторону структуры Определение β-ствольных белки наружной мембраны

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Analyzing the Photo-oxidation of 2-propanol at Indoor Air Level Concentrations Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry

Анализируя фотоокисления 2-пропанол уровня концентраций воздуха с помощью поля асимметричной ионной подвижности спектрометрии

We demonstrate a versatile protocol to be used for determining the effectiveness of photocatalysts in degrading indoor air concentration (ppb) volatile ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Фермент инженерии Сплит TET2 для химико индуцибельной ДНК Hydroxymethylation и эпигеномные Ремоделирование

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Метод подготовки эффективного образца для повышения углеводов Ион сигналов в Matrix с помощью лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Образование карбоната кальция в присутствии биополимерных добавок

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Обслушание гигантских unilamellar гибридных пузырьков электроформации и измерения их механических свойств Micropipette аспирации

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

3D-реконструкция профиля глубины сегрегированных примесей с помощью масс-спектрометрии вторичных ионов

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Localized Bathless Metal-Composite Plating via Electrostamping

Локализованный без ванн Металл-Композитный платы с помощью электростампинга

Composite plating with particles embedded into the metal matrix can enhance the properties of the metal coating to make it more or less conductive, hard, ...