Name: membrane remodeling of giant vesicles in response to localized calcium ion gradients
Uploaded: 2018-07-16T13:30:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients at JoVE.com

1. küçük Lipid veziküller hazırlanması
<ol><li>Lipidler SPE/DOPS/ATTO488-DOPE kloroform içinde bir çözüm 79/20/1.The kloroform lipidler konsantrasyonu 1 mg/mL ve son kitle 0.6 mg (genellikle daha az 1 mg) son oranı karıştırma bir kitle ile hazırlayın. Kullanım alt cam şişe (yuvarlak alt cam tüpler, 10 x 75 mm) yuvarlak lipid çözüm önceden temizlik adım olmadan hazırlarken tek kullanımlık.<ol>
<li>Doldurun ve kullanımdan önce en az 5 kez kloroform ile cam şırınga (25 µL) durulayın. Doldurun ve cam şırınga en az 5 kez durulama için 3-4 mL kloroform yeterlidir. Dikkat: Ne zaman kloroform, işleme cam şırınga kullanın ve uygun eldiven giyerken duman mahallede tüm yordamları gerçekleştirmek ve koruyucu gözlük her zaman. Herhangi bir plastik şişeler, şırınga veya pipetler kloroform işlerken kullanmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ortam ışığı içeriği korumak ve 3 h için bir döner buharlaştırıcı-7 kPa vakum 80 devirde ulaşan basınç ile kloroform kaldırmak için solvent buharlaşır için metal folyo ile lipid karışımı içeren cam şişe kaydır. Bir kuru lipid film cam şişe dibinde buharlaşma (Şekil 2A) sonra oluşur. Not: birkaç kez ölçeklendirmesinin ve lipidler daha büyük miktarda tam kloroform kaldırılmasını sağlamak için daha uzun döner buharlaşma zaman gerektirebilir.</li>
	<li>Fosfat 600 µL serum fizyolojik (PBS) arabellek çözüm (pH 7.8, seyreltme olmadan) kurutulmuş lipit filmin üstüne arabelleğe yavaş yavaş ekleyin. Arabellek ek, yavaşça gliserol Şef-MLV oluşumu (gliserol 1 wt % son bir konsantrasyon ulaşmak) adımları36sırasında tam dehidratasyon örnek korumak için 6 µL ekleyin. Parafilm ve kapak metal folyo ile ortam ışığı korumak için kullandığı cam şişe kapatın. Gecede 4 ° C'de buzdolabında saklayın. Not: PBS arabellek çözüm Trizma tabanının 0.151 g, K3PO41.592 g, KH2PO41.021 g, MgSO4 ·7H2O 0,062 g ve EDTA 0.0465 g 250 mL saf su içinde oluşur. Çözüm 4 ° C'de depolayın ve oda sıcaklığında önce kullanım için sıcak. 10 mM HEPES tampon eşdeğer miktarda PBS çözüm yerine kullanılabilir. HEPES tampon çözüm 1 M HEPES hisse senedi çözüm arıtılmış su ile sulandrarak hazırlanır.</li>
	<li>Ertesi gün, bir ultrasonication Banyosu oda sıcaklığında kullanarak 1dk için solüsyon içeren cam şişe solüsyon içeren temizleyicide. Parafilm kaldırın ve küçük lipid veziküller görsel olarak tek tip bir çözüm oluşturulur kadar pipet (Şekil 2B). Aliquot 30 µL elde edilen küçük lipid vezikül çözüm bireysel 0.5 mL Plastik tüpler içine. Bu hisse senedi aliquots en fazla 6 ay için-18 ° C'de tutun. Not: küçük lipid vezikül çözüm yoksa görsel olarak üniforma, girdap 4 kez 1-2 s maksimum hızda bir girdap Mikser kullanarak için çözüm.</li>
</ol>2. Şef-MLV konut projeleri hazırlanması
<ol><li>Oda sıcaklığında bir aliquot küçük lipid veziküller donmuş süspansiyon içeren bir plastik tüp çözülme. Burgaç 4 kez 1-2 s maksimum hızda bir girdap Mikser kullanarak için tüp.</li>
	<li>Yer 5 µL küçük lipid vezikül süspansiyon bir cam kapak küçük oluşturmak için Not (24 x 60 mm) yüzeyinin damlacık yuvarlak. Cam kapak kayma olmadan herhangi bir ön temizleme adımları kullanın.</li>
	<li>Cam kapak notu bir vakum desiccator yer (< 100 kPa vakum) 20 dk için.</li>
	<li>Kurutulmuş lipit filmin 4 dakika oda sıcaklığında saklamak, sonra yavaş yavaş 10 mM HEPES tampon rehidrasyon için kuru lipid film üstüne 50 µL pipet. Şef-MLV kompleksleri (Şekil 2C) önceden oluşturmak için 5 dakika bekleyin.</li>
	<li>Bir cam kapak notu mikroskop sahnede merkezi sonra 300 µL üzerine HEPES tampon pipet ve damlacık amacı (3B rakam) yukarıda ortasına konumlandırın.</li>
	<li>Önceden biçimlendirilmiş Şef-MLV çözüm 50 µL HEPES çözüm (300 µL) aktarın. 25 dk seyrek kurulan Şef-MLV kompleksleri sıkıca cam kapak notu (2D rakam) yüzeye bağlı kalmak izin istiyorum. Not: Bazen, cam kapak fişinde Şef-MLV kompleksleri oluşturmaz ve lipid yamalar veya sadece MLVs gözlenir. Bu yanlışlıkla örneği adımları sırasında küçük vezikül süspansiyon 2.4 veya 2.6 veya çok sayıda donma-çözülme çevrimleri sallayarak tarafından açıklanabilir. 2.1-2,6 olan adımları yineleyin veya taze hazırlanmış lipid hisse senedi çözüm (adım 1.1) Şef-MLV kompleksler elde etmek için kullanın.</li>
</ol>3. micropipette hazırlanması ve mikroenjeksiyon
<ol><li>Micropipette sahibine eklenirken kırık micropipette önlemek için bir mum alevi içine yavaşça kılcal yerleştirerek borosilikat cam kılcal kenarları yuvarlak biter.</li>
	<li>Program seti kullanarak bir otomatik lazer çektirme kullanarak en az 3 cam kılcal çekin: ısı 400, FIL = = 4, Vel 50, Del = 225, Pul = =; Isı 400, FIL = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120 =. Program kümesi boş bırakılan Pul ilk değeri ile girilmesi gerekir. Borosilikat cam kılcal iç çapı (kimlik) kullanarak 1.00 mm ve dış çap (OD) 0,78 mm bir micropipette çapı yaklaşık 0.3 µm bir ipucu açılış ile sonuçlanır.</li>
	<li>Arka-dolgu ile 8 µL 5 mm CaCl2 çözüm HEPES tampon (10 mM) bir microloader kullanarak her micropipette. 0,2-0,5 kullanarak CaCl2 çözüm filtre µm şırınga filtre kullanımı pipet ucu tıkanmasını önlemek için önce. Not: CaCl2 tamamen adımları 2,4-2,6 için de kullanılır HEPES tampon çözelti içinde çözünmüş olun.</li>
	<li>Bir micropipette sahibi bir micromanipulator bağlayın. Micropipette micropipette yuvasına sıkıca bağlayın. Enjeksiyon pompası ve kapiller tutucu kaynağı tüp kullanarak bağlayın.</li>
	<li>Enjeksiyon pompası başlatın. Enjeksiyon pompası 20 hPa (enjeksiyon basıncı) için ayarları ve bir 5 inç tazminat basınç otomatik modunu ayarlayın. Micropipette mikroenjeksiyon için hazır olması ne kadar enjeksiyon pompası duraklatın.</li>
	<li>Mikroskop aydınlık alan moda ayarlayın. Fark girişim kontrast (DIC) yapılandırın. 63 X veya 100 X Yüksek NA (1.3) amaçları en iyi membran kenar çözünürlük elde etmek için kullanın.</li>
	<li>Kaba micromanipulator micropipette Şef-MLV kompleksleri içeren damlacık yukarıda konumlandırmak için kullanın. Yukarıda amaç micropipette ucu bulun.</li>
	<li>Mikroskop Şef-MLV kompleks orta noktasını odaklanmak ve yaklaşık 50 µm Şef yukarıda tekrar odaklayın. Yavaşça micropipette odak haline getirmek için micromanipulator kaba modunu kullanın.</li>
	<li>Micromanipulator iyi moduna geçirin. Yavaş yavaş micropipette ucunu aşağı çevirmek ve ucu odak tutmak ise şef yüzeye yönlendirmesi. Micropipette ipucu yaklaşık 20 µm Şef yüzeyinden getirin. Micropipette ucu cam kapak notu ( Şekil 5Börnekte) ile yanlışlıkla temas nedeniyle kırık değilse, hemen gereksiz kalsiyum iyon yayın örnek toplu çözüm içine önlemek için değiştirin.</li>
</ol>4. oluşumu ve kalsiyum İyon kaynağı kullanarak MTPs çeviri
<ol><li>Mikroskop floresans moduna ayarlayın. Ayarla dichroics 488 heyecanlandırmak için nm ve 505-550 nm, emisyon tespit.</li>
	<li>Enjeksiyon pompası üzerinde geçiş ve kalsiyum iyon enjeksiyon başlar. Micromanipulator iyi modunu kullanacak ve yavaş yavaş micropipette ucu Şef e yaklaşım. Micropipette ipucu MTPs formu (Şekil 4) izin vermek için micropipette CaCl2 çözümden enjekte ederken 3 µm membran yüzey uzaklıkta yerleştirin.</li>
	<li>MTPs Şef yüzeyi boyunca çevirmek için yavaş yavaş hareket pipet ucu (0,1-0,3 hızı µm/s) Şef yüzey iyi micromanipulator (Şekil 6) kullanarak. Yaklaşık olarak aynı uzaklıkta (3 µm) Şef yüzey ve belgili tanımlık micropipette uç arasında kalsiyum iyon enjeksiyon devam ederken korumak. Not: micropipette İpucu (yukarıda 0.7 µm/s) yüksek çeviri oranlarda MTPs BT'nin micropipette de geçirmeyecektir. Bunun yerine, dağılım ve kısaltmak, yeni MTPs micropipette ucu (Şekil 7) yeni konumda oluşturulacak iken.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon durdurmak için enjeksiyon pompa kapatmak ve Şef yüzey uzak micropipette hareket.</li>
</ol>

BioMimetic hücre sistemleri membran davranış iyonları, proteinler veya nano tanecikleri gibi dış uyaranlara karşı maruz üzerine bir çalışma için izin verir. Böyle bir model olmak gUVs, kimyasal ortamda değişiklikler sık sık tübüler yapılar ve invaginations24,41,42,43 oluşumu içerir onların şekli ayarlayarak yanıt verebilir .
Bu makale, MTPs Şef yüzey üzerine yerelleştirilmiş enjeksiyon Şef yüzeyinde kalsiyum iyonlarının remodeling ile temassız bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunar. Protokol ne kadar kalsiyum oluşturmak için bir mikroenjeksiyon tekniği kullanırım için iyon degradeler Şef e yakın forma MTPs yüzey de bir hücre plazma zarı taklit eden Şef-MLV kompleks hazırlanması açıklar. Kalsiyum iyon-membran etkileşimleri ele önceki deneysel çalışmalarda çoğunluğu kalsiyum iyon konsantrasyonu14,17toplu olarak lipid veziküller maruz. Deneysel koşullarına bağlı olarak, bu tür toplu poz yok borulu çıkıntılar oluşan25farklı membran yanıtta neden olabilir.
Şef-MLV kompleksleri oluşumu oldukça basittir ve sadece standart Laboratuar donanımları, rotary evaporatör, ultrasonik banyo ve vakum desiccator gibi gerektirir. Yine de, vezikül hazırlık sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli kritik adımlar vardır. (Veziküller susuzluktan adım iletişim kuralı sırasında 2.3) tamamlandıktan ve az miktarda tuz kristallerinin içeren bir Kuru dairesel lipid film cam kapak kayma yüzeyi üzerinde oluşturulur emin olmak önemlidir. Deneme sırasında dikkatli vezikül çözümü, işleme kloroform yanı sıra taze HEPES tampon, taze lipid hisse senedi çözüm kullanmaktır Şef-MLV kompleksleri başarılı hazırlanması için gerekli. Ayrıca, güvenli bağlanma cam kapak kayma yüzeyi Şef-MLV kompleks embriyolardan ve mikroenjeksiyon için çok önemlidir. Şef MLV yeterli yapışma onaylamak için karmaşık, micropipette (enjeksiyon akışı) olmadan yavaşça Şef yüzeyine karşı itmek için kullanılabilir. Sıkıca yapıştırılan bir vezikül üzerine doğrudan fiziksel temas yüzeyi boyunca kaydırın değil. Çünkü deneyler için birkaç saat sorguya, bir açık arabellek damlacık içinde gerçekleştirilir buharlaşma dikkate alınması gerekir. Buharlaşma arabellek damlacık gelen etkiler ve veziküller istikrarsızlaştırmak ozmotik koşullar değişecek. Ozmotik koşullar geri yüklemek için sistem periyodik özgün birimi geri yüklemek için örnek için saf su ilavesi homeostazı için döndürür.
Lipid membran kompozisyon değiştirirken MLV membran yeniden şekillendirme sırasında Şef'e lipid malzeme aktarmak için izin verdiğinden veziküller Şef-MLV kompleksi şeklinde üretilen önemlidir. Önceki çalışmalar ile saf lipidler SPE karışımı bileşenleri değiştirme veya kolesterol, % 5-30'u eklemek de Şef-MLV karmaşık oluşumu28,44için sağlar göstermiştir. Hazırlanan GUVs unilamellar45çoğu.
Ayrıca, magnezyum iyonları gibi diğer divalent katyonlar sınarken MTPs oluşumu ağır lipid karışımı olumsuz ücret DOPS varlığını bağlıdır. DOPS, bu protokol için açıklanan veziküller içinde MTPs oluşturmaz. Ayrıca, potasyum ve sodyum, gibi monovalent katyon oluşumunda MTPs, hatta veziküller25DOPS içeren, neden değil.
Hazırlık ve GUVs manipülasyon ile ilgili kritik adımlarına ek olarak, mikroenjeksiyon işlemi sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli faktörler önemli. Kalsiyum iyonlarının başarılı mikroenjeksiyon ağır düzgün çalışıp dayanmaktadır cam deneme günü hazır mısın Mikropipetler. Çeşitli faktörler micropipette çalışmasına neden olabilir. Ortak bir akıl tıkanmış ipucu açıyor. Yan vezikül hazırlanması, çözüm içinde dağınık ve böylece bir tıkanma üreten micropipette ucuna kadar uygun eğilimi küçük lipid parçacıkları. Pipet Ucu temizleme en iyi vezikül eriyik--dan yukarı kaldırarak ve Şef yüzeye yakın yerleştirerek yapılır. Çünkü toplu çözüm içine kalsiyum iyonlarının büyük enjeksiyon içinde sonuçlar mikroenjeksiyon pompa blow-out işlevinin kullanımını kaçınılmalıdır. Ayrıca, küçük hava kabarcıkları micropipette içinde entrapped uygun mikroenjeksiyon, dava micropipette yenisi ile değiştirilmelidir önlemek. İpucu kırılması önemli ölçüde deneysel Kur ipucu salınımlarını en aza indirmek için bir titreşim nemlendirme masaya yerleştirerek en aza indirilebilir.
Ayrıca, bakım photobleaching zaman karar vermek en iyi görüntüleri elde ederken en aza indirmek için bir gözlem düzeni seçerken alınması gerekiyor. Çünkü bir objektif sınırlı sonda derinlikte bir nispeten yüksek görüntü edinme oranı sağlar geniş alanlı lazer kaynaklı floresans mikroskobu bu protokol için kullanılmıştır. Ayrıca, ters mikroskobu kullanımını eşzamanlı mikroenjeksiyon ve lipid veziküller ve MTPs gözlem olanağı sağlar.
Bir sunulan yönteminin ana sınırlamaları kapsamlı el ile çalışmaları ve yeterli embriyolardan becerileri gereksinimdir. Kompleksleri bir spontan şişme sürecinde oluşur çünkü, GUVs ve MLVs boyutunu kontrol edilemez. Ayrıca, bu iletişim kuralını membran yenileme ile ilgili ek ayrıntıları toplamak gerekli olabilir hazır şef-MLV kompleksleri membran gerginlik kontrolü için izin vermez. GUVs MLVs sadece GUVs kullanılabilir membran kullanarak elde etmek imkansız bir ölçüde MTPs önemli büyüme için ikinci sağlama lipid malzeme ile bağlanır. MLVs de hangi vezikül gerilimi micropipette aspirasyon kullanarak denetlemek için girişimleri karmaşık Şef-MLV karmaşık44içinde herhangi bir yan yüzey gerilimi varyasyonları düşürülmesi için katkıda bulunur. Bu Şef-MLV tabanlı model daha iyi membran kıvrımlar ve invaginations46gibi membran su depoları bağlı hücresel membran yapılar bulunan gerginlik rejimler taklit eden bir alt gerginlik sağlar. Aynı zamanda, micropipette Aspirasyon tekniği başarıyla tek GUVs membran gerginlik denetlemek için uygulanabilir. Örneğin, Graber vd. eseri ayrıntıları membran borulu invaginations bağlama üzerine tek GUVs içinde kalsiyum iyonlarının oluşumu için toplu koşulları, membran çeşitli gerilim rejimler40sağlanan. Son olarak, hem yerel hem de toplu pozda kalsiyum için membran davranışının karşılaştırma bu protokolü kapsamý dýþýndadýr yüzeye membran yapıştırılması Gelişmiş denetimi gerektirir.
Özetlemek gerekirse, temassız membran yenileme ve kalsiyum iyonları ile yerelleştirilmiş stimülasyon üzerine MTPs oluşumu için önerilen tekniği sağlar. Sentetik vezikül sistemlerden çeviri için hücre blebs gibi yerel biyolojik membranlar üzerinde bu yöntemi merkezinin gelecekteki uygulamalar. Önerilen yöntem Birleşmiş amperometry, yama-kelepçe veya elektrot gibi diğer tek hücreli sorgulama düzenleri ile veya ile birlikte lokalize stratejileri31,47,48Isıtma. Diğer iyonlar veya moleküller etkisini test basittir ve sadece faiz molekülleri ile kalsiyum iyonları yerine içerir. Ayrıca, karmaşık sentetik lipid veziküller ile yerel algılama ile ilişkili hücre yeniden şekillendirilmesi ve hücre zarının dinamiği Biyofizik anlayışımızı genişleyebilir transmembran proteinler membran functionalization yoluyla üretilen kimyasal degradeler. Son olarak, lipid membran temassız uyarılması da polimer yumuşak madde sistemleri, bir roman temassız manipülasyon platform için bir temel sunan için tercüme edilebilir.

Kalsiyum iyonları Biyolojik süreçler, sinyal, hücre bölünmesi ve membran fusion, özellikle onların katılımı içinde odak birçok mekanik çalışmalar1rolüdür. Hücre içi sitoplazmik kalsiyum iyonu konsantrasyonu sırasına 100dür nM, endoplazmik retikulum, salgı veziküller ve mitokondri, gibi organellerin kalsiyum süre kadar millimolars konsantrasyon onlarca düzeyleri ulaşmak. Bu hücre içi membranlar2,3,4,5,6,7arasında,8 dik kalsiyum iyon konsantrasyonu degrade büyüklük oluşturur ,9. Ekstrasellüler kalsiyum iyon düzeyi 2 mM civarında ve bu nedenle, her iki hücre dışı ve hücre içi düzeyde kalsiyum iyonu konsantrasyonu varyasyonları oluşur. Ayrıca, son çalışmalar bu hücre içi kalsiyum iyon olaylar sinyalizasyon kanıt ve nöronal aktivite ekstraselüler kalsiyum iyon konsantrasyonlarının, önemini gösteren yerel dalgalanmalar koşullar altında ortaya çıkabilir senkronize Intra - ve ekstraselüler kalsiyum iyon değişimleri10.
Kalsiyum iyonları ve biyolojik membranlar, yerel hücre zarlarında lipid bilayer veziküller ile yerine sentetik bir yaklaşım arasındaki etkileşimi anlamak amaçlayan başarıyla uygulamaya konmuştur. Veziküller kalsiyum iyon çözümlere açığa lipid kafa grupları ve hidrokarbon zinciri ambalaj, artan membran gerginlik ve vezikül toplama yanı sıra lipidler ve membran faz geçiş11,12 ayrılığı değişikliklere yol açar ,13,14,15,16. Lipid membranlar maruz kalsiyum iyonları için üzerine özelliklerini x-ışını, 1H-NMR ve spektroskopik veya termodinamik çalışmalar11,16, bu tür Deneysel teknikler kullanarak araştırdık 17 , 18. bu çalışmalarda membran kompozisyon kez yerel hücre zarlarında benzemek için ayarlanmıştır ve fizyolojik böyle lipidler phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) ve Fosfatidilserin (PS) içerir. PS hücre içi membran kaçakçılığı, ekzositozu ve Apoptozis19,20de dahil olmak üzere birçok hücresel süreçlerinde önemli bir bileşeni olduğundan yapay vezikül hazırlanmasında özellikle önemlidir.
Sentezlenmiş lipid veziküller boyutunu kez nanometre birkaç mikrometre arasında değişmektedir. Farklı vezikül hazırlıkları arasında dev unilamellar veziküller (GUVs), hangi are birkaç mikrometre çapında onlarca için bireysel boyutları hücreleri21 yakından benzeyen onların nispeten büyük boyutları nedeniyle özellikle önem vardır , 22 , 23. GUVs mevcut yüzey alanı yerel kimyasal degradeler etkisi incelenecektir için membran biyofiziksel özellikleri sağlar. Membran yüzey dış uyaranlara karşı yalnızca bir bölümünü açarak, membran dynamics daha yakından soruşturma. Örneğin, kimyasal ya da pH degradeler yerelleştirilmiş uygulama GUVs yüzeyine toplu poz24,25, gözlenen değil borulu çıkıntılar oluşumuna yol açar gösterilmiştir. Hücre zarının remodeling mekanizmaları biraz anlayışlar kazanmak için tek veziküllü sorgulama düzenleri yöntem geliştirilmesi için gözlenen membran davranış farklılıkları arayın.
Embriyolardan erken 1900'lerde26,ile27, 2000'lerde23,28 tek veziküllü manipülasyon düzenlerinden daha yeni gelişmeler ile bağlantılı olarak ve mikroenjeksiyon yöntemleri üzerine bina , bu makalede hangi membran yenileme ve membran borulu çıkıntılar (MTPs) Şef membran oluşumu oluşturulur kalsiyum iyonlarının yerel uygulama yanıt olarak bir yaklaşım sunuyor.
Yaklaşımımız bir biomimetic membran modeli sistemi (Şekil 1A) multilamellar bir vezikül (MLV) bağlı bir şef oluşan karmaşık bir vezikül kullanır. MLV olarak lipid depo kompleks kalsiyum iyon degrade maruz sırasında Şef lipid malzeme sağlamak için gereklidir. Bu bağlantı indüklenen tadilat sırasında membran gerginlik artışı telafi etmek ve Şef membran geçiş şekil ve lipidler MTP büyüme için sağlamak için karmaşık tanır. Kütlesi büyük olduğu için Ayrıca, yüzey immobilizasyon MLV kolaylaştırır Şef e kıyasla. Ne zaman bir katı substrat immobilize Şef-MLV kompleksleri daha önce nanotüp veziküllü ağlar üreten, polimer membran etkileşim eğitim ve ekzositozu29,30geç aşamalarında taklit için kullanılmıştır, 31,32,33.
Önceki iletişim kuralları soya polar lipit özü (SPE) Şef-MLV kompleksleri28hazırlamak için kullanılan. SPE phosphatidic asit (PA, % 6,9) ve diğer lipidler (% 6,9) karışımı içeren PC (%45.7), PE (%22,1), phosphatidylinositol (PI, %18,4), fosfolipitler karışımından oluşur. Burada bizim protokolünde, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodyum tuzu) % 20'si ile SPE karışımı katkılı hücre plazma zarı iç broşürü taklit etmek için (DOPS). Ek bir %1 sınav 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) membran floresans mikroskobu kullanılarak remodeling izleme özelliğini etkinleştirme lipid bilayer leke için kullanılır. GUVs simetrik lipid kompozisyon var bilayer arasında ve yerel olarak kalsiyum klorür (CaCl2) 5 mM konsantrasyonları maruz kalır. Bu deneysel koşullar, bir yüksek kalsiyum iyonu konsantrasyonu ile Ayrıca PS molekülleri ifade34nerede apoptotik hücrelerin dış membran broşür taklit. Şef-MLV kompleksleri oluşumu başlangıçta Criado ve Keller35tarafından geliştirilen bir değiştirilmiş rehidratasyon su kaybı yöntemi kullanılmasını gerektirir. Vezikül hazırlık Protokolü sonra küçük veziküller içinde çözüm oluşturmak için kullanılan bir kuru lipid tabakanın oluşumu içerir. Bu çözüm sonra susuz ve son Şef-MLV konut projeleri oluşturmak üzere rehydrated. Şekil 2A -D tipik bir şef-MLV kompleks hazırlanması için ana adımları göstermektedir.
Vezikül hazırlık tamamlanmış ve karmaşık vezikül cam alt katman üzerinde immobilize sonra mikroenjeksiyon tekniği ile bir açık uçlu cam micropipette Şef e dış broşürü az miktarda kalsiyum iyonları sunmak için kullanılır. Kalsiyum çözüm ucu dışarı akışını membran yenileme ve MTPs nesil için önde gelen Şef membran yüzeyinde lokalize kalsiyum iyon degrade oluşturur. MTPs kalsiyum İyon kaynağı uzak odaklı ve Şef içinde büyür. Bu MTP oluşumu doğrudan floresans mikroskobu aracılığıyla izlenebilir ve bir dijital kamera ile kaydedildi. Şekil 3 membran remodeling üretmek için kullanılan deneysel kurulumu gösterir. Bu iletişim kuralı (Şekil 2E ve Şekil 4) MTPs oluşumu toplu güç koşullarda gerçekleştirilen kalsiyum iyon pozlama deneyler için zıt bir sonuç gösterir. Toplu koşullarda GUVs rüptürü ve form için cam yüzey25uymaları gözlenen membran yamalar.
Daha Şef-MLV kompleksleri yanı sıra kalsiyum iyonları mikroenjeksiyon gerçekleştirmek için yordam oluşumu ile ilgili ayrıntılar, bu makalesinde açıklanmıştır. İletişim kuralları büyük ölçüde kalsiyum iyon mikroenjeksiyon üzerinde duruldu; Ancak, bu yaklaşım yerel veya maruz kalma diğer iyonlar proteinler nedeniyle membran yanıt eğitim kullanmak için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, veziküller bileşimi membran yenileme sürecinde lipid bileşeni rolleri yalıtmak için ayarlanabilir. Sunulan Protokolü Şef-MLV kompleksleri üretmek için herhangi bir gelişmiş donanım gerektirmez ve tekrarlanabilirlik yüksek derecesi ile karakterizedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="890">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:455px;">Soy bean polar lipid extract</td>
			<td style="width:151px;">Avanti 
			Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td>
			<td style="width:119px;">541602C</td>
			<td style="width:167px;">100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS</td>
			<td style="width:151px;">Avanti 
			Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td>
			<td>840035C</td>
			<td>1x25 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>ATTO-TEC (Germany)</td>
			<td>AD 488-31</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Hamilton&#160;syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25&#160;&#956;L, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51&#160;mm (2&#160;in.)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">20735&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack</td>
			<td style="width:151px;">Corning Incorporated (Corning, NY 14831)</td>
			<td style="width:119px;">99445-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Chloroform&#160;CHROMASOLV&#160;Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, contains amylenes as stabilizer</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">650498-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:151px;">B&#252;chi Rotavapor R-144 Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm</td>
			<td style="width:151px;">KEBO lab (Sweden)</td>
			<td style="width:119px;">MA00360500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO</td>
			<td style="width:151px;">Sharlau Chemie S.A. (Spain)</td>
			<td style="width:119px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Glycerol, for molecular biology, minimum 99%</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">T-1503 2050 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Trizma base</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">P5629-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium phosphate tribasic (K3PO4)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">MgSO4</td>
			<td style="width:151px;">Merck (USA)</td>
			<td style="width:119px;">34549-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">EDTA</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>H0887 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">HEPES solution 1&#160;M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td style="width:119px;">Z260282-1PAK</td>
			<td>24x60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Acrodisc&#160;syringe filters,&#160;PVDF membrane, diam. 13&#160;mm, pore size 0.2&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td>
			<td>631-1339&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Menzel Gl&#228;zer #1, glass cover slip</td>
			<td style="width:151px;">VWR (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Diaphragm vacuum pump for the desiccator</td>
			<td style="width:151px;">Vacuubrand (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Ultrasonicate bath</td>
			<td style="width:151px;">Bandelin Sonolex (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">VX-100 Lab vortexer vortex mixer</td>
			<td style="width:151px;">Labnet International (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">488 nm laser line&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Microsystems&#160;immersion oil for microscopes</td>
			<td style="width:151px;">Leica (Germany)</td>
			<td>12847995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:455px;">Inverted fluorescence microscopy system&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)</td>
			<td style="width:151px;">Technologies GmbH (Thuringia, Germany)</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">PatchStar Micromanipulator</td>
			<td style="width:151px;">Scientifica (Uckfield, UK)</td>
			<td style="width:119px;">612-7933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:455px;">Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,&#160; 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.&#160;</td>
			<td colspan="2">Harvard Apparatus U.K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microloader (pipette tips)</td>
			<td style="width:151px;">VWR (USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P-2000 CO2 laser-puller&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sutter Instruments (Novato, USA)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet</td>
			<td style="width:151px;">Eppendorf (Germany)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane remodeling of giant vesicles in response to localized calcium ion gradients

Temel hücre süreçler, membran kaçakçılığı ve apoptosis, gibi çok çeşitli hücre zarının şekli geçişler kalsiyum iyonu konsantrasyonu yerel varyasyonlar ile aynı anda ortaya. Ana moleküler bileşenleri Bu süreçlerle ilgili tespit edilmiştir; Ancak, belirli Interplay kalsiyum iyon gradyanlar ve hücre zarı içinde lipidler arasında çok daha az, özellikle biyolojik hücreleri karmaşık yapısı nedeniyle bilinmektedir ve gözlem düzenleri, zor. Sentetik bir yaklaşım bu boşluğu için başarıyla hücre zarı taklit eder lokalize kalsiyum iyonlarının etkisi ortaya çıkarmak için uygulanır. Hücre içindeki koşullar benzemeye bir taklit kurma severalfold bir sorundur. İlk olarak, uygun boyutları ve membran kompozisyon bir yeterli biomimetic modeliyle hücrelerin fiziksel özelliklerini yakalamak için gereklidir. İkinci olarak, embriyolardan Kur az miktarda kalsiyum iyonları belirli membran konuma teslim için gereklidir. Son olarak, bir gözlem düzeni algılamak ve lipid membran yanıt dış uyarılması için kayıt için gereklidir. Bu makale, nerede multilamellar bir vezikül (MLV), bağlı bir dev unilamellar vezikül (şef) oluşan bir lipid vezikül sistemi için yerelleştirilmiş bir kalsiyum maruz kalsiyum iyon-membran etkileşim çalışmak için detaylı biomimetic yaklaşım sunar degrade mikroenjeksiyon sistemi kullanılarak oluşturulmuş. Membran iyonik etkisi dinamikleri floresans mikroskobu kullanılarak gözlenen ve video kare hızlarında kaydedildi. Membran uyarılması sonucu olarak son derece uzak membran odaklı Şef içinde oluşturduğu membran borulu çıkıntılar (MTPs) kavisli. Açıklanan yaklaşım tamamen temassız ve kontrollü bir şekilde lipid membran ve MTP üretim remodeling neden olmaktadır. Bu yaklaşım hücre zarının yeniden şekillendirilmesi mekanizmaları incelemek için yeni yollar sağlayan kalsiyum iyon-membran etkileşimlerin Ayrıntılar adres için bir araç sunar.

Bu çalışmada, Şef-MLV kompleksleri ve onlar kalsiyum iyon degradeler etkisi hücre zarı dynamics aydınlatmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Şef-MLV kompleksleri yüzey bağlı bir iyon degrade mikroenjeksiyon ile kurulurken bir sabit Cep Boy taklit için izin vermek bu deneyler için gereklidir. Şef membran lokalize kalsiyum konsantrasyonu kalsiyum İyon kaynağı uzak yönetmen MTPs oluşumu ile yanıt verir. Ayrıca, MTPs Şef temassız bir şekilde micropipette ucunu membran yüzey etrafında hareket ettirerek tercüme edilebilir.
Şef-MLV hazırlık yordamı şematik gösterimi Şekil 2' de gösterilmiştir. Her ne kadar sunulan protokolünde, Şef-MLV kompleksleri zaten adımı sırasında 2.4 (Şekil 2C) önceden oluşmuş, vezikül çözüm başka bir 300 µL damlacık arabelleği (adım 2.6 Protokolü'nün) için aktarma seyrek kurulan Şef-MLV kompleksleri sağlar yeterince uygun cam alt katman. Bu şekilde, embriyolardan ve mikroenjeksiyon için uygun bir kompleks kurulur (Şekil 2B). Zaman zaman, GUVs MTP oluşum Şekil 4Agörüldüğü gibi etkilemez bir veya daha fazla sıkışmışlık lipid veziküller içerir. Bu GUVs MTPs üretmek; Ancak, sıkışmışlık veziküller büyükse görüntüleme engel. Hazır GUVs çoğunluğu (% 75 kadar) yarımküresel görünür ve MLVs için Şekil 1A' gösterildiği gibi eklenir. Bu veziküller bu protokol ana odak ve mikroenjeksiyon işlemi için uygun. Kalan GUVs yaklaşık % 25 dalgalı görünür (Şekil 1B), daha düşük bir membran gerginlik rejim gösterge olduğu. Bu dalgalı veziküller Ayrıca borulu çıkıntılar oluşumu için izin; Ancak, onlar farklı kinetik ve bu iletişim kuralı25kapsamý dýþýndadýr kurulan MTPs farklı bir morfoloji sergi. Hazırlanan veziküller tipik çapı 2-40 µm GUVs için ve MLVs için 2-15 µm arasında değişir. En iyi şef veya daha büyük boyut için kalsiyum iyonları maruz 5 mikron.
Mikropipetler singe hücreli sorgulama şemaları de olduğu gibi sentetik GUVs manipülasyon için birkaç yıl37,38gerektiren prosedürler içinde kullanılmaktadır. Bu uygulamaların çoğu micropipette ve yüzey hücreleri veya veziküller ile arasında doğrudan fiziksel temas söz konusu. Yama-klemp tekniği veya membran bağları nanotüp veziküllü ağlar23,28,39bina yanı sıra Şef zar çekerek örnekler. Son zamanlarda, Mikropipetler iyonları ve moleküllerin türdeş olmayan hücre microenvironments24,25birleştirmeye GUVs etrafında lokalize degradeler oluşturmak için de kullanılmıştır. Sunulan protokolünde düzgün işleyen micropipette (Şekil 5A) içinde bulunan çözüm serbest bırakarak Şef yüzeyinde kalsiyum iyon degrade oluşturmak için çok önemli bir faktördür. Uygun micropipette Şef yüzeyde konumlandırma ve lipid membran ile temas kaçınarak başarılı mikroenjeksiyon için gereklidir. Micropipette ipucu MTPs yakınındaki hücre zarı kalsiyum varyasyonları taklit ederken oluşturmak için en iyi bir mesafe Şef yüzeyden yaklaşık 3 µm olarak düzenlenmektedir. Micropipette ucunu kazara kırık (Şekil 5B) ise, yerine gereklidir. Hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu için karşılık gelen 2 ve 5 mM25, MTP oluşum için sağlar, micropipette içinde daha önce test edilmiş konsantrasyon aralığı CaCl2 arasındadır. Düşük CaCl2 konsantrasyonlarda, yani, 1 mM, hiçbir MTPs gözlenir.
MTPs oluşumu üzerine kalsiyum mikroenjeksiyon MTPs pozlama (Şekil 4B) sitesinde büyüdüğünde küçük membran invaginations oluşumu ile başlar. MTPs kalsiyum iyonları maruz Şef membran kalır sürece büyümeye devam ediyor. Dalgalanma ve kalsiyum İyon kaynağı uzak (Şekil 4 c, takıma giren film 1) gelin. Ne zaman kalsiyum İyon kaynağı edildin, MTPs dağılım MTPs kalır veya yok sonuçlandırmak üzere Şef yüzey üzerinde.
MTPs oluşumu doğrudan ilişkili olduğu Şef membran maruz dış broşür için bağlama ve spontan eğriliği (m), uyarının harekete geçirilmesine karşılık lokalize kalsiyum iyon açıklanabilir kendiliğinden oluşumu gerilim σ = 2κm2 (κ ise bükme sertlik) membran bükme ve şekillendirme içe MTPs ikna etmek. Önceki raporlar membran deformasyon yoğunlaşma tarafından açıklanmış ve/veya negatif spontan eğriliği40ile sonuçlanan bağlama kalsiyum iyonlarının membran için üzerine olumsuz ücret lipidler, kümeleme olabilir göstermiştir. Alternatif olarak, Ca2 + olumsuz ücret bilayer yüzeyine güçlü bağlama maruz lipid bilayer broşür yüzey şarj yoğunluğu etkisiz hale getirir. Bu ücret yoğunluk farkı sıfır olmayan spontan eğrilik, membran25eğmek için yeterli kaynaklanan bilayer genelinde yol açar.
MTPs gözlenen oluşumu lipid membranlar kalsiyum iyonları için hassasiyet gösterir ve membran yapılar üreten bir roman temassız yaklaşım sunuyor. Kaynağını elucidating bu membran tubulation, membran şekil çeşitli hücre fonksiyonları ve hücre yeniden şekillendirme sırasında geçiş dinamiklerini anlamak için önemli olabilir ve lipid organizasyon içinde hücre içine anlayışlar kazanmak için yardımcı olabilir membranlar.
Gözlenen MTPs kalsiyum iyon pozlama geçiren membran sitede her zaman oluşturulur. Böylece, micropipette ucunu konumunu seçerek, bu çıkıntı büyüme için Şef yüzey alanını tanımlamak mümkündür. Micropipette yavaş yavaş ise ileri (0,1-0,3 µm/s) membran ayırma mesafeden koruyarak Şef yüzeyi taşındı MTPs micropipette ile tandem çevrilir. Şekil 6 ve karşılık gelen ek Movie 2 Şef yüzeyi çevresine MTPs böyle geçiş göstermektedir. Bu işlem sürekli kalsiyum iyon enjeksiyon25üzerine yeni MTPs oluşumu tarafından eşlik etmesi muhtemeldir. (Yukarıdaki 0.7 µm/s) yüksek çeviri fiyatlara MTPs micropipette ipucu takip etmek mümkün değildir. Bunun yerine, yeni çıkıntılar micropipette ucu (Şekil 7) yeni konumda oluşturulur.
Gözlenen temassız kalsiyum iyon güdümlü çevrilmesi MTPs etrafında daha fazla sürüş anlayışımız hücrelere membran yapılar dinamikleri arkasında zorlar Şef yüzey olabilir. Ayrıca, bu yaklaşım malzeme taşıma yumuşak madde sistemlerinde kimyasal degradeler kullanarak kontrol etmek için bir roman temassız modu sunuyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig1.jpg"> Resim 1 : Bir cam kapak kayma yüzeyi üzerinde immobilize Şef-MLV kompleksleri görüntülerini temsilcisi Floresan Mikroskobu. (A). örnek olarak küresel bir şef. Şef MLV için bağlı bir yarımküre şeklinde görünür. (B). örnek olarak dalgalı bir şef. Siyah okları membran deforme alanları belirtir. Görüntü gelişmiş ve fluorescently etiketli Şef membranlar görselleştirme geliştirmek için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig2.jpg"> Resim 2 : Şef-MLV hazırlık ve mikroenjeksiyon düzenleri şematik çizimler. (A). Kuru lipit katmanı kloroform lipid çözümden döner buharlaşma sonucu cam şişe dibinde oluşturulur. (B). rehydrated lipit katmanı sonicated ve küçük lipid veziküller kurdu. (C). vezikül çözüm (5 µL) küçük bir damlacık bir cam kapak kayma yüzeyine yerleştirilen ve lipid çözüm kurutmak ve (Bu adım gösterilmez) bir kuru lipid film oluşturmak için bir desiccator 20 dk için transfer. Tampon çözeltinin 50 µL kuru lipid filmle nemlendirilmesi önceden biçimlendirilmiş Şef-MLV kompleksler oluşturur. (D). önceden biçimlendirilmiş kompleksleri aktarım arabellek sonuçları seyrek ayrılmış Şef-MLVs oluşumunda daha büyük bir hacim için cam kapak kayma yüzeyine bağlı. (E). micropipette Şef yüzeye yakın konumlandırma ve kalsiyum iyonları serbest MTPs oluşumunu tetikler. Resimler çizilmez ölçek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig3.jpg"> Şekil 3 : Kalsiyum iyonları mikroenjeksiyon için deneysel Kur. (A). deneysel kurulumunun MTPs GUVs içinde oluşturmak için gereken bileşenleri. (B). mikroenjeksiyon kurulum ayrıntılarını. Cam coverslip Şef-MLV kompleksleri çözüm ile mikroskop sahne alanı'nda yerleştirilir. 30 ° (beyaz işaretli) micropipette ve cam kapak kayma yüzeyi arasındaki açıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig4.jpg"> Şekil 4 : MTPs üzerine mikroenjeksiyon Şef yüzeyinde kalsiyum iyonlarının oluşumu. (A). Şef-MLV karmaşık bir kalsiyum iyon degrade maruz önce. Şef entrapped lipid vezikül ok gösterir ve hangi gözlem MTPs. (B) engel değil. Küçük MTPs mikroenjeksiyon kalsiyum iyonlarının (CaCl2 micropipette 5 mM konsantrasyonu) üzerine oluşur. (C). kalsiyum iyonları için sürekli maruz üzerine MTPs büyüme. Floresan görüntü gelişmiş ve görselleştirme amaçlar için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig5.jpg"> Şekil 5 : Cam kalsiyum iyon mikroenjeksiyon için kullanılan Mikropipetler. (A). düzgün işleyen bir micropipette örneği. (B). ucu kırık (hasarlı bölgeyi siyah bir ok ile gösterilen) sahip bir micropipette örneği. Her iki görüntü gelişmiş ve daha iyi görselleştirme için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig6.jpg"> Şekil 6 : Kalsiyum iyon güdümlü tercümesi Şef yüzeyi çevresine MTPs. (A). MTPs mikroenjeksiyon 5 mm CaCl2 çözüm üzerine Şef yüzeyde oluşan. (B-C). Micropipette ipucu tercümesi (0,2-0,3 mikron/s) membran yüzey MTPs kalsiyum İyon kaynağı yönünde hareket tetikler. Siyah okları micropipette hareket yönü vurgulamak. Görüntü gelişmiş ve membran görselleştirme geliştirmek için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig7.jpg"> Şekil 7 : Yüksek çeviri hızında micropipette ipucu MTPs. (A). MTPs mikroenjeksiyon 5 mm CaCl2 çözüm (beyaz çizgi) üzerine Şef yüzeyde oluşan. (B-C). Micropipette Şef yüzeyi (1 mikron/s) çevresine yüksek çeviri oranında daha önce kurulan MTPs (beyaz çizgi) saçılma yanı sıra micropipette uç (kırmızı çizgi), yeni konumda yeni MTPs oluşumu sonuçlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov1.jpg"> Takıma giren film 1: MTPs oluşumu içinde Şef Ca için yerelleştirilmiş maruz üzerine 2 + gradyan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_1.avi" target="_blank">Bu film indirmek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov2.jpg"> Takıma giren film 2: Kalsiyum iyon güdümlü MTP geçiş Şef yüzeyi çevresine.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_2.avi" target="_blank">Bu film indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients at JoVE.com

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Analyzing the Photo-oxidation of 2-propanol at Indoor Air Level Concentrations Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry

2-propanol iç hava düzey konsantrasyonlarda alan asimetrik iyon mobilite spektrometresi kullanılarak fotoğraf oksidasyonunu analiz

We demonstrate a versatile protocol to be used for determining the effectiveness of photocatalysts in degrading indoor air concentration (ppb) volatile ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Biyopololitik katkı maddelerinin varlığında kalsiyum karbonat oluşumu

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

İkincil İyon Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Ayrılmış Safsızlıkların 3D Derinlik Profili Rekonstrüksiyonu

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Localized Bathless Metal-Composite Plating via Electrostamping

Elektrodamgalama ile Lokalize Banyosuz Metal-Kompozit Kaplama

Composite plating with particles embedded into the metal matrix can enhance the properties of the metal coating to make it more or less conductive, hard, ...