Name: differentiation, maintenance, and analysis of human retinal pigment epithelium cells: a disease-in-a-dish model for best1 mutations
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations at JoVE.com

הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH EY025290, GM127652, אוניברסיטת רוצ'סטר סטארט-אפ מימון.

1. בידול של hPSC כדי RPE
<ol><li>לשמור על, מעבר hPSCs שתואר קודם לכן גם18. הערה: כל התאים (כולל hPSCs hPSC-RPEs) גדלים 37 ° C-5% CO2 לאורך משך הפרוטוקולים בהתפתחותם.</li>
	<li>
לפני בידול, פיצול hPSCs confluent ללוחות 6-ובכן מצופים מראש.
	<ol>
<li>מעיל צלחות, להפשיר קרום המרתף מטריקס על קרח לשעה בערך, לה?...

<ol>
	<li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies.">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li><li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans.">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein,+bestrophin-1,+cause+retinitis+pigmentosa.">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).</li><li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best+disease)+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration.">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).</li><li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+novel+gene,+VMD2,+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best's+disease).">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li><li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy.">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).</li><li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+(ADVIRC).">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li><li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEST1:+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies.">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin,+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Boon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+ocular+phenotypes+caused+by+mutations+in+the+BEST1+gene.">The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).</li><li>Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+bestrophins+in+ocular+epithelia.">Functional roles of bestrophins in ocular epithelia.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).</li><li>Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+toad+retinal+pigment+epithelium.">Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium.</a> Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+DIDS+on+the+chick+retinal+pigment+epithelium.+II.+Mechanism+of+the+light+peak+and+other+responses+originating+at+the+basal+membrane.">Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane.</a> J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+Biopsy+and+Patient-Specific+Stem+Cell+Lines.">Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines.</a> Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).</li><li>Milenkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin+1+is+indispensable+for+volume+regulation+in+human+retinal+pigment+epithelium+cells.">Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).</li><li>Moshfegh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BESTROPHIN1+mutations+cause+defective+chloride+conductance+in+patient+stem+cell-derived+RPE.">BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE.</a> Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1's+essential+role+in+mediating+Ca2+-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE.">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+some+organizational+characteristics+of+the+mouse+central+retina+and+the+human+macula.">A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula.</a> PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).</li><li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application.">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li><li>Idelson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li><li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Induced+Stem-Cell-Derived+Retinal+Cells+for+Macular+Degeneration.">Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+scalable+process+for+the+differentiation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells.">A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).</li><li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers.">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540 (2013).</li><li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2+-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A/16B+Ca2+-gated+Cl-+channels.">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels.">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li><li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2/CaV2.2+channels.">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).</li><li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels.">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li><li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rem,+a+member+of+the+RGK+GTPases,+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase.">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate.">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction.">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).</li></ol>

ההליך החשוב ביותר עבור הגישה המחלה-ב--מאכל הוא להבדיל hPSCs עם מוטציה גורמי מחלות לשושלת התא הנכון, אשר RPE עבור BEST1. לפיכך, לאחר ניסוי בידול, התאים hPSC-RPE שנוצר בקפידה לאמת על מעמדם בוגר ספציפי RPE מורפולוגיות, חלבון סמני16,17,18. כדי למזער את החפ...

זה תועד כי לפחות חמישה מחלות ניווניות ברשתית נגרמות על ידי מוטציות גנטיות BEST1 ג'ין1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, עם המספר של מוטציות שדווחה כבר מעל 200, הגדלת עדיין. אלה BEST1-הקשורים במחלות, הידוע גם בשם bestrophinopathies, לגרום אובדן ראייה מתקדמת ועיוורון אפילו, ויש כיום אין טיפולים יעילים. המוצר חלבון של BEST1, כלומר BESTROPHIN1 (BEST1), היא Ca2 +-מופעל ערוץ Cl– (CaCC) במיוחד לידי ביטוי אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) של העיניים5,6, 8,9. חשוב, פנוטיפ קליני של BEST1-מחלות המשויך הוא התגובה חזותי מופחתת לגירויים קלים, שנקרא שיא אור (LP) נמדד10,' electrooculogram '11; LP הוא האמין בתיווכו CaCC RPE12,13,14. על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים פתולוגי של מוטציות BEST1 , לפעול לקראת טיפולים פוטנציאליים, זה חיוני ללמוד מוטציה ערוצי BEST1 endogenously לידי ביטוי תאי RPE אדם.
עם זאת, קבלת RPE תאים ישירות מחולים חיים אינה מעשית מאוד. למרות תאי RPE יליד ובביצים ביופסיות של גופות אדם, העוברים, הנגישות המקורות הללו קשה מגבילה באופן משמעותי מחקר מדעי. לכן חשוב וקריטי. שיהיה מקורות חלופיים RPE מלבד העיניים האנושיות. שיחה זו נענתה על ידי הפיתוחים האחרונים בתחום תאי הגזע טכניקות, כמו תאי RPE פונקציונלי עכשיו ניתן להבחין מן האדם גזע pluripotent (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים (hESCs) ואת המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), האחרון שיוצר התכנות fibroblasts העור העיקרי של תורמים16,17,18. חשוב, התחדשות עצמית pluripotency של hPSCs על מנת להבטיח מקור אמין כדי ליצור RPEs, בעוד המטופל-יחודיות של hiPSCs ופוטנציאל השינוי גנומית של hESCs (למשל, על-ידי CRISPR) מציעים מודל המחלה-ב--תבשיל רב-תכליתי עבור מוטציות BEST1 הרצוי.
hPSC-RPE יש כמה יתרונות על פני עכברים RPE מודלים: 1) עכברים knockout BEST1 אינם מציגים כל סטייה ברשתית19, מעלים את האפשרות של דרישה גנטית שונה של BEST1 ב RPE בין בעכברים ובבני אדם; 2) יש רק 3% של תאי RPE אדם binucleate, לעומת 35% בעוד עכברים20; 3) hiPSC-RPE potentiates עצמיים השתלת ב קליניים לטיפול רשתית הפרעות21. בכל זאת, בבעלי חיים הם עדיין חיוני ללמוד RPE פיזיולוגיה, פתולוגיה במערכת בשידור חי, הפוטנציאל oncogenic של hiPSC. אי אפשר להתעלם.
ההליך פה מתאר של hPSC יעיל ופשוט למדי לפרוטוקול בידול RPE יכול לשמש למטרות מחקר ומטרות קליניים. פרוטוקול זה משתמש nicotinamide (ויטמין B3) כדי להגדיל את הבידול של hPSCs על רקמה עצבית, אשר בהמשך הנגרמת להבדיל לתוך RPE על ידי טיפול עם activin-א טיפול Nicotinamide הוכח להגדיל את מספר תאי פיגמנט (סימן של בידול לתוך RPE), ואולי על-ידי attenuating הפעילות אפופטוטיים להיפגע להבדיל תאים22. התאים hPSC-RPE וכתוצאה מכך מציגים את סמני מפתח אותו, מורפולוגיה המרוצף והפונקציונליות הסלולר יליד האנושי RPE תאים22. לפיכך, בסביבה מחקר, התאים hPSC-RPE וכתוצאה מכך מתאימים לפי הזרם ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunostaining, תיקון שלם-תא קלאמפ, שעבורו הליכים ניסיוני מפורטים ניתנים גם. קלינית, תאי RPE שמקורם בתאי גזע הראו פוטנציאל גדול לטיפול השתלת של ניוון מקולרי מחקרים שנעשו בבעלי חיים והן בניסויים בבני אדם23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Knock-Out (KO) DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KO serum replacement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human activin-A</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (a modification)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine-penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR-1 medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER mammalian protein extraction reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE65 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRALBP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA5-15739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA5-35521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA EPC10 patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>895040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation, maintenance, and analysis of human retinal pigment epithelium cells: a disease-in-a-dish model for best1 mutations

למרות מעל 200 מוטציות גנטיות הגן האנושי BEST1 מזוהה, קשורה מחלות ניווניות של הרשתית, המנגנונים פתולוגיים נשארים חמקמק בעיקר בשל היעדר מודל טוב ויוו ללמוד BEST1 מוטציות שלה בתנאים פיזיולוגיים. BEST1 מקודד ערוץ יון, כלומר BESTROPHIN1 (BEST1), אשר מתפקד באפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE); עם זאת, הנגישות מוגבלת מאוד מקורית תאי RPE אדם מייצג אתגר למחקר מדעי. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור אנושי RPEs הנושאת BEST1 גורמי מחלות מוטציות על ידי בידול המושרה מתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כפי hPSCs עצמית מתחדשת, גישה זו מאפשר לחוקרים יש מקור יציב של hPSC-RPEs עבור ניתוח ניסיוני שונים, כגון immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ, ובכך מספק מודל המחלה-ב--מאכל חזק מאוד BEST1-הקשורים לתנאי ברשתית. ראוי לציין, אסטרטגיה זו ניתן להחיל ללמוד פיזיולוגיה RPE (פתו) ו אחרות הגנים של עניין הביעו באופן מקורי ב- RPE.

הצעד המאתגר ביותר מבחינה טכנית הוא הבידוד ידנית, שמטרתה להשיג טוהר גבוה של אוכלוסיה hPSC-RPE הבדיל P0 . לאחר בידוד מוצלח, > תאים 90% באוכלוסייה P0 לגדול ולהתבגר כדי להציג חתימה RPE מורפולוגיות (איור 1C). קיומו של חלק מינורי שאינו-RPE או תאי RPE ילדותי באוכלוס?...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations at JoVE.com

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להבדיל תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית תאי גזע pluripotent האנושי הנושאים מוטציות נגזר החולה. הקווים המוטנטים תא עשוי לשמש עבור ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ. גישה זו מחלה-ב--תבשיל עוקף את הקושי של השגת תאי RPE אדם מקורי.

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

בתיווך CRISPR הגנום עריכה של פטריות פתוגניות קנדידה אלביקנס

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

אפיון של בידול במבחנה של Keratinocytes האדם העיקרי על ידי ניתוח RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...