Name: differentiation, maintenance, and analysis of human retinal pigment epithelium cells: a disease-in-a-dish model for best1 mutations
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00
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이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.

1입니다. RPE에 hPSC의 차별화
<ol><li>유지 하 고 이전18을 설명 하는 통행 hPSCs. 참고: 모든 셀 (를 포함 하 여 hPSCs와 hPSC-RPEs) 성장과 분화 프로토콜의 기간 내내 5% CO2 에서 37 ° C에서 성장 된다.</li>
	<li>
차별화, 전에 미리 코팅된 6-잘 접시에 confluent hPSCs 분할.
	<ol>
<li>플레이트 코트, 지하실 멤브레인 매트릭스 1 시간 약에 대 한 얼음에 녹여, 1시 50분에 4 ° C DMEM...

<ol>
	<li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies.">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li><li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans.">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein,+bestrophin-1,+cause+retinitis+pigmentosa.">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).</li><li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best+disease)+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration.">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).</li><li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+novel+gene,+VMD2,+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best's+disease).">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li><li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy.">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).</li><li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+(ADVIRC).">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li><li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEST1:+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies.">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin,+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Boon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+ocular+phenotypes+caused+by+mutations+in+the+BEST1+gene.">The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).</li><li>Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+bestrophins+in+ocular+epithelia.">Functional roles of bestrophins in ocular epithelia.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).</li><li>Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+toad+retinal+pigment+epithelium.">Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium.</a> Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+DIDS+on+the+chick+retinal+pigment+epithelium.+II.+Mechanism+of+the+light+peak+and+other+responses+originating+at+the+basal+membrane.">Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane.</a> J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+Biopsy+and+Patient-Specific+Stem+Cell+Lines.">Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines.</a> Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).</li><li>Milenkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin+1+is+indispensable+for+volume+regulation+in+human+retinal+pigment+epithelium+cells.">Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).</li><li>Moshfegh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BESTROPHIN1+mutations+cause+defective+chloride+conductance+in+patient+stem+cell-derived+RPE.">BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE.</a> Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1's+essential+role+in+mediating+Ca2+-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE.">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+some+organizational+characteristics+of+the+mouse+central+retina+and+the+human+macula.">A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula.</a> PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).</li><li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application.">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li><li>Idelson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li><li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Induced+Stem-Cell-Derived+Retinal+Cells+for+Macular+Degeneration.">Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+scalable+process+for+the+differentiation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells.">A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).</li><li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers.">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540 (2013).</li><li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2+-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A/16B+Ca2+-gated+Cl-+channels.">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels.">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li><li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2/CaV2.2+channels.">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).</li><li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels.">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li><li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rem,+a+member+of+the+RGK+GTPases,+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase.">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate.">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction.">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).</li></ol>

HPSCs는 RPE BEST1에 대 한 올바른 세포 계보에 질병을 일으키는 돌연변이와 차별화 하는 질병--요리에 접근에 대 한 가장 중요 한 절차가입니다. 따라서, 각 분화 실험 후 결과 hPSC RPE 세포 확인 되어야 합니다 신중 하 게 그들의 성숙 상태에 대 한 RPE 특정 형태학 및 단백질 마커16,,1718. 클론 유물을 최소화 하려면 동일한 환?...

그것은 적어도 5 망막 퇴행 성 질환 BEST1 유전자1,2,3,4,,56 유전자 변이 의해 발생 하는 문서화 되었습니다. , 7 , 8, 200, 여전히 증가에 이미 보고 된 돌연변이의 숫자와 함께. 이러한 BEST1-관련된 질병, 일컬어 bestrophinopathies, 진보적인 시력 손실과 심지어 실명, 원인과 현재 효과적인 치료법 없습니다. BEST1, 즉 BESTROPHIN1의 단백질 제품 (BEST1)는 캘리포니아2 +-활성화 된 Cl- 채널 (CaCC) 눈5,6, 망막 안료 상피 (RPE)에서 구체적으로 표현 8,9. BEST1의 중요 한 것은, 임상 표현 형-관련된 질병은 빛 자극, 라이트 피크 (LP) electrooculogram10,11; 측정 이라고 감소 시각적 반응입니다 LP는 RPE12,,1314CaCC에 의해 중재 될 여겨진다. 더 나은 BEST1 돌연변이의 병 적인 메커니즘을 이해 하 고 잠재적인 치료 쪽으로 작동, 돌연변이 BEST1 채널 endogenously 인간의 RPE 세포에 표현 공부를 필수적입니다.
그러나, RPE 취득 라이브 환자에서 직접 셀 아니다 매우 실용적인. 네이티브 RPE 세포 인간의 시신과 태아의 생 검에서 수확 수 있습니다, 비록 어려운 접근성이이 소스에는 크게 과학 연구를 제한 합니다. 따라서, 그것은 대체 RPE 자사 인간의 눈을 중요입니다. 이 전화 기능 RPE 세포 이제 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 배아 줄기 세포 (hESCs)를 포함 하 여에서 분화 될 수 있다 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 후자로 줄기 세포 기술에 있는 최근 전진에 의해 응답 되어 기본 피부 섬유 아 세포 기증자16,,1718에서 프로그래밍에 의해 생성 되 고. 자체-갱신 및 hPSCs의 pluripotency hiPSCs의 환자의 특이성 및 게놈 수정 잠재력 (예를들면, CRISPR에 의해) hESCs의 다양 한 요리에 질병 모델을 제공 하는 동안 RPEs, 생성 하는 신뢰할 수 있는 소스를 확인 하는 중요 한 것은, 원하는 BEST1 돌연변이.
hPSC-RPE 쥐 RPE 모델에 몇몇 이점이 있다: 1) BEST1 녹아웃 마우스 어떤 망막 이상19, 생쥐와 인간; 사이 BEST1 RPE에의 다른 유전 요구의 가능성을 높이 나타나지 않습니다 2)의 3% 인간 RPE 세포는 쥐20; 35% 달리 binucleate 3) hiPSC-RPE potentiates 임상 헌 이식 망막의 치료 장애21. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델은 여전히 라이브 시스템에 RPE 생리학과 병리학 공부를 위한 불가결 하 고 hiPSC의 종양 가능성을 간과할 수 없습니다.
여기 절차 RPE 차별화 프로토콜 연구 및 임상 목적을 위해 사용 될 수 있는 유용 하 고 비교적 간단한 hPSC을 설명 합니다. 이 프로토콜 니코틴 (비타민 B3)를 사용 하 여 더 치료 activin-a에 의해 RPE로 분화를 유도 신경 조직에 hPSCs의 증가 니코틴 치료가 보여왔다 색소 세포 (RPE로 차별화의 기호)를 증가 시킬 가능성이 셀22차별화의 apoptotic 활동을 약하게 하 여. 결과 hPSC RPE 세포 네이티브 인간의 RPE 세포22로 동일한 키 마커, 조약돌 형태학 및 세포 기능을 표시합니다. 따라서, 연구 설정에서 결과 hPSC RPE 세포는 immunoblotting, immunostaining, 및 자세한 실험 절차는 또한 제공 하는 전체 셀 패치 클램프를 포함 한 다운스트림 기능 분석에 적합 합니다. 임상, RPE 세포 줄기 세포에서 파생 된 동물 연구와 인체 실험23황 반 변성의 이식 치료를 위한 큰 잠재력을 보여왔다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Knock-Out (KO) DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KO serum replacement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human activin-A</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (a modification)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine-penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR-1 medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER mammalian protein extraction reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE65 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRALBP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA5-15739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA5-35521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA EPC10 patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>895040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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differentiation, maintenance, and analysis of human retinal pigment epithelium cells: a disease-in-a-dish model for best1 mutations

병 적인 메커니즘 BEST1 공부에 대 한 좋은 vivo에서 모델의 부족 때문에 주로 애매 남아 있지만 인간의 BEST1 유전자에 200 개 이상의 유전자 변이 발견 되었고 망막 퇴행 성 질환에 연결, 그리고 생리 적인 조건 하에서 그것의 돌연변이입니다. BEST1 인코딩하는 이온 채널, 즉 BESTROPHIN1는 기능 (BEST1), 망막 안료 상피 (RPE); 그러나, 네이티브 인간의 RPE 세포에 매우 제한 된 접근성 과학 연구에 대 한 큰 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜 BEST1 질병 유발 돌연변이 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 유도 분화에 의해 베어링 인간의 RPEs를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 연구자 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 다양 한 실험 분석에 대 한 hPSC RPEs의 지속적인 소스를 있으며 따라서에 대 한 매우 강력한 접시에 질병 모델을 제공 합니다 hPSCs 자동 재생으로 BEST1-망막 조건 관련. 특히,이 전략은 RPE (patho) 생리학과 RPE에 기본적으로 표현 하는 관심의 다른 유전자 연구에 적용할 수 있습니다.

가장 기술적으로 도전적인 단계는 차별화 된 P0 hPSC-RPE 인구의 높은 순도 달성 하는 것을 목표로 수동 격리 합니다. 성공적인 격리 후 > 90% 셀 P0 인구에서 성장 하 고 서명 RPE 형태학 (그림 1C) 표시를 성숙. 비 RPE 또는 P0 인구에 미숙한 RPE 세포의 작은 부분의 존재 거의 불가피 하지만 간섭 하지 않습니다 다운스트림 실험으로 안...

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Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

연구

유전학

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...