Name: purification and reconstitution of trpv1 for spectroscopic analysis
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00
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Nós somos muito gratos ao Dr. H. Mchaourab para fornecer acesso aos espectrómetros EPR e veados e Dr. T. Rosenbaum para fornecer o plasmídeo de TRPV1 cisteína-menos completo.

1. TRPV1 Mutagenesis
Nota: Uma construção TRPV1 mínima para análise espectroscópica26 foi construída a partir do canal de cisteína-menos completo TRPV127 usando o método de reação em cadeia (PCR) polimerase (Figura 1). Essa construção cisteína-menos mínima TRPV1 (referida como eTRPV1, daqui em diante) é composto por resíduos 110-603 e 627-764. eTRPV1 foi clonado no pMO (um vetor baseado em pcDNA3.1) par...

As tecnologias atuais para a expressão e purificação de proteínas de membrana mamíferos tornaram possível obter quantidades suficientes de proteína para estudos espectroscópicos14,15,16,42. Aqui, nós adaptamos essas tecnologias para expressar, purificar, reconstituir e realizar análises espectroscópicas em TRPV1.
Entre os passos críticos no protocolo, aba...

Com os recentes avanços na microscopia single-particle cryo-elétron (cryo-EM), estruturas de canal de íon mamíferos foram obtidas numa taxa extraordinária. Particularmente, estudos estruturais dos canais de íon polimodais, tais como o transiente do receptor potencial vanilloid 1 (TRPV1), forneceram mais compreensão de sua ativação mecanismos1,2,3, 4 , 5. no entanto, informações dinâmicas sobre canais iônicos, incorporado em um ambiente de membrana serão necessárias compreender seus mecanismos de associada e ligação de drogas polimodais.
Ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e espectroscopia de ressonância (veado) elétron-elétron duplo forneceu alguns dos modelos mecanicistas mais definitivos para o íon canais6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. essas abordagens foram restringidas ao exame de procariotas e íon archeal canais que produzem uma grande quantidade de proteínas purificadas de detergente quando overexpressed em bactérias. Com o desenvolvimento da produção de proteínas eucariotas membrana no inseto e células de mamífero para caracterização estrutural e funcional14,15,16, é agora possível obter bioquímicos quantidades de proteínas purificadas de detergente para estudos espectroscópicos.
Os sinais EPR e cervos surgem de um rótulo de paramagneticspin (SL) (ou seja, methanethiosulfonate) anexado a um resíduo de single-cisteína da proteína. Os rótulos rotação relatam três tipos de informações estruturais: movimento, acessibilidades e distâncias. Esta informação permite determinar se os resíduos estão enterrados dentro da proteína ou são expostos à membrana ou ambiente aquoso na apo e Estados ligados de ligante13,17,18,19. No contexto de uma estrutura de alta resolução (quando disponível), os dados do EPR e veados fornecem uma coleção de restrições para a derivação de modelos dinâmicos em seu ambiente nativo enquanto monitora transição associada reversível (ou seja, fechado, aberto, sensibilizada e insensíveis). Além disso, as regiões flexíveis que podem ser difícil determinar por cristalografia de raios x ou cryo-EM podem ser obtidas usando esses conjuntos de dados ambientais para atribuir estruturas secundárias, bem como a localização dentro da proteína20. Estruturas de Cryo-EM obtidos em lipídios nanodiscs fornecido informações valiosas sobre o canal de íon canais3,21,22,23,24, 25; no entanto, abordagens espectroscópicas poderiam fornecer informação dinâmica dos Estados conformacionais (por exemplo, mudanças térmicas) que pode ser difícil de determinar usando cryo-EM.
Muitas dificuldades devem ser superadas para implementar EPR e veados, incluindo a falta de função da proteína ao remover todos os resíduos de cisteína (especialmente abundantes em mamíferos canais), rendimento de baixa proteína, instabilidade de proteínas durante a purificação e depois girar rotulagem e a agregação da proteína em detergente ou lipossomas. Aqui, nós projetamos protocolos para superar estas barreiras críticas e obtiveram informações de espectros de veado e EPR para um receptor sensorial dos mamíferos. O objetivo aqui é descrever metodologias para a expressão, purificação, rotulagem e reconstituição de um rato de cisteína-menos mínimo funcional TRPV1 (eTRPV1) construir para análises espectroscópicas. Esta metodologia é adequada para essas proteínas de membrana que mantém sua função apesar da remoção de resíduos de cisteína ou que contêm cisteína, formando ligações de bissulfeto. Esta coleção de protocolos poderia ser adaptada para a análise espectroscópica de outros canais de íon dos mamíferos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1047">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:292px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:251px;">210519-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Albumin Bovine Serum (BSA)</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-420-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amylose resin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E8021L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aprotinin</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-655-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Asolectin from Soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10359016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Biobeads SM-2 Adsorbents&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate glass pipettes (3.5&#39;&#39;) (oocyte inyection)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings)</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-110-10HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2 2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Carbenicillin (Disodium)</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>C-103-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cellfectin Reagent</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10362-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cellSens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C606SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Critiseal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Maltose Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High glucose medium (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0572&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td>
			<td>Epoch Life Science, Inc</td>
			<td>2160250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GenCatch PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Epoch Life Science, Inc</td>
			<td>2360050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capillary (25 &#181;l)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Flask 2800 mL</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>4423-2XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK293S GnTl-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside)</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:292px;">Fisher bioReagents</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leupeptin Hemisulfate</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>L-010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2 6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4 7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MOPS</td>
			<td>Fisher bioReagents</td>
			<td>BP2936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc</td>
			<td>O873900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pepstatin A</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>P-020-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pluronic Acid F-127 (20%)</td>
			<td>PromoKine&#160;&#160;</td>
			<td>CA707-59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PMSF</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-L-lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sealed capillary</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>special order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SF-900 II SFM (insect cell medium)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10902-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sf9 Cells (SFM Adapted)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Soybean Polar Lipid Extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td>541602C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29091596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TCEP HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tetracyclin Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td>0123-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X-gal</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>X4281C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xenopus oocytes</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00935M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XL1 - Blue Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td>0127-01-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:339px;">Econo-Pack chromatography column</td>
			<td style="width:292px;">Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels</td>
			<td style="width:292px;">Bio-Rad</td>
			<td>17000436</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">pFastBac1 Expression Vector</td>
			<td style="width:292px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:251px;">10360-014</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DH10Bac Competent Cells</td>
			<td style="width:292px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:251px;">10361-012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critiseal capillary tube sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>02-676-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABI Model 3130XL Genetic Analyzers</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4359571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipete</td>
			<td>Fishebrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanoject II</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and reconstitution of trpv1 for spectroscopic analysis

Canais de íon polimodais transduce vários estímulos de diferentes naturezas em alostéricos alterações; essas conformações dinâmicas estão desafiando para determinar e permanecem em grande parte desconhecidos. Com os recentes avanços na luz derramamento de single-particle cryo-elétron microscopia (cryo-EM) sobre as características estruturais dos sítios de ligação do agonista e o mecanismo de ativação de vários canais iônicos, o palco está montado para uma análise aprofundada e dinâmica de seus gating mecanismos, utilizando abordagens espectroscópicas. Técnicas espectroscópicas como ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e ressonância elétron-elétron duplo (veado) foram restringidas ao estudo dos canais de íon procarióticas que pode ser purificado em grandes quantidades. A exigência de grandes quantidades de proteínas de membrana estável e funcional tem dificultado o estudo dos canais de íon mamíferos usando essas abordagens. EPR e veados oferecem muitas vantagens, incluindo a determinação da estrutura e mudanças dinâmicas das regiões de proteína celular, embora em baixa resolução, que pode ser difíceis de obter por cristalografia de raios x ou cryo-EM, e monitoramento gating reversível transição (ou seja, fechado, aberto, sensível e insensível). Aqui, nós fornecemos protocolos para a obtenção de miligramas de funcional detergente-solubilizado transient receptor potencial cação canal membro da subfamília V 1 (TRPV1) que pode ser rotulado por espectroscopia de EPR e veados.

Caracterização funcional do mínimo cisteína-menos TRPV1 construir (eTRPV1) e Single-cisteína mutantes
O primeiro passo para estudos espectroscópicos é engenheiro e caracterizar construções de cisteína-menos proteína (Figura 2A) que são funcionais e produzem quantidades bioquímicas de proteínas. eTRPV1 é funcional, conforme determinado pela imagem latente de Ca2 + e TEVC (<stro...

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Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

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Bioquímica

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

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Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

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As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

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Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...