Name: stiffness measurement of soft silicone substrates for mechanobiology studies using a widefield fluorescence microscope
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope at JoVE.com

Мы благодарим Гардель Маргарет за щедро позволяет использовать Реометр. Мы признаем поддержку от НИЗ (1R15GM116082), что позволило этой работы.

1. Изготовление мягкого силикона субстрата
<ol><li>Весят, 1,75 г компонента A и 1,75 г компонента B (: b = 1:1) из мягкого силикона эластомер комплекта с помощью (полистирол) весом поддонов.</li>
	<li>Добавьте компонент A B компонент в лотке весом и смешивать их вместе в течение 5 мин, используя соответству...

<ol>
	<li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+Substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+cytoplasmic+domain+of+N-cadherin+reduces,+but+does+not+eliminate,+traction+force-transmission.">Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).</li><li>Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+methods+for+measuring+the+elasticity+of+gel+substrates+for+cell+culture:+microspheres,+microindenters,+and+atomic+force+microscopy.">Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy.</a> Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).</li><li>Hertz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Beru&#776;hrung+fester+elastischer+Ko&#776;rper.">&#220;ber die Beru&#776;hrung fester elastischer Ko&#776;rper.</a> Journal f&#252;r die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+a+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs.</a> Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).</li><li>Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-intrusive+measurement+of+wall+shear+stress+in+flow+channels.">Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).</li><li>Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+tools+to+study+cellular+mechanotransduction.">Biophysical tools to study cellular mechanotransduction.</a> Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).</li><li>Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony.">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).</li></ol>

В то время как сфера отступ метод прост в реализации, особое внимание должно уделяться выбор indentor и толщина мягкого силикона образца. Уравнение используется для вычисления Юнга действует под набор условий11и обычно они удовлетворены когда толщина образца силикона-> 10% от ра...

Клетки в мягких тканях находятся в микро среды, чьи жесткость находится в килопаскаль диапазона1, в отличие от культуры ткани блюда которого жесткость несколько порядков выше. Первые эксперименты с клетки на внеклеточная матрица белка покрытием мягкие субстраты показал, что жесткость субстрат влияет как клетки двигаться дальше, а также придерживаться внеклеточного матрикса под2,3. В самом деле субстрат жесткость принципиально влияет на функции клеток4 в аналогии с широко распространенной биохимических сигналы. Полиакриламидных гелей (покрытые белков внеклеточного матрикса) (вода проникая) гидрогели, широко использовались как клетки культуры субстратов для mechanobiology исследований5. Полидиметилсилоксан (PDMS), наиболее распространенных силиконовые (полисилоксан), широко используется как жесткая силикона с мегапаскаль диапазона жесткости для изготовления микрон шкала6. Совсем недавно, мягкого силикона, который субстратов с жесткостью в диапазоне более физиологически соответствующих килопаскаль были заняты в качестве подложки культуры клеток для mechanobiology исследования,78.
Некоторые методы были использованы для измерения жесткости гибких подложках, включая атомно-силовой микроскопии, макроскопической деформации всей образцов на растяжение, реологии и отступы с помощью сферы и сферически наконечником microindentors9 . Хотя каждая техника имеет свои преимущества и недостатки, отступы со сферой является особенно простой, но довольно точный метод, который требует только доступ к widefield флуоресцентным микроскопом. Отступы с металлический шар был использован для измерения жесткости гидрогели в предыдущие работы3,9,10. Ранние работы, которая продемонстрировала важность субстрат жесткость клеточного движения использовали этот метод для определения гидрогеля субстрата жесткость3. Совсем недавно конфокальная микроскопия используется также для элегантной характеристика10.
Здесь, мы представляем пошаговые протокол для подготовки субстрата мягкого силикона, муфты флуоресцентные бусины (и белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген я) только к верхней поверхности, воображения отступов сферы и верхней поверхности с использованием фазы и флуоресценции изображений, соответственно и, наконец, анализ изображений для вычисления Юнга силиконовые подложки. Мягкие силиконовые подложки, подготовленных таким образом легко может использоваться для тяговой силы микроскопии экспериментов. Использование жесткой силиконовые (вместо чашку Петри) как база для мягкого силикона также позволяет mechanobiology исследования с использованием внешних стрейч. Где это уместно, также указаны практические соображения, необходимые для предотвращения возможных осложнений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="949">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:353px;">CY 52-276 A/B silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Dow Corning</td>
			<td style="width:144px;">CY 52-276</td>
			<td style="width:263px;">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Pierce EDC</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI22980</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;Pierce Sulfo-NHS crosslinker</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI-24510</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 &#181;m, 2 mL</td>
			<td>Spherotech, Inc.</td>
			<td>CFP-0558-2</td>
			<td>Store at 4&#176;C, do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.0 mm Acid washed Zirconium beads</td>
			<td style="width:191px;">OPS Diagnostics LLC</td>
			<td>BAWZ 1000-250-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:353px;">Deep UV chamber with ozone evacuator</td>
			<td style="width:191px;">Novascan Technologies, Inc.</td>
			<td style="width:144px;">PSD-UV4, OES-1000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Wide field fluorescence microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:144px;">DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Collagen I, from rat tail</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:144px;">354236</td>
			<td>Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">ImageJ-NIH</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:144px;">N/A</td>
			<td>public-domain software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stiffness measurement of soft silicone substrates for mechanobiology studies using a widefield fluorescence microscope

Мягких тканей в организме человека, как правило, имеют жесткость в диапазоне килопаскаль (kPa). Соответственно силикона и гидрогелевые гибких подложках было доказано быть полезным субстратов для культивирования клеток в физической микроокружения, который частично имитирует условия в естественных условиях . Здесь мы представляем простой протокол для характеризующие модули Юнга изотропной линейной эластичной субстратов, обычно используется для mechanobiology исследования. Протокол состоит из подготовки субстрата мягкого силикона на Петри блюдо или жесткой силиконовые, покрытие верхней поверхности субстрата силикона с бусами Флюоресцентная, с помощью миллиметровой шкалы сферы для отступа верхней поверхности (по тяжести), визуализации люминесцентные Бусы на поверхности с отступом силикона с помощью микроскопа флуоресценции и анализ результирующего изображения для вычисления Юнга силиконовые подложки. Муфта верхней поверхности субстрата с белков внеклеточного матрикса модулей (кроме флуоресцентный бусины) позволяет силиконовые подложки легко использоваться для ячейки покрытия и последующие исследования, с помощью экспериментов микроскопии силы тяги. Использование жесткой силикона, вместо Петри блюдо, как основа мягкого силикона, позволяет использовать mechanobiology исследований с участием внешних стрейч. Конкретные преимуществом этого протокола является widefield флуоресцентным микроскопом, которая обычно доступна во многих лабораториях, основного оборудования, необходимого для выполнения этой процедуры. Мы демонстрируем это протокол путем измерения Юнга мягкого силикона субстратов различных упругих модулей.

Используя протокол, подробно говорилось выше, мы подготовили мягкого силикона в 35 мм Петри, вылечить при 70 ° C за 30 мин и сочетании флуоресцентные микрошарики (и коллаген я) к верхней поверхности как схематично изображены на рисунке 1. Глубокая УФ ране?...

Watch this Scientific Journal Video about Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope at JoVE.com

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Субстратов с жесткостью в диапазоне килопаскаль полезны для изучения реакции клеток физиологически соответствующей жесткости микро среды. Используя просто widefield флуоресцентным микроскопом, Юнга мягкие силиконовые гели могут быть определены с помощью отступов с подходящей сфере.

Жесткость измерения мягкого силикона субстратов для Mechanobiology исследований с использованием Widefield флуоресцентным микроскопом

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Замедленной флуоресценции от роста корней арабидопсиса с быстрой манипуляции Корень окружающей среды Использование RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Количественный оптическая микроскопия: Измерение Cellular биофизических Особенности с использованием стандартного оптического микроскопа

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Выделение первичных клеток человека Колон опухоль из хирургических тканей и культивирование их прямо на мягкий эластичный субстратов для тяговых цитометрии

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Простой основе полиакриламида многолуночные Жесткость Анализ по изучению жесткости зависимых клеточных ответов

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Композитные Леса межфазного полиэлектролитных волокон для временного Controlled Release биомолекул

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Расширение наноструктурированных подложках с использованием стежка Техника для Nanotopographical модуляции клеточной поведения

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Мягкие литографических процедура для производства пластиковых Microfluidic устройства с видом портами прозрачно для видимого и инфракрасного света

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...