Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

ومولت هذه البحوث "وزارة الدفاع الأمريكية" في شكل فكرة جائزة (W81XWH-13-1-0174)، وفقر الدم اللاتنسجي ومنحة من مؤسسة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، ومنحة أومرب للمؤلف م. م. أشكر جايسوال هامور وبهار سوبهراديب لاستنساخ الأولية من TET2 في ناقلات pDEST14.

1-الاستنساخ وتنقية ديوكسيجيناسي TET2 البشرية غير المميزة
<ol><li>استنساخ البشر TET2 ديوكسيجيناسي (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) إلى ناقل الوجهة pDEST14 استخدام تقنية جزئ الخاصة بالموقع كما هو موضح سابقا22. ملاحظة: قد أثبتت الدراسات السابقة أن المجال ديوكسيجيناسي (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) ج-محطة TET2 هو<sup class=...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain.">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development.">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li><li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development.">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li><li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids.">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

الطفرات في الجينات TET2 بعض التغييرات الوراثية المكتشفة الأكثر شيوعاً في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة المكونة للدم المتنوعة. حتى الآن مئات من الطفرات TET2 المختلفة، التي تشمل هراء وتحول الإطار والطفرات مغلطه، قد حددت في12من المرضى. المرضى الذين يعانون من الطفرات TET2</e...

موقف C5 قواعد السيتوزين داخل دينوكليوتيديس البد هو الموقع مثلايشن الغالبة في جينومات الثدييات1(5mCpG). وبالإضافة إلى ذلك، عدد من الدراسات التي أجريت مؤخرا كشفت C5 واسعة السيتوزين مثلايشن (5mC) في مواقع غير المعبأة (5mCpH، حيث ح = A, T, أو C)2،3. تعديل 5mC بمثابة كاتم الصوت النسخي على ريتروترانسبوسونس الذاتية والجينات المروجين3،،من45. مثلايشن الحمض النووي في 5mC كما تلعب أدواراً هامة في المنظمة كروموسوم إكس، طابعة الجينات، وإعادة برمجة النووي والجينات الخاصة بالانسجة التعبير5،،من67. مثلايشن سيتوزين في موقف C5 تضطلع ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي، والطفرات في هذه الإنزيمات تسبب عيوب إنمائية كبيرة8. تبدأ إزالة علامات 5mC TET1-3 5mC أوكسيداسيس،من910. تحويل هذه الأسرة تيت ديوكسيجيناسيس 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) عن طريق الأكسدة متسلسل الخطوات11،،من1213. وأخيراً، يستبدل ثيمين-DNA glycosylase إف سي 5 أو 5caC على السيتوزين غير معدلة باستخدام مسار إصلاح الختان القاعدة11.
واعتبرت TET2 الجينات البشرية كثيرا ما تحور جين في الأورام الخبيثة المكونة للدم المتنوعة بما في ذلك myelodysplastic المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين)14،،من1516، حركة الديمقراطيين الاشتراكيين myeloproliferative الأورام ( مدسمبن)، واللوكيميا النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) التي تنشأ من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، وحركة الديمقراطيين الاشتراكيين MPN16. مستويات تعديل 5hmC في نخاع العظام الحمض النووي أقل في المرضى مع الطفرات TET2 مقارنة بتلك التي مع نوع البرية (wt)-TET214. ووضعت عددا من المجموعات TET2-خروج المغلوب الماوس نماذج توضيح دورها في هيماتوبويسيس العادية وتحول النقوي17،18،،من1920. كانت هذه الفئران مع حدوث طفرات في الجين TET2 في البداية طبيعية وقابلة للاستمرار، ولكن تظهر الأورام الخبيثة المكونة للدم المختلفة كما أنها تتراوح أعمارهم في التسبب الوفاة المبكرة. وأظهرت هذه الدراسات الأدوار الهامة التي تقوم بها الوزن TET2 في تمايز المكونة للدم العادي. في هذه النماذج الماوس ومتخالف الخلايا الجذعية المكونة للدم (TET2+/- هسكس) متماثل TET2-/- قد هسكس ميزة تنافسية على هسكس TET2 وزن متماثل في إعادة إسكانها يكونوا الأنساب المكونة للدم ككل TET2+/- ووضع TET2-/- هسكس الأورام الخبيثة المكونة للدم متنوعة17،18. تبين هذه الدراسات أن هابلوينسوفيسينسي TET2 ديوكسيجيناسي يغير وضع هسكس والنتائج في الأورام الخبيثة المكونة للدم.
مشابهة للفئران مع الطفرات في الجينات TET2، معظم مرضى اللوكيميا المجاهرة هابلوينسوفيسينسي TET2 ديوكسيجيناسي النشاط. تشمل هذه الطفرات الجسدية معظمهم متخالف الطفرات تحول الإطار وهراء المنتشرة في جميع أنحاء الجسم الجينات TET2 بينما مغلطه الطفرات الأكثر متفاوت في المجال ديوكسيجيناسي12. حتى الآن، يقال توصيف قليلاً من TET2 wt والمسخ في الأدب أساسا بسبب صعوبات في إنتاج ديوكسيجيناسي TET2 وبه المقايسة21. هنا، نحن التقرير على تنقية خطوة واحدة بسيطة ديوكسيجيناسي TET2 الأصلية باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. علاوة على ذلك، كان مقايسة LC-MS/MS كمية الأمثل والمستخدمة لقياس النشاط الأنزيمي من الأم TET2 ديوكسيجيناسي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

تنظيم النسخ جينية توسط 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) لعبت دوراً حاسما في تنمية حقيقية النواة. يتم إنجاز demethylation هذه علامات جينية باكسدة متسلسلة بعشر-أحد عشر إزفاء ديوكسيجيناسيس (TET1-3)، تليها إصلاح الختان جليكوسيلاسي-تعتمد على قاعدة ثايمين-الحمض النووي. المنظمة الجينات TET2 بسبب الطفرات الوراثية أو عن طريق آليات جينية أخرى يقترن سوء تشخيص في المرضى الذين يعانون من سرطانات متنوعة، خصوصا من المكونة للدم الأورام الخبيثة. وهنا يصف لنا تنقية كفاءة خطوة واحدة من النشطة انزيماتيكالي ديوكسيجيناسي TET2 معلم البشرية باستخدام كروماتوغرافيا تبادل الأيونات الموجبة. كذلك نقدم نهجاً سائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) التي يمكن فصل وتحديد مقدار أربع قواعد الحمض النووي العادي (A و T، ز وج)، فضلا عن أربع قواعد السيتوزين المعدلة (5-ميثيل، 5-هيدروكسيميثيل، 5-فورميل، و 5-الكربوكسيل). يمكن استخدام هذا الفحص لتقييم نشاط نوع البرية والمسخ ديوكسيجيناسيس TET2.

التعديل الديناميكي ل 5mC في الحمض النووي من ديوكسيجيناسيس تيت-الأسرة تلعب أدواراً هامة في الأنظمة النسخي جينية. كثيرا ما يتم تحور ديوكسيجيناسي TET2 في الأورام الخبيثة المكونة للدم متنوعة12. للتحقيق في دور إنزيم TET2 في التطور الطبيعي والمرض، ونحن قد المستنسخة مجا...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

هنا، فإننا نقدم بروتوكول لتنقية خطوة واحدة بكفاءة الإنسان معلم نشط إزفاء عشر-11-2 (TET2) ديوكسيجيناسي 5-ميثيلسيتوسيني باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والتحليل استخدام كتلة سائل اللوني-جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS/MS)-النهج القائم.

تنقية فعالة والتنمية LC MS/MS-المستندة إلى تحليل لأحد عشر-عشرة إزفاء-2 5-ميثيلسيتوسيني ديوكسيجيناسي

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الوراثة اللاجينية وTET2 توسطت 5-Methylcytosine مجال إزالة الميثيل مثل هذا التحليل لنشاط الطفرات TET2 العادية والسريرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن TET2 الأصلي يمكن تنقيته في خطوة واحدة، ويمكن تحليل نشاطها من حيث تشكيل جميع المنتجات الثلاثة. العديد من طلاب الدراسات العليا سوف تظهر هذا الإجراء.سيتم إجراء تنقية البروتين من قبل تشايان بهاتاشاريا، مقايسة TET2 من قبل أنيندا سوندري داي، وتحليل LC-MS/MS من قبل نافيد أيون. للتحول البكتيري، إضافة ميكرولتر واحد من المؤتلف 14 متجه التعبير الوجهة التي تحتوي على tet2 ديوكسيجيناز الإنسان untagged إلى 100 ميكرولترات من الخلايا E.coli BL21 DE3 المختصة كيميائيا في أنبوب 1.7 ملليلتر. بعد حضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل، والحرارة صدمة الخليط في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في حمام مائي.مباشرة بعد الصدمة الحرارية، وضع الخلايا مرة أخرى على الجليد لمدة لا تقل عن دقيقتين. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولترات من مرق الأمثل السوبر مع القمع تقويض الخلايا. احتضان الخلايا البكتيرية لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في شاكر.بعد الحضانة، تدور أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي للأنبوب في 9، 000 مرة الجاذبية لمدة دقيقة واحدة. تجاهل 70٪ من عظمى عن طريق الأنابيب، وحل بيليه في وسائل الإعلام المتبقية. نشر تعليق الخلية على لوحة مرق ليروا أجار التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين.احتضان لوحة لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية. حدد مستعمرة واحدة معزولة، وتطعيمه في 10 ملليلتر من وسائط LB ampicillin. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في شاكر بين عشية وضحاها.بعد ذلك، استخدم 100 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية لتطعيم 100 ملليلتر من وسائل الإعلام LB ampicillin كثقافة أولية. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في شاكر بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تلقيح 15 قارورة، كل منها يحتوي على 600 ملليلتر من وسائل الإعلام LB أمبيسيلين مع ستة ملليلترات من الثقافة الأولية لكل قارورة.احتضان القارورة في 37 درجة مئوية على شاكر في 180 دورة في الدقيقة. للتحقق من كثافة الثقافة البكتيرية، وقياس كثافتها البصرية في 600 نانومتر، أو OD600، باستخدام مقياس الطيف. بعد الثقافة تصل إلى كثافة 0.8 في OD600، والحث على التعبير عن بروتين TET2 مع 300 ميكرولترات من IPTG الضرس واحد في كل قارورة، وتنمو الثقافة لمدة 16 ساعة إضافية في 17 درجة مئوية.بعد الحضانة، نقل الثقافة البكتيرية إلى زجاجات أجهزة الطرد المركزي. الطرد المركزي الثقافة البكتيرية التي تعبر عن إنزيم TET2 في 5، 250 مرة الجاذبية لمدة 45 دقيقة. استخدام بيليه البكتيرية لتنقية TET2.العمل على الجليد أو في أربع درجات مئوية، وإعادة تعليق بيليه البكتيريا في 100 ملليلتر من 50 ملليمولار MES العازلة، ودرجة الحرارة السادسة. ثم تأخذ خمسة ملليلتر من تعليق الخلية، وتقديمه إلى 45 ملليلتر مع المخزن المؤقت. Sonicate تعليق لمدة خمس مرات 30 ثانية في السلطة 20، مع فترات التبريد 60 ثانية.تدور في lysate في 5، 250 مرة الجاذبية لمدة 45 دقيقة. جمع supernatant التي تحتوي على إنزيم TET2 القابل للذوبان، وتمريره من خلال مرشحات 0.45 ميكرون قبل تحميلها على نظام FPLC. حزمة 30 ملليلتر من الراتنج تبادل الموجبة قوية في عمود FPLC.اكويبير العمود مع 10 وحدات تخزين السرير من مخزن الغسيل بمعدل تدفق ثابت من 0.3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة باستخدام نظام FPLC. تحميل lysate أوضح على العمود قبل التوازن، وغسل مع ما يقرب من 10 حجم السرير من مخزن الغسيل حتى يصبح تدفق من خلال واضحة. Elute TET2 باستخدام صفر إلى 10٪ التدرج من المخزن المؤقت لغسل إلى العازلة elution في 15 وحدة تخزين السرير، تليها عقد في 10٪ عازلة elution لكميات السرير اثنين.جمع 100 عينات microliter من الخلية lysate قبل وبعد تحميل العمود ، جنبا إلى جنب مع جميع الكسور elution ، وتحليل على 10 ٪ حل SDS - صفحة هلام. تجمع الكسور التي تحتوي على بروتين TET2، وتجميد وتجفيف البروتين. ثم قم بحل الإنزيم في 10 ملليلتر من الماء، وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.أداء جميع ردود الفعل demethylation في ثلاثية مع ثلاثة ميكروغرام من الركيزة. إضافة 100 ميكروغرام من تنقية إنزيم TET2 إلى 50 ميكرولترات من إجمالي التفاعل العازلة. بعد حضانة ساعة واحدة في 37 درجة، إخماد TET2 حفزت تفاعلات الأكسدة مع خمسة ميكرولترات من EDTA 500 ملليلتر.لإعداد العينات للتحليل، قم بفصل الحمض النووي عن خليط التفاعل TET2 عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من عازلة الربط الأولي إلى 55 ميكرولترات من التفاعل المطفأ. بعد ذلك، إضافة 400 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى الخليط. تمرير هذا الخليط من خلال عمود الربط أوليغو.بعد غسل الحمض النووي ملزمة مع 750 ميكرولترات من عازلة الغسيل، elute الحمض النووي في 20 ميكرولتر من الماء. الآن، هضم الحمض النووي المعزول مع وحدتين من DNase I و 60 وحدة من نواة S1 في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة لإنتاج أحادي الفوسفات أحادي الفوسفات النوي الفردية. بعد الهضم، إضافة وحدتين من العجل الفوشطة الفوسكاتي إلى العينات.احتضان لمدة 12 ساعة إضافة في 37 درجة مئوية لإزالة مجموعات الفوسفات المحطة الطرفية من أحادي الفوسفات النووي، والحصول على النيوكليوسيدات. إعداد محلول مخزون ميكرومولار 100 من جميع النيوكليوسيدات السيتوسين المعدلة، وقواعد الحمض النووي العادية في المياه HPLC الصف لتطوير طريقة LC-MS / MS. تحسين المعلمات MS/MS المعتمدة على النوى عن طريق غرس حلول المخزونات كل مرة في مطياف الكتلة بمعدل تدفق 10 ميكرولترات في الدقيقة في وضع المسح MS المحسن.يمكن تحسين العديد من المعلمات باستخدام ميزة التحسين الكمي الآلي للبرنامج لكل نوكليوسيد الحمض النووي. عند هذه النقطة، تحسين المعلمات المتبقية لكل نوكليوسيد الحمض النووي باستخدام ميزة التحسين الكمي اليدوي للبرنامج في وضع تحليل حقن التدفق. الآن، تحسين المعلمات MS/MS المعتمدة على المصدر عن طريق حقن 10 ميكرولترات من محلول الأسهم باستخدام تدرج مع 25٪ مذيب B بمعدل تدفق 0.3 ملليلتر في الدقيقة.لفصل جميع النيوكليوسيدات النووية الثمانية للحمض النووي، قم بإجراء كروماتوغرافيا سائلة كما هو مفصل في بروتوكول النص على عمود C18. وأخيراً، كشف وتحديد جميع النيوكليوسيدات باستخدام طريقة LC-MS/MS في المنحنيات القياسية. وبما أن المجال الحفاز لـ TET2 له نقطة إيزوكهربتريك عالية نسبياً بالمقارنة مع معظم بروتينات الإشريكية القولونية الأصلية، فقد تم تطوير عملية تنقية فعالة باستخدام التصوير اللوني لتبادل الالات.هذا التنقية أسفرت عن أكثر من 90٪ نقية TET2 انزيم في خطوة واحدة. من أجل فصل وتحديد المشتقات المختلفة ديوكسيسيتيدين وقواعد الحمض النووي الطبيعية الأربعة بعد رد فعل انزيمي TET2، تم تحسين مقايسة حساسة LC-MS/MS المستندة إلى. تم رسم المنحنيات القياسية باستخدام عمليات تخفيف متسلسلة لخليط يحتوي على جميع النيوكليوسيدات.تظهر هنا نتائج أسلوب الكروماتوغرافيا السائلة MS/MS. تسمح هذه الطريقة بالفصل وتحديد كمي قواعد الحمض النووي الأربعة العادية ، وكذلك قواعد السيتوسين الأربعة المعدلة. في هذا الإجراء التجريبي، نحن وصف استنساخ غير الموسومة الإنسان TET2 dioxynase المجال الحفاز باستخدام تقنية إعادة التركيب موقع محدد وتعبير كاف في متجه الوجهة في كولاي.نحن تنقية بكفاءة غير الموسومة TET2 انزيم استخدام تبادل اللوني الموجبة لتحقيق أكبر من 90٪ نقاء في خطوة واحدة. علاوة على ذلك، قمنا بتطوير طريقة كروماتوغرافية سائلة جديدة لفصل قواعد الحمض النووي الأربعة العادية وقواعد السيتوسين الأربعة المعدلة. لتحديد كمية النيوكليوسيدات الثمانية من التفاعلات المحفزة TET2 ، قمنا بالاقتران مع أسلوبنا اللوني السائل المحسن مع قياس الطيف الكتلي.ثم تم استخدام المقايسة الحساسة LC-MS/MS لتحديد نشاط إنزيم TET2 البشري غير المُعَد. النهج الموصوف هنا سيعزز إلى حد كبير من تقييم نوع البرية و متحولة TET2 الديوكسيجيناز.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

مقاربة سطحية وكفاءة لإنتاج المذيلات عكسية ثاني كبريتيد عبر ربط

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

الكالوري الضوئي التفاضلية - منهج في تقييم الثبات الحراري والتشكل من البروتين مستضد

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...