Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Denne forskning er finansieret af det amerikanske forsvarsministerium i form af en idé Award (W81XWH-13-1-0174), Aplastisk anæmi & MDS Foundation Grant, og UMRB tilskud til M.M. Authors takker Mohit Jaiswal og Subhradeep Bhar for oprindelige kloning på TET2 pDEST14 vektor.

1. kloning og rensning af ukodede menneskelige TET2 Dioxygenase
<ol><li>Klone humane TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) til den pDEST14 destination vektor ved hjælp af lokationsspecifikke rekombination teknik som tidligere beskrevet22. Bemærk: Tidligere undersøgelser har vist, at C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) domæne er minimal katalytisk aktive domæne21,23. For at udtrykke de ukodede TET2 d...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain.">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development.">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li><li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development.">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li><li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids.">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

Mutationer i TET2 genet er nogle af de hyppigst fundne genetiske forandringer hos patienter med forskellige hæmatopoietisk maligniteter. Til dato hundredvis af forskellige TET2 mutationer, som omfatter nonsens, ramme-Skift og missense mutationer, er blevet identificeret i patienter12. Patienter med TET2 mutationer viser lave niveauer af genomisk 5hmC i knoglemarven sammenlignet med dem med wt-TET214. Mutant TET2 knock-i eksperimenter har sammenfattet virk...

Cytosin baser i CpG dinucleotides C5 stilling er den fremherskende methylering site (5mCpG) i pattedyr genomer1. Derudover en række nylige undersøgelser har afsløret omfattende C5 cytosin methylering (5mC) i ikke-CpG websteder (5mCpH, hvor H = A, T, eller C)2,3. 5mC ændring fungerer som en transcriptional lyddæmper på endogene retrotransposons og gen initiativtagere3,4,5. DNA methylering på 5mC også spiller vigtige roller i X-kromosom Inaktiveringen, gen prægning, nukleare omprogrammering og væv-specifikke gen expression5,6,7. Methylering af cytosin startposition C5 er udført af DNA methyltransferases, og mutationer i disse enzymer forårsager betydelige udviklingsmæssige defekter8. Fjernelse af 5mC mærker er initieret af TET1-3 5mC oxidases9,10. Disse TET-familien dioxygenases konvertere 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) ved sekventiel oxidation trin11,12,13. Endelig, thymin-DNA glycosylase erstatter 5fC eller 5caC til umodificeret cytosin ved hjælp af base excision reparation vej11.
Det menneskelige TET2 gen var identificeret som en ofte muterede gen i forskellige hæmatopoietisk maligniteter herunder myelodysplastisk syndrom (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative neoplasmer ( MDS-MPN), og akut myeloid leukæmi (AML) med oprindelse fra MDS og MDS-MPN16. 5hmC ændring i knoglemarven DNA er lavere hos patienter med TET2 mutationer i forhold til dem med vildtype (wt)-TET214. En række grupper har udviklet TET2-knockout musemodeller for at belyse sin rolle i normal bloddannelsen og myeloide transformation17,18,19,20. Disse mus med mutationer i TET2 genet blev oprindeligt normale og levedygtig, men manifesterede forskelligartede hæmatopoietisk maligniteter, som de i alderen forårsager deres tidlige død. Disse undersøgelser viste den vigtige roller spilles af wt-TET2 i normale hæmatopoietisk differentiering. I disse musemodeller, heterozygous hæmatopoietisk stamceller (TET2+/- HSCs) og homozygote TET2- / - havde HSCs en konkurrencemæssig fordel over homozygot wt-TET2 HSCs i genopretning hæmatopoietisk lineages som begge TET2+/- og TET2- / - HSCs udviklet forskellige hæmatopoietisk maligniteter17,18. Disse undersøgelser viser, at haploinsufficiency af TET2 dioxygenase ændrer udviklingen af HSCs og resulterer i hæmatopoietisk maligniteter.
Svarende til mus med mutationer i TET2 genet, de fleste leukæmi patienter manifestere haploinsufficiency af TET2 dioxygenase aktivitet. Disse for det meste heterozygous somatiske mutationer omfatter ramme-Skift og nonsens mutationer spredt TET2 gen kroppen mens missense mutationer, der er mest grupperet i dioxygenase domæne12. Til dato, er lille karakterisering af wt - og mutant-TET2 rapporteret i litteraturen primært på grund af vanskeligheder med produktionen af TET2 dioxygenase og dens assay21. Her rapporterer vi en enkel trinvis rensning af indfødte TET2 dioxygenase ved hjælp af ionbyttende kromatografi. Desuden var en kvantitativ LC-MS/MS analyse optimeret og bruges til at måle den enzymatiske aktivitet af indfødte TET2 dioxygenase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

Forordningen epigenetiske transskription medieret af 5-methylcytosine (5mC) har spillet en afgørende rolle i eukaryote udvikling. Demetylering af disse epigenetiske mærker opnås ved sekventiel oxidation af ti-elleve translokation dioxygenases (TET1-3), efterfulgt af thymin-DNA glycosylase-afhængige base excision reparation. Inaktivering af TET2 gen som følge af genetiske mutationer eller af andre epigenetiske mekanismer er forbundet med en dårlig prognose hos patienter med forskellige former for kræft, især hæmatopoietisk maligniteter. Her beskriver vi en effektiv enkelt trin rensning af enzymaktive ukodede menneskelige TET2 dioxygenase ved hjælp af kationbytter kromatografi. Vi giver yderligere en liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) tilgang, der kan adskille og kvantificere de fire normale DNA-baser (A, T, G og C), samt de fire ændrede cytosin baser (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, og 5-carboxyl). Denne analyse kan anvendes til at evaluere aktiviteterne vildtype og mutant TET2 dioxygenases.

Dynamisk ændring af 5mC i DNA af TET-familien dioxygenases spiller vigtige roller i epigenetiske transcriptional forordninger. TET2 dioxygenase er ofte muteret i forskellige hæmatopoietisk maligniteter12. For at undersøge rollen, som TET2 enzymet i normal udvikling og sygdom, har vi klonet sit minimal katalytisk aktive domæne uden nogen affinitet tag i pDEST14 vektor22. De ukodede TET2 dioxygenase blev produceret på ∼5% af den samlede...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Vi præsenterer her, en protokol for en effektiv enkelt trin rensning af den aktive ukodede menneskelige ti-elleve omplantning-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase ved hjælp af ion-udveksling kromatografi og sin analyse ved hjælp af en liquid chromatography-tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS)-baseret tilgang.

Effektiv rensning og LC-MS/MS-baseret analyse udvikling for ti-elleve omplantning-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i epigenetik og TET2 medieret 5-Methylcytosin demethylering felt sådan en analyse af aktiviteten af normale og kliniske TET2 mutationer. Den største fordel ved denne teknik er, at indfødte TET2 kan renses i et enkelt trin, og dens aktivitet kan analyseres i form af dannelse af alle tre produkter. Flere kandidatstuderende vil demonstrere proceduren.Proteinrensningen vil blive udført af Chayan Bhattacharya, TET2-analysen af Aninda Sundary Dey og LC-MS/MS-analysen fra Navid Ayon. Til bakterietransformation tilsættes en mikroliter rekombinant pDEST 14 destinationsudtryksvektor, der indeholder ukodet human TET2 dioxygenase til 100 mikroliter kemisk kompetente E.coli BL21 DE3-celler i et 1,7 milliliterrør. Efter inkubation på is i mindst 15 minutter, varme stød blandingen ved 42 grader Celsius i 30 sekunder i et vandbad.Umiddelbart efter varmestødet skal cellerne sættes tilbage på is i mindst to minutter. Efter dette, tilføje 250 mikroliter af super optimal bouillon med katabolit undertrykkelse til celler. Inkuber bakteriecellerne i en time ved 37 grader Celsius i en shaker.Efter inkubation, spin ned cellerne ved centrifugering røret på 9, 000 gange tyngdekraften i et minut. 70 % af supernatanten kasseres ved pipettering, og pellets opløses i de resterende medier. Spred cellesuspensionen på en Lirua bouillon agar plade, der indeholder 100 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkuber pladen i 16 timer ved 37 grader Celsius. Vælg en isoleret koloni, og inokuler det i 10 milliliter LB ampicillin medier. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i en shaker natten over.Derefter skal du bruge 100 mikroliter af bakteriekultur til at vaccinere 100 milliliter LB ampicillin media som en primær kultur. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i en shaker natten over. Den næste dag, inokuler 15 kolber, der hver indeholder 600 milliliter LB ampicillin media med seks milliliter primær kultur pr kolbe.Kolber ne kumes ved 37 grader Celsius på en ryster ved 180 omdr./min. For at kontrollere masseheden af bakteriekulturen, måle dens optiske tæthed ved 600 nanometer, eller OD600, ved hjælp af et spektrofotometer. Når kulturen når en massetæthed på 0,8 ved OD600, fremkalde udtrykket af TET2 protein med 300 mikroliter af en molar IPTG i hver kolbe, og dyrke kulturen i yderligere 16 timer ved 17 grader Celsius.Efter inkubation, overføre bakteriekultur til centrifuge flasker. Centrifuge den bakterielle kultur udtrykker TET2 enzym på 5, 250 gange tyngdekraften i 45 minutter. Brug bakteriepille til TET2 rensning.Arbejder på is eller ved fire grader Celsius, re-suspendere bakteriel pellet i 100 milliliter 50-millimolar MES buffer, pH seks. Derefter tage fem milliliter af cellen suspension, og bringe det til 45 milliliter med bufferen. Sonikere suspensionen i fem gange 30 sekunder ved effekt 20 med 60 sekunders køleintervaller.Drej lysatet ved 5, 250 gange tyngdekraften i 45 minutter. Indsaml supernatanten, der indeholder det opløselige TET2-enzym, og før det gennemsendes 0,45 mikronfiltre, før det indlæses på et FPLC-system. Pak 30 milliliter en stærk kationbytte harpiks i en FPLC kolonne.Ligevægt kolonnen med 10 sengevolumener af vaskebuffer ved konstant strømningshastighed på 0,3 milliliter i minuttet ved hjælp af et FPLC-system. Den afklarede lysat på den præ-ligevægtede søjle aflægges, og vaskes med ca. 10 sengevolumener af vaskepude, indtil gennemstrømningen bliver klar. Elute TET2 bruger en nul til 10%gradient fra vaskebufferen til elution bufferen i 15 sengevolumener efterfulgt af en hold ved 10% elution buffer for to sengevolumener.Indsamle 100 mikroliter prøver af celle lysate før og efter kolonne belastning, sammen med alle de elution fraktioner, og analysere på 10% løse SDS-PAGE gel. Pool de fraktioner, der indeholder TET2 protein, og fryse-tør proteinet. Derefter opløses enzymet i 10 milliliter vand, og opbevares på minus 80 grader Celsius.Udfør alle demethylationsreaktioner i tre eksemplarer med tre mikrogram substrat. Der tilsættes 100 mikrogram renset TET2-enzym til 50 mikroliter af den samlede reaktionsbuffer. Efter en times inkubation ved 37 grader, slukke TET2 katalyseret oxidation reaktioner med fem mikroliter af 500-millimolar EDTA.For at forberede prøver til analyse adskilles DNA'et fra TET2-reaktionsblandingen ved først at tilsætte 100 mikroliter Oligo-bindingsbuffer til 55 mikroliter af slukket reaktion. Derefter tilsættes 400 mikroliter af 100% ethanol til blandingen. Før denne blanding gennem en Oligo bindende kolonne.Efter vask af det bundne DNA med 750 mikroliter af vaskepude, eluter DNA i 20 mikroliter vand. Nu fordøje den isolerede DNA med to enheder af DNase I og 60 enheder af S1 nuklease ved 37 grader Celsius i 12 timer til at producere individuelle nukleosid monophosphates. Efter fordøjelsen tilsættes to enheder kalvealkalisk fosfatase til prøverne.Inkuber i yderligere 12 timer ved 37 grader Celsius for at fjerne de terminale fosfatgrupper fra nukleosidmonophosphates og opnå nukleosiderne. Forbered en 100-mikromolar lageropløsning af alle de modificerede cytosinkerner, og de normale DNA-baser i HPLC-grade vand til udvikling af LC-MS /MS-metoden. Optimer de nukleosidafhængige MS/MS-parametre ved at tilføre lagerløsninger én ad gangen i massespektrometeret med en strømningshastighed på 10 mikroliter pr. minut i forbedret MS-scanningstilstand.Flere parametre kan optimeres ved hjælp af den automatiserede kvantitative optimeringsfunktion af softwaren for hver DNA nukleosid. På dette tidspunkt skal du optimere de resterende parametre for hver DNA-nukleosid ved hjælp af softwarens manuelle kvantitative optimeringsfunktion i flowindsprøjtningsanalysetilstand. Optimer nu kildeafhængige MS/MS-parametre ved at indsprøjte 10 mikroliter stockopløsning ved hjælp af et forløb med 25 % opløsningsmiddel B ved en strømningshastighed på 0,3 milliliter pr. minut.For at adskille alle otte DNA-nukleosider skal du udføre flydende kromatografi som beskrevet i tekstprotokollen på en C18-kolonne. Endelig skal alle nukleosider opdages og kvantificeres ved hjælp af LC-MS/MS-metoden i standardkurver. Da det katalytiske domæne TET2 har et relativt højt isoelektrisk punkt sammenlignet med de fleste indfødte E.coli proteiner, blev der udviklet en effektiv rensningsproces ved hjælp af en kationudvekslingskromatografi.Denne rensning gav større end 90% ren TET2 enzym i et enkelt trin. For at adskille og kvantificere forskellige deoxycytidinderivater og de fire naturlige DNA-baser efter TET2 enzymatisk reaktion blev en følsom LC-MS/MS-baseret analyse optimeret. Standardkurver blev tegnet ved hjælp af serielle fortyndinger af en blanding, der indeholder alle nukleosider.Resultaterne af den flydende kromatografi MS/MS-metode vises her. Metoden giver mulighed for adskillelse og kvantificering af de fire normale DNA-baser, samt de fire modificerede cytosin baser. I denne eksperimentelle procedure beskriver vi kloning af umærket humant TET2 dioxynase katalytisk domæne ved hjælp af stedsspecifik rekombinationsteknik og et tilstrækkeligt udtryk i en destinationsvektor i E.Coli.Vi effektivt renset untagged TET2 enzym udnytte kation udveksling kromatografi til at give mere end 90% renhed i et enkelt trin. Desuden har vi udviklet en ny flydende kromatografi metode til at adskille de fire normale DNA-baser og de fire modificerede cytosin baser. For at kvantificere de otte nukleosider fra TET2 katalyserede reaktioner har vi koblet vores forbedrede flydende kromatografimetode sammen med tandemmassespektrometri.Den følsomme LC-MS/MS-analyse blev derefter anvendt til at bestemme aktiviteten af rekombinant umærket humant TET2-enzym. Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, vil i høj grad øge værdiansættelsen af vildtype og mutant TET2 dioxygenase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilgang til fremkaldelse af reversibel disulfid Cross-forbundne Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differentialscanningskalometri - en metode til vurdering den termiske stabilitet og Kropsbygning af protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Udtryk og rensning af nuklease-fri oxygen Scavenger Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosidekstraktion, rensning og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Oprensning af endogene drosophila transiente receptorpotentialekanaler

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...